Article de méthode

Révéler le contrôle électromécanique de l’homéostasie tissulaire à l’aide d’un dispositif microfluidique à deux couches

DOI :

10.3791/68894

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19 septembre 2025

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1School of Life Sciences, Westlake University, 2Mechanobiology Institute, National University of Singapore, 3Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 4Research Center for Industries of the Future, Westlake University

Dans cet article

Résumé

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Ici, nous présentons un protocole pour fabriquer un dispositif microfluidique unique à deux couches pour étudier la régulation électromécanique de l’homéostasie du tissu épithélial. L’appareil applique des courants électriques physiologiques statiques perpendiculaires au plan tissulaire, ce qui a un impact sur l’adhésion, la prolifération et l’extrusion entre les cellules. L’imagerie de cellules vivantes et les mesures de contraintes mécaniques révèlent les mécanismes de ces processus.

Résumé

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Le comportement et le destin des cellules sont influencés par des courants ou des champs électriques endogènes ou appliqués de l’extérieur. Des signaux électriques statiques peuvent être appliqués dans des dispositifs microfluidiques personnalisés pour imiter l’environnement électrique dans des processus physiologiques lents tels que le développement, la cicatrisation des plaies et l’homéostasie. Une classe importante d’études électriques cellulaires est le contrôle de la migration cellulaire par des courants galvaniques statiques dans le plan dans des canaux microfluidiques simples imitant les courants enroulés, avec des densités de courant de ~0,1-1000 A/m2. Cependant, en raison d’une géométrie incompatible, ces dispositifs ne sont pas appropriés pour étudier les effets électriques dans l’homéostasie tissulaire, où les cellules adoptent une polarité apico-basale et une différence de potentiel transépithéliale (TEPD). Ici, nous détaillons un dispositif microfluidique unique qui applique des courants ioniques physiologiques perpendiculaires au plan des couches cellulaires épithéliales confluentes pour perturber le TEPD et étudier la régulation électrique des états stationnaires tissulaires. L’installation est fabriquée à partir d’un polymère à deux couches durcissable aux UV noyé dans un substrat de gel de polyacrylamide souple recouvert d’une protéine à matrice extracellulaire de votre choix. Ce dispositif microfluidique fournit la géométrie correcte et le substrat perméable pour induire un courant ionique relativement uniforme à travers les couches cellulaires à l’échelle centimétrique. Le dispositif est compatible avec l’imagerie confocale de cellules vivantes et la microscopie à force de traction pour déduire les contraintes mécaniques induites par les courants transépithéliaux. Il est frappant de constater que la prolifération, l’extrusion et la migration des cellules sont collectivement influencées au sein de l’épithélium confluent en fonction de la direction du courant ionique, induisant un nouvel état tissulaire caractérisé par différentes forces d’interaction cellule-cellule, des événements cellulaires (mort et prolifération) et des structures tissulaires. Les comportements cellulaires contrôlés électriquement peuvent être compris comme une contrainte mécanique induite électriquement et une réponse cellulaire. Ce nouveau dispositif et protocole microfluidique fournit l’outil et la documentation nécessaires aux communautés de la mécanobiologie et de la bio-ingénierie pour étudier les effets électriques dans l’homéostasie tissulaire et développer de nouvelles applications d’ingénierie tissulaire.

Introduction

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Les signaux bioélectriques sont des facteurs biophysiques importants qui contribuent à régir le comportement cellulaire. L’exemple le plus célèbre est le potentiel d’action des neurones et des cellules cardiaques, qui transmettent des signaux électriques sur de longues distances (jusqu’à un mètre) et à des fréquences élevées (jusqu’à des centaines de Hertz)1. Les impulsions électriques appliquées avec des électrodes peuvent être utilisées pour stimuler l’activation du potentiel d’action et sont utiles dans la recherche et les applications médicales2. Les signaux bioélectriques endogènes dans les processus physiologiques lents tels que le développement, la cicatrisation des plaies et l’homéostasie 3,4,5,6,7,8 ont également été mesurés 9,10 sur des périodes de quelques heures à quelques jours. Un exemple important est celui des couches épithéliales confluentes qui maintiennent activement une différence de potentiel transépithéliale (TEPD) allant de quelques millivolts àdes dizaines de millivolts 4,11. Une coupure ou une blessure dans ces couches confluentes génère un courant de court-circuit, entraîné par l’activité électrique du tissu12,13. Des courants enroulés allant jusqu’à des dizaines de μA/cm2 et des champs électriques allant jusqu’à des centaines de mV/mm ont été signalés avec différentes techniques. Des études suggèrent que ces signaux électriques produisent un signal directionnel permettant aux cellules de migrer vers les sites de plaie ou d’infection, ce qui est important pourle processus de guérison. En général, les signaux électriques statiques (ou à variation lente) et à variation rapide sont importants et déclenchent différentes réponses cellulaires ou tissulaires.

Dans le domaine des signaux à variation lente, un phénomène important est le processus de migration électrique appelé « galvanotaxie ». Des courants galvaniques contrôlés dans le plan peuvent être appliqués dans des dispositifs microfluidiques avec des canaux simples pour imiter les courants enroulés pendant que la migration cellulaire est étudiée en fonction de la densité de courant15,16. Des champs électriques de 0,1 à 1000 V/m (densité de courant correspondante de 0,1 à 1000 A/m2) entraînent la migration cellulaire dans de nombreux types de cellules dans ce cadre in vitro 17, tandis que les voies de signalisation canoniques à la chimiotaxie (migration cellulaire guidée par des gradients chimiques), telles que PI3K, ont été impliquées dans la galvanotaxie 7,18. Des dispositifs microfluidiques « dépouillés » pour l’étude de la galvanotaxie peuvent être fabriqués avec des techniques standard de lithographie douce et de microfabrication19. Ces dispositifs comprennent généralement un substrat de polydiméthylsiloxane (PDMS) monocanal lié à une lame de verre (section transversale du canal : centaines de micromètres, longueur : centimètres). Les électrodes utilisées pour fournir le courant statique sont installées loin de la région de la cellule et connectées avec ou sans ponts salins. La connexion du pont salin peut être réalisée par des trous perforés à travers le substrat PDMS, des connecteurs microfluidiques et des tubes remplis de gélose. La simple lame de verre (généralement de 170 m d’épaisseur) sous le canal permet également l’imagerie à haute résolution des cellules vivantes pendant les expériences de galvanotaxie, ce qui est une caractéristique cruciale pour l’étude du processus.

Le rôle des signaux électriques endogènes dans le maintien de l’homéostasie tissulaire est beaucoup moins compris que celui de la cicatrisation des plaies. Une raison importante est le manque d’outils appropriés pour étudier ces effets dans les tissus intacts. Le dispositif microfluidique pour galvanotaxie n’est pas adapté à cet usage en raison de sa géométrie, qui ne prend en charge que les courants électriques dans le plan. Dans le contexte de l’homéostasie épithéliale, un nouveau dispositif est nécessaire pour contrôler et perturber le TEPD ou les courants hors plan à travers une couche épithéliale confluente. Pour atteindre l’objectif d’appliquer une densité de courant ionique relativement uniforme à travers une monocouche, nous avons conçu et fabriqué un dispositif microfluidique avec des innovations dans la géométrie du dispositif, l’utilisation des matériaux et les capacités de mesure biomécanique in situ 4. Cette dernière capacité est importante car les effets électriques peuvent affecter le comportement cellulaire par couplage avec les voies de biomécanique et de mécanobiologie, qui peuvent être étudiées avec cette caractéristique.

Ce nouvel appareil présente de multiples caractéristiques innovantes. Il est conçu avec deux couches au lieu du canal unique que l’on trouve dans les dispositifs galvanotaxis (innovation en géométrie), tout en gardant la connexion aux chambres d’électrodes similaire à celle de ces derniers. La première couche microfluidique comporte des canaux pour diriger les courants ioniques vers (ou loin) de la région tissulaire, tandis que la deuxième couche a une ouverture qui dirigera ce courant perpendiculairement à travers l’épithélium situé au-dessus de cette deuxième couche microfluidique (Figure 1A,B). Les techniques de microfabrication sont utilisées pour produire des couches suffisamment minces pour que l’imagerie confocale à haute résolution soit possible malgré l’empilement de couches microfluidiques qui augmente l’épaisseur de l’échantillon. Pour les autres innovations importantes, un hydrogel synthétique en polyacrylamide (PA) est incorporé au milieu de l’appareil, ce qui joue un rôle crucial (Figure 1A,B). Les propriétés physico-chimiques de ce gel, telles que la chimie disponible pour enrober les protéines de la matrice extracellulaire, la perméabilité aux ions, ainsi que l’élasticité connue, sont respectivement essentielles pour la fixation et la croissance cellulaires, l’application de courants hors plan et la mesure de la contrainte mécanique20 lors de la stimulation électrique. Des structures barrières sont incorporées dans la couche 1 de la région tissulaire pour le confinement de la solution de précurseur de gel PA, comme cela a été fait dans les dispositifs microfluidiques précédents21 (Figure 1A,B). Enfin, comme la polymérisation du gel PA est inhibée par l’oxygène sur les surfaces PDMS perméables à l’oxygène gazeux, un autre matériau22 est utilisé pour la fabrication du dispositif, ce qui peut permettre la polymérisation et la liaison étroite du gel PA. Toutes les fonctionnalités innovantes sont cruciales pour que le nouvel appareil fonctionne.

Globalement, l’étude approfondie des signaux bioélectriques statiques ou à variation lente dans l’homéostasie de tissus intacts est rendue possible grâce à ce nouveau dispositif dont le protocole sera détaillé ci-dessous. Le protocole et les résultats mentionnés ici sont axés sur la lignée cellulaire épithéliale Madin Darby Canine Kidney II (MDCK II), y compris les événements cellulaires (prolifération, mort, extrusion et migration) et les changements structurels tissulaires induits par le courant électrique. Ces études sont également instructives pour les chercheurs qui souhaitent appliquer cette technique à l’étude de la régulation électrique du transport épithélial et de l’induction d’événements cellulaires et des changements de destin cellulaire dans les couches cellulaires et les systèmes plus complexes, tels que les cellules primaires et les organoïdes 2D.

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Protocole

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REMARQUE : Ce protocole fournit des étapes pour construire un dispositif qui applique des courants électriques statiques et perturbe le TEPD des épithéliums confluents et pour étudier ses effets à l’aide de techniques d’imagerie de cellules vivantes et de mécanobiologie (Figure 1). L’installation se compose de dispositifs constitués de puces microfluidiques liées à des cartouches, d’inserts et de supports pour loger plusieurs dispositifs pour des expériences multiplexées sur un microscope, une paire de chambres d’électrodes connectées à un compteur de source et à des dispositifs, et un couvercle de chambre de cellule vivante pour le maintien de conditions appropriées de cellule vivante (Figure 1C). Les principes de conception et les dessins du fichier CAO de la cartouche et d’autres composants importants de la configuration se trouvent dans le fichier supplémentaire 1. Les étapes comprennent : 1) la lithographie douce PDMS ; 2) Fabrication de puces et assemblage de dispositifs ; 3) Achèvement de la configuration ; et 4) la croissance monocouche et les expériences sur cellules vivantes. Des informations détaillées concernant les réactifs et les matériaux utilisés dans ce protocole sont fournies dans la table des matériaux.

1. Lithographie douce PDMS

REMARQUE : Cette section détaille la production d’élastomères PDMS à partir de plaquettes SU-8 (Figure 2A, B) pour mouler des couches adhésives durcissables aux UV de la puce microfluidique.

  1. Lithographie douce PDMS
    1. Fabriquer une plaquette distincte à base de SU-8 pour chaque couche microfluidique, couches 1 et 2, à l’aide de techniques de photolithographie (Fichier supplémentaire 2 et Fichier supplémentaire 3).
      REMARQUE : La fabrication de plaquettes peut prendre un mois si une demande est envoyée à une installation de microfabrication/salle blanche. La technique de gravure au silicium pour la fabrication de plaquettes peut également être utilisée.
    2. Silaniser la plaquette de silicium pour permettre le démoulage PDMS19.
      1. Nettoyez la plaquette à l’aide d’une soufflette à air comprimé d’azote. Activer la surface de la plaquette en appliquant un processus de plasma d’oxygène court (30 s, 30 W dans un flux de gaz de 20 sccm O2 à une pression de réacteur de 1 à 3 mbar)23.
      2. Pipette de 200 μL de Tridécafluoro-1,1,2,2-tétrahydrooctyl-1-trichlorosilane dans un capuchon en plastique propre (diamètre 60 mm, hauteur 15 mm). Placez le capuchon à côté de la plaquette dans le dessiccateur sous vide (uniquement pour la silanisation). Allumez la pompe à vide et attendez 1 à 2 h, pendant que le silane vaporisé se dépose en monocouche sur la plaquette de silicium.
        ATTENTION : Le silane est corrosif et toxique. Portez des gants et des lunettes de sécurité, et utilisez une hotte pour assurer un fonctionnement en toute sécurité.
        REMARQUE : Une plaquette nouvellement silanisée peut être utilisée pour fabriquer 10 à 20 pièces de moules PDMS. Le temps de vide dépend de l’état de la pompe à vide. Une silanisation excessive provoque une épaisseur inégale et donne un aspect trouble, ce qui est à éviter. Conservez la plaquette dans des chambres à humidité contrôlée lorsqu’elle n’est pas utilisée. Les structures PDMS fabriquées à partir de nouvelles plaquettes peuvent être vérifiées à l’aide de la microscopie électronique à balayage (MEB).
    3. Mélangez soigneusement une quantité suffisante de résine PDMS de base et d’agent de réticulation (l :l = 10:1, et 70-80 g) pendant quelques minutes dans une boîte de Pétri (diamètre 150 mm, hauteur 25 mm). Assurez-vous que de petites bulles se forment uniformément dans le mélange, ce qui confirme un bon mélange. Transvasez le mélange dans des tubes à centrifuger de 50 mL et centrifugez-le à 550 x g pendant 3 min pour éliminer complètement les bulles d’air.
      REMARQUE : Le liquide PDMS est collant et difficile à nettoyer ; Soyez prudent lorsque vous versez. Nettoyez avec de l’isopropanol si les surfaces de la paillasse sont contaminées par un mélange PDMS renversé.
    4. Versez délicatement le mélange PDMS sur la plaquette dans un plat en plastique ou en verre (diamètre 150 mm, hauteur 25 mm) à fond plat, puis appuyez sur la plaquette pour purger le PDMS du bas de la plaquette. Dégazer le mélange à l’aide d’une pompe à vide.
      REMARQUE : La purge du PDMS liquide du bas de la plaquette est importante ; une épaisse couche de PDMS au fond rend difficile le retrait de la plaquette de la parabole en plastique, ce qui augmente la probabilité que la plaquette se brise. Alternativement, on peut couper le PDMS le long du bord de la plaquette et garder la plaquette dans la boîte de Pétri. Assurez-vous que l’épaisseur du PDMS est d’environ 1,5 mm pour la couche 1 afin d’assurer la flexibilité du moule dans les étapes de fabrication ultérieures. Assurez-vous que l’épaisseur du PDMS est d’environ 2,5 mm pour la couche 2 afin de réduire la probabilité d’affaissement lors des étapes de fabrication ultérieures. L’épaisseur du PDMS est mesurée à l’aide d’une règle après que les moules PDMS aient été découpés dans les formes nécessaires.
    5. Faites durcir le PDMS dans un four à 80 °C pendant 2 h et assurez-vous que le plat est placé aussi horizontalement que possible pendant le processus. Laissez le moule et la gaufrette PDMS refroidir à température ambiante. Retirez soigneusement le moule PDMS dans son intégralité de la plaquette à l’aide d’une lame chirurgicale tranchante et d’une pince à épiler rembourrée.
      REMARQUE : Veillez à ne pas rayer la surface de la plaquette. Vérifiez si des restes de PDMS se forment à la surface de la plaquette lorsque le PDMS est décollé. Cela indique que la surface de la plaquette doit être resilanisée.
    6. Découpez le moule PDMS en blocs contenant les caractéristiques d’intérêt et stockez ces blocs dans des boîtes de Pétri propres (diamètre 150 mm, hauteur 25 mm) ou une chambre à vide lorsqu’elles ne sont pas utilisées. Manipulez le moule PDMS sans toucher aux caractéristiques essentielles.

2. Fabrication de puces et assemblage de dispositifs

REMARQUE : Utilisez un polymère à faible viscosité et durcissable aux UV (plage d’absorption UV maximale de 350 à 380 nm) pour fabriquer la puce microfluidique par moulage PDMS. L’adhésif durcissable aux UV permet l’intégration de l’hydrogel de polyacrylamide (PA) en tant que substrat cellulaire transparent, perméable aux ions et élastique. Les propriétés du gel PA en font un capteur de stress mécanique tissulaire qui permet l’imagerie de cellules vivantes et la stimulation par courant statique. La puce sera enfin attachée à une cartouche qui abrite le milieu de culture et se connecte aux chambres d’électrodes.

  1. Préparation de la base de lamelle en verre
    1. Marquez la quantité requise de lamelles en verre rectangulaires (170 μm) à l’aide d’une fraise diamantée jusqu’à ce qu’elle soit de 37 × 24 mm2, pour s’adapter aux dimensions de la cartouche (Fichier supplémentaire 4).
      REMARQUE : La lamelle a une épaisseur de 170 μm compatible avec l’imagerie haute résolution, mais elle est fragile et nécessite une manipulation soigneuse. Portez des gants et des lunettes de protection. Jetez immédiatement les lamelles en verre rectangulaire si des fissures visibles apparaissent, car les éclats de ces lamelles en verre rectangulaires peuvent présenter un risque de fuite. Vous pouvez également commander des lamelles de la bonne taille auprès des fabricants de lamelles. Évitez de toucher les surfaces des lamelles en verre rectangulaires à mains nues et laissez des taches qui peuvent détériorer la qualité de l’image.
    2. Placez les lamelles rectangulaires dans une boîte de Pétri propre sans les chevaucher et transférez-les dans une chambre à plasma. Induisez une condition de vide, mais laissez entrer un peu d’air à la fin. Activation des surfaces des lamelles de verre rectangulaires à l’aide d’un plasma d’air (30 s à 5 min, 29,6 W, selon l’état de l’équipement)
      REMARQUE : Seuls les côtés entièrement exposés au plasma (c’est-à-dire les surfaces supérieures) doivent être utilisés dans l’étape suivante (étape 2.1.3). Terminer l’étape 2.1.3 dans les 30 minutes suivant l’exposition au plasma. La chambre devrait apparaître en rose-violet à ce stade si du plasma d’air a été généré. Si les dernières étapes de collage réussissent, réduisez la durée du plasma pour plus de commodité.
    3. Préparez 10 ml de solution de traitement de surface composée à 0,3 % d’acide acétique et de méthacrylate de 3-(triméthoxysilyl)propyle à 0,5 % dissous dans de l’éthanol à 100 %. Traiter les lamelles rectangulaires en verre avec cette solution dans une boîte de Pétri (diamètre 150 mm, hauteur 25 mm) pendant 5 min sur un agitateur, pour permettre une bonne adhérence avec des couches microfluidiques à base d’adhésif durcissables aux UV. Assurez-vous que les lamelles en verre rectangulaires sont complètement immergées dans la solution et que les deux côtés sont traités.
      ATTENTION : La solution de traitement de surface est corrosive. Manipulez-le dans une hotte.
    4. Rincez trois fois les lamelles rectangulaires en verre avec de l’éthanol à 100 %, sans les laisser sécher pendant le processus. Séchez les lamelles rectangulaires en verre une à une avec de l’azote gazeux et une soufflette. Assurez-vous d’un taux de soufflage suffisant qui élimine proprement les gouttelettes de liquide des surfaces de base de la lamelle, évitant ainsi les taches de liquide. Conservez les lamelles rectangulaires en verre dans une boîte de Pétri propre (diamètre 150 mm, hauteur 25 mm).
      REMARQUE : Utilisez une sarbacane pour diriger le flux d’air parallèlement aux bases des lamelles et évitez d’utiliser un taux de soufflage excessif pour éviter que les verres ne se brisent.
  2. Fabrication de la couche 1 (Figure 2C)
    1. Placez et aplatissez un moule PDMS de couche 1 propre, face vers le haut, sur un capuchon de plat en plastique propre (diamètre 60 mm, hauteur 15 mm). Pipette 500 μL d’adhésif liquide durcissable aux UV sur le moule lentement, en mouillant soigneusement toutes les structures saillantes à l’aide d’une spatule. Éliminez les bulles d’air dues au processus de mouillage.
      REMARQUE : Des moules PDMS propres peuvent être préparés à l’aide de ruban adhésif pour enlever la poussière ou les restes d’adhésif durcissables aux UV, ou en nettoyant avec de l’éthanol. Pour plus de précaution, conservez les moules PDMS dans des chambres à vide lorsqu’ils ne sont pas utilisés.
    2. Appuyez doucement sur la lamelle sur le moule PDMS. Empêchez l’excès d’adhésif durcissable aux UV de mouiller la face supérieure de la lamelle, car les restes d’adhésif durcissables aux UV peuvent empêcher une lamelle propre et plate. Enlevez l’excès d’adhésif durcissable aux UV à l’aide d’essuie-glaces de laboratoire.
      REMARQUE : Il est essentiel de s’assurer que les caractéristiques du moule PDMS transférées sur la couche adhésive durcissable aux UV s’aligneront avec la cartouche à laquelle il sera collé. Pour ce faire, marquez la lamelle avec un marqueur soluble à l’endroit où se situeront les centres des puits de cartouche (trois d’entre eux). Utilisez ces marques pour aligner la lamelle avec les caractéristiques du moule PDMS lorsque vous appuyez sur la lamelle en verre rectangulaire vers le bas.
    3. Polymérisation partielle de la structure sous une lumière UV uniformément éclairée (363-370 nm, 224 mW/cm2) pendant 10 s. Essuyez les marques avec de l’éthanol à 75 % plus tard. Tenez fermement la structure sur une surface plane et décollez lentement le moule PDMS de couche 1.
      REMARQUE : Le durcissement partiel permet la formation d’une couche adhésive suffisamment solide et durcissable aux UV, permettant le décollement du moule PDMS à ce stade. Cela facilite également le collage avec une couche 2 partiellement durcie dans les étapes ultérieures pour la fabrication d’une structure adhésive à deux couches durcissable aux UV. Le moule PDMS de couche 1, qui a été préparé avec une épaisseur de 1,5 mm (étape 1.2.4), assure une flexibilité PDMS suffisante qui réduit la probabilité que la lamelle mince se brise pendant le processus d’épluchage. Le moule PDMS peut être réutilisé jusqu’à dix à vingt fois, après quoi il peut y avoir une couche blanchâtre de restes d’adhésif durcissables aux UV sur la surface du PDMS, réduisant ainsi l’épaisseur de la structure. Utilisez de nouveaux moules PDMS dans ce cas.
  3. Fabrication de la couche 2 (Figure 2D)
    1. Placez un moule PDMS de couche 2 propre, face vers le bas, sur une dalle PDMS plate (épaisseur de la dalle de > 2,5 mm pour assurer une grande rigidité). Tapotez doucement les fonctions par le haut à l’aide d’une pince à épiler. Observez l’interface pour l’assombrissement ou le contraste optique sous les caractéristiques - cela indique un bon contact.
      REMARQUE : Les piliers de support entourant les caractéristiques principales (deux ouvertures rondes et une fente) sont cruciaux pour empêcher la surface du moule PDMS de s’affaisser.
    2. Remplissez l’espace entre le moule PDMS et la dalle avec un adhésif liquide durcissable aux UV par effet capillaire. Durcissement partiel de la structure sous la lumière UV (363-370 nm, 224 mW/cm2) pendant 10 s.
    3. Décollez délicatement la couche adhésive composite durcissable aux UV et le moule PDMS de la dalle PDMS à l’aide d’une pince à épiler rembourrée douce. Coupez les bords en excès de la couche adhésive durcissable aux UV avec une paire de ciseaux tranchants si nécessaire.
  4. Collage des couches 1 et 2 (Figure 2E)
    1. Placez la couche 1 fixée à une lamelle en verre rectangulaire sur une surface plane. Alignez la couche 2 (toujours attachée à son moule PDMS) avec la couche 1 et appuyez fermement sur les deux couches, en veillant à ce que des « ombres » apparaissent sous les entités.
    2. Durcissez la structure sous lumière UV (363-370 nm, 224 mW/cm²) pendant 10 s pour coller les couches 1 et 2, qui forment la structure à deux couches de la puce microfluidique. Décollez délicatement le moule PDMS de la puce.
      REMARQUE : Pour assurer le décollement réussi du moule PDMS de la puce, utilisez une pince à épiler pour séparer chaque pilier de support PDMS de la couche adhésive 2 durcissable aux UV à l’étape 2.4.1. Cette action permet de réduire l’adhérence globale entre le moule PDMS et la couche 2, ce qui est important pour le pelage.
  5. Intégration du gel de polyacrylamide (Figure 2F)
    REMARQUE : Avant cette section, préparez autant de puces que nécessaire pour une expérience multiplexée.
    1. Préparez la solution de précurseur de gel de PA en mélangeant délicatement les ingrédients du tableau ci-dessous, correspondant à la rigidité du gel de PA de choix24 (voir le tableau 1). Veillez à ne pas introduire de bulles d’air pendant le pipetage car l’oxygène inhibe la gélification.
      ATTENTION : TEMED et APS sont toxiques. Travaillez dans une hotte et portez des gants.
      REMARQUE : Un pipetage et une manipulation soigneux sont nécessaires car de petits volumes de liquides sont impliqués (1 μL TEMED pour 1 mL de solution de précurseur de gel PA). La rigidité du gel peut influencer le comportement cellulaire, comme le montrent de nombreuses études de mécanobiologie. Choisissez la rigidité la plus appropriée pour vos expériences. Les billes fluorescentes servent de marqueurs repères pour la déformation du gel et l’inférence de contrainte mécanique. Vortex avant de pipeter la solution dans la solution de précurseur de gel PA. Il est recommandé de ne pas mélanger le petit volume TEMED en dernier, car les solutions de précurseurs de gel PA commencent à gélifier lorsque les deux initiateurs sont ajoutés et les petits volumes sont difficiles à mélanger complètement pendant ce court laps de temps.
    2. Pipeter immédiatement 10 μL de la solution de précurseur de gel PA au milieu de la région tissulaire et au-dessus de la fente de la couche 2 (Fig. 1B, 2F). Appuyez doucement avec une lamelle ronde en verre (diamètre 10 mm) pour former un gel plat. Observez la solution de PA s’écouler dans la couche 1 à travers la fente et arrêtez-vous à la rangée de piliers de barrière.
      REMARQUE : Le volume de 10 μL de solution de précurseur de gel PA produit un gel de 100 μm d’épaisseur au-dessus de la couche 2. Modifiez ce volume en fonction de l’épaisseur du gel requise. Pipetez la solution sur la puce dès que possible, car la solution PA commence à polymériser une fois que les initiateurs sont ajoutés. Appuyez sur la solution avec la bonne force pour éviter que la solution ne déborde sur les piliers de la barrière et ne bloque le canal. Jetez la puce si les canaux sont bloqués. Pour les gélules molles d’une rigidité de 5 kPa ou moins, utilisez un hydrofuge en verre pour traiter les lamelles rondes en verre afin de les rendre hydrophobes. En particulier, plongez les lamelles dans un verre hydrofuge pendant 5 min, rincez 3 fois avec de l’éthanol à 100 % et séchez-les à l’azote gazeux. Cela facilite le décollement ultérieur de la lamelle du gel polymérisé sans détruire le gel.
    3. Durcir immédiatement la puce microfluidique sous lumière UV (363-370 nm, 224 mW/cm2) pendant 5 min. Attendez au moins ~1 h pour que le gel PA se solidifie complètement.
      REMARQUE : Cela durcira complètement la puce tout en permettant au gel PA polymérisé de se lier à la structure. Les étapes 2.5.1, 2.5.2 et 2.5.3 doivent être complétées rapidement.
    4. Incuber complètement la puce dans HEPES (0,1 M, pH 7,4) pendant au moins 1 h ou plus pour mouiller le gel et desserrer l’adhérence entre la lamelle et le gel. Retirez délicatement la vitre de protection à l’aide d’une pince à épiler pointue.
      REMARQUE : Pour les gels plus mous avec une rigidité de 5 kPa ou moins, augmentez la période d’incubation jusqu’à 10 h sur un agitateur pour assurer un retrait propre du verre de couverture du gel sans perturber la structure du gel. Parfois, des motifs structurels de plusieurs dizaines et centaines de micromètres peuvent se former entre la base rectangulaire de la lamelle et la couche 1 à base d’adhésif durcissable aux UV. Ces motifs peuvent interférer avec l’imagerie en fond clair, mais ont des effets minimes sur l’imagerie par fluorescence. Cela peut être amélioré par l’activation plasma de lamelles rectangulaires comme à l’étape 2.1.2.
  6. Collage de la puce et de la cartouche (Figure 2F)
    1. Placez une cartouche en polycarbonate de qualité médicale nettoyée (fichier supplémentaire 4) sur une surface plane, le bas vers le haut. Séchez le gel sur la puce avec des lingettes de laboratoire sur le côté. Alignez la puce, face vers le bas, avec la cartouche.
      REMARQUE : Lors du test de nouveaux modèles de cartouches, on peut utiliser des méthodes d’usinage ou d’impression 3D. Lorsque la conception est définie, on peut utiliser le moulage par injection pour produire de grandes quantités de cartouche.
    2. Pipetez un adhésif durcissable aux UV dans les crevasses entre la puce et la cartouche, qui seront remplies par effet capillaire. Durcissement à la lumière UV (363-370 nm, 224 mW/cm2) pendant 5 min.
      REMARQUE : Veillez à ce que l’adhésif durcissable aux UV ne déborde dans les canaux ou de l’autre côté de la base de la lamelle.
  7. Élimination d’une solution de PA non polymérisé
    1. À l’aide d’un bouchon PDMS et d’une seringue, aspirer environ 5 mL de HEPES (0,1 M, pH 7,4) à travers les canaux d’élimination des déchets afin d’évacuer la solution de gel précurseur de PA non polymérisée qui est toxique pour les cellules.
    2. Incuber le gel dans l’appareil avec 2 mL de HEPES (0,1 M, pH 7,4) par appareil, et le mettre sur un agitateur pendant 1 à 2 jours, pour assurer l’élimination complète de la solution de précurseur de gel de PA non polymérisée.

3. Fin de la configuration

REMARQUE : Une fois les dispositifs fabriqués, terminez la configuration (Figure 1C) en enrobant le gel PA de protéine ECM pour l’ensemencement cellulaire, en connectant les dispositifs à la chambre d’électrode pour la stimulation électrique et en plaçant les dispositifs dans des inserts, des supports et un couvercle de chambre de cellules vivantes pour des expériences d’imagerie de cellules vivantes multiplexées.

  1. Préparation des composants stérilisés
    1. Tous les composants de l’installation autres que l’appareil (table des matériaux) doivent être soniqués dans l’ordre suivant : d’abord dans de l’eau savonneuse pendant 30 min, puis dans de l’eau MQ pendant 30 min, et enfin dans de l’éthanol à 75 % pendant 30 min. Après cela, séchez-les dans un four à 60 °C et traitez-les avec une lumière UV à 200-280 nm dans une enceinte de biosécurité pendant 30 min pour obtenir la stérilisation.
  2. Fonctionnalisation d’un gel PA avec protéine ECM
    1. Stérilisez les dispositifs à l’aide d’une lumière UV (200-280 nm) dans une enceinte de biosécurité.
    2. Préparez la quantité requise de 50 μg/mL de solution de travail de collagène I dans 1x DPBS sur de la glace.
      REMARQUE : Conservez le stock de collagène I sur de la glace pour éviter la gélification. 100 à 150 μL de solution de travail de collagène I sont nécessaires pour que chaque appareil puisse immerger complètement le gel. Pipetez doucement les solutions de collagène I pour éviter la formation de fibres.
    3. Préparez la quantité requise de solution de travail Sulfo-SANPAH (SS) sur de la glace. Chaque traitement sur gel nécessite environ 80 μL de solution de travail en SS, où 2 μL de solution mère de SS (dissoute dans du DMSO anhydre) sont dilués dans 80 μL d’HEPES froid (à partir d’un réfrigérateur à 4 °C, 0,1 M, pH 7,4).
      REMARQUE : L’acier inoxydable est sensible à l’humidité ; Évitez la condensation d’humidité sur le produit en équilibrant les flacons de stock à la température ambiante avant de les ouvrir. Utilisez l’acier inoxydable sans pesée pour de meilleures performances et préparez les stocks dans du DMSO anhydre. Utilisez-le dès que possible. Un tampon HEPES froid est utilisé pour réduire le taux d’hydrolyse des MES en préparation de la solution de travail des ÉS. Chaque gel nécessite deux traitements avec la solution de travail SS pour s’assurer que la surface du gel PA sera bien fonctionnalisée.
    4. Séchez le gel dans l’appareil en tapotant avec des lingettes de laboratoire sur les bords du gel. Pipeter 80 μL de solution de travail en acier inoxydable sur le gel, en veillant à ce que la surface du gel soit complètement immergée dans la solution en acier inoxydable. Traitez le gel avec des UV (363-370 nm, 24,5 mW/cm2) pendant 5 min pour activer le SS. Rincez 3 fois avec HEPES froid (0,1 M, pH 7,4).
      REMARQUE : Pipetez soigneusement l’acier inoxydable au milieu du puits de la cartouche pour éviter que l’acier inoxydable ne soit attiré par la paroi.
    5. Répétez l’étape 3.2.4, mais rincez trois fois avec du froid 1x DPBS à la fin.
      REMARQUE : Les étapes 3.2.3 à 3.2.5 doivent être effectuées rapidement pour éviter l’hydrolyse des MES. Le gel rincé doit apparaître d’un rouge plus foncé à ce stade si l’activation de surface par le SS est réussie.
    6. Pipeter 100 μL de solution de collagène I sur du gel PA, en veillant à immerger complètement le gel. Incuber à température ambiante pendant 1 h, puis rincer trois fois le collagène non attaché avec 1x DPBS. Immergez le gel dans 1x DPBS avant utilisation.
      REMARQUE : L’échantillon enrobé de collagène I peut être conservé dans un réfrigérateur à 4 °C pendant quelques jours.
  3. Connexion d’appareils à des chambres d’électrodes
    1. Fixez les appareils aux inserts à l’aide de vis (Figure 1C, type de vis : M3 X 10 mm). Ensuite, fixez jusqu’à quatre ensembles d’inserts de dispositif sur le support conçu pour être monté sur une platine de microscope (type de vis : M3 X 5 mm).
      REMARQUE : Si le nombre maximum d’inserts n’est pas utilisé, il est recommandé de remplir tous les autres emplacements de support avec des dispositifs vides pour sceller l’espace afin que de bonnes conditions de cellules vivantes puissent être préservées pour les expériences d’imagerie ultérieures. Les appareils vides peuvent simplement être fabriqués en collant des cartouches sur des lamelles en verre rectangulaires nues.
    2. Remplissez les dispositifs avec du milieu de culture (DMEM++, 2 mL dans chacun des puits principaux). Tirez ensuite 2 ml de fluide à travers les canaux d’évacuation des déchets pour rincer et remplacer le 1x DPBS.
    3. Préparez deux tubes de 50 mL avec des bouchons qui ont des trous traversants pour fonctionner comme des chambres d’électrodes. Créez des trous de taille et de quantité appropriées pour s’adapter solidement aux électrodes en platine et aux tubes Tygon, en reliant les chambres d’électrodes aux appareils. Remplissez chaque chambre d’électrode avec 45 ml de milieu de culture.
      REMARQUE : Des trous peuvent être facilement créés sur les capuchons à l’aide de lames chirurgicales tranchantes.
    4. Préparez la connexion entre les chambres d’électrodes et les appareils : Fixez deux connecteurs de tube à chaque appareil. Insérez un clip de tube sur chaque tube Tygon (Figure 1C). Tirez le milieu de culture à travers les tubes à l’aide d’une seringue et fixez-les fermement. Connectez une extrémité du tube rempli de fluide à la chambre d’électrode et l’autre à l’appareil.
      REMARQUE : Réduisez la probabilité d’émergence de bulles dans les tubes en utilisant un fluide préchauffé et/ou en dégazant le milieu dans une chambre à vide. Empêchez la formation de bulles d’air à l’interface entre le tube Tygon et le connecteur du tube, pincez les extrémités du tube pour gonfler la surface du support avant de l’immerger dans le fluide dans le tube, ou effectuez une fixation physique aux connecteurs du tube.
    5. Ajustez les hauteurs relatives entre les surfaces du milieu de culture dans les appareils et les chambres d’électrodes à l’aide d’une prise de laboratoire. Relâchez les clips de tube et laissez toutes les surfaces moyennes s’équilibrer à la même hauteur.
      REMARQUE : N’oubliez pas de fixer les clips de tube chaque fois que l’ensemble de la configuration est déplacé pour éviter le débordement de liquides.
    6. Effectuez le contrôle de la qualité en mesurant la résistance de chaque appareil séparément à l’aide d’un compteur de source électrique.
      REMARQUE : Assurez-vous de ne libérer que le clip de tube de l’appareil pour lequel la résistance est mesurée, tout en gardant les clips des autres appareils connectés en parallèle solidement fixés.

4. Croissance monocouche et expériences sur cellules vivantes

REMARQUE : Pour former une monocouche confluente appropriée et obtenir une densité de courant électrique uniformément distribuée qui dépend de la confluence et de la résistance électrique de la monocouche. Ensuite, assurez-vous que les conditions de cellules vivantes sont appropriées sur un microscope pour des expériences d’imagerie et de stimulation électrique à long terme.

  1. Croissance monocouche
    1. Détachez les cellules MDCK à l’aide de la trypsine des flacons T25. Centrifugez et comptez le volume moyen nécessaire pour obtenir 0,1 million de cellules. Suspendez ce nombre de cellules et mélangez-les bien dans un milieu de 2 mL dans des tubes à centrifuger.
    2. Pipetez tout le milieu chargé de cellules dans le puits sur la région tissulaire. Laissez les cellules sédimenter pendant 15 minutes avant de transférer lentement l’ensemble dans un incubateur de culture tissulaire.
      REMARQUE : Pour chaque appareil, une densité d’ensemencement de 0,1 million de cellules correspond à 0,06 million de cellules par centimètre carré (6 × 104 cellules/cm2). Cette densité d’ensemencement est suffisamment clairsemée, et les cellules se développent pendant 2 jours avant d’atteindre un état confluent. Ce processus garantit une monocouche correctement polarisée et homogène, sans qu’il soit nécessaire de rincer les cellules détachées excessives qui risquent de perturber les tissus. Il est important de laisser l’étape de sédimentation intacte afin qu’il y ait un ensemencement uniforme des cellules.
    3. Laisser les cellules croître dans l’incubateur (37 °C, 5 % CO2, 90 % d’humidité) pendant 72 h pour atteindre une densité cellulaire de >~50 cellules/100 μm2. Vérifiez quotidiennement sur un microscope de paillasse, avec contraste de phase, pour surveiller le processus de croissance.
      REMARQUE : Avec ce nombre de cellules ensemencées, les cellules MDCK auront atteint une confluence de 70 % à 80 % après 24 h, une confluence complète après 48 h, et une augmentation supplémentaire de la densité cellulaire et de la maturation tissulaire jusqu’à 72 h. Après 24 h, la longueur moyenne des cellules est d’environ 10 à 20 μm. À 48 h, les jonctions cellule-cellule et le corps cellulaire présentent un contraste clair sous imagerie à contraste de phase. Ce contraste diminue drastiquement après 72 h.
  2. Imagerie de cellules vivantes
    1. Choisissez un microscope à épifluorescence ou un microscope confocal en fonction des besoins expérimentaux. Lorsque les cellules expriment ou sont colorées avec des marqueurs fluorescents, choisissez confocal pour l’observation tridimensionnelle de la forme cellulaire et des déformations du substrat de gel. Pour l’observation bidimensionnelle, choisissez le contraste de phase et l’épifluorescence, qui produisent moins de phototoxicité. Allumez le système de cellules vivantes 1 h avant d’amener l’installation au microscope, ce qui permet à l’incubateur de la platine du microscope de se stabiliser à 37 °C, 5 % de CO2 et 90 % d’humidité.
      REMARQUE : Le contrôleur du système de cellules vivantes indique les conditions dans l’incubateur sur scène et émet un avertissement lorsque les conditions ne sont pas optimales. Étant donné que le couvercle de l’incubateur sur la scène est différent du couvercle commercial en raison de la nécessité d’accueillir des tubes de dispositif qui s’étendent vers l’extérieur, le système doit être recalibré pour garantir de bonnes conditions de cellules vivantes pour des expériences de longue durée (de quelques jours à une semaine). L’étalonnage peut être effectué sur la base du manuel d’utilisation, et les positions des capteurs doivent être maintenues de la même manière dans les expériences que dans les conditions d’étalonnage. Vérifiez le taux d’évaporation du milieu dans l’incubateur sur scène et les conditions de pH avec un milieu infusé de rouge de phénol.
    2. Montez l’installation sur le microscope, avec les chambres d’électrodes sur les côtés. Assurez-vous que la platine électronique du microscope dispose d’un espace suffisant pour bouger et ne pas se cogner contre les chambres d’électrodes. Assurez-vous que les hauteurs de surface moyennes sont équilibrées et à la même hauteur entre celles des appareils et des chambres d’électrodes.
      REMARQUE : La surface moyenne dans les puits de l’appareil, où se trouve la région tissulaire (Figure 1C), a un impact significatif sur l’imagerie en fond clair et en contraste de phase. Le ménisque provoquera une focalisation indésirable de la lumière. Assurez-vous que la surface du fluide est plane au bord du puits, mais notez que l’évaporation du fluide dans la chambre de la cellule vivante entraînera la distorsion de cette surface plane après un certain temps. Pour surmonter ce problème, une solution consiste à placer une lamelle en verre plat en contact avec la surface du support pour aplatir cette surface. Cette lamelle doit avoir une zone plus petite que le puits afin de ne pas obstruer les échanges gazeux, ce qui est important pour la croissance cellulaire. Une autre option consiste à superposer de l’huile minérale de qualité culture cellulaire sur le milieu.
    3. Configurez le logiciel.
      1. Choisissez des objectifs 10x ou 20x pour l’imagerie des tissus entiers avec un microscope à épifluorescence, et des objectifs 30x (WD 0,8 mm, NA 1,05) pour une imagerie confocale à plus haute résolution.
      2. Pour l’imagerie des tissus entiers, choisissez plusieurs positions pour couvrir la zone rectangulaire dans la région tissulaire (figure 1A, par exemple, 5 rangées sur 5 colonnes, la rangée du milieu couvrant la fente, tandis que les autres à l’extérieur de la fente). Choisissez les canaux fluorescent et en fond clair en fonction des lignées cellulaires utilisées dans la partie résultat (canal 488 pour la fluorescence verte et canal 561 pour la fluorescence rouge). Choisissez un intervalle de temps de 1 h pour réduire la phototoxicité dans cette expérience d’imagerie à long terme jusqu’à quelques jours.
        REMARQUE : D’autres objectifs lents, tels que 4x, peuvent être choisis si une vue plus grande de l’ensemble du tissu est nécessaire.
  3. Stimulation électrique
    1. Vérifiez le nombre d’appareils, la résistance relative de l’appareil et le courant électrique cible de chaque appareil. Décidez du courant électrique total à fournir pendant quelques heures à une semaine dans la configuration globale.
    2. Source un signal électrique en mode pince de courant. Pour 3 appareils avec la même résistance de canal, avec un groupe de contrôle (pas de courant électrique, clip de tube fixé), une condition de courant apical-basal (AtB) et une condition de courant basal-apical (BtA) (Figure 1D), fournissez un courant total de 20 μA avec un sourcemètre. Cela conduit à 10 μA fournis pour chaque appareil avec une densité de courant estimée ~10 μA/cm2 qui est physiologiquement pertinente (plus de détails en discussion).
      REMARQUE : La tension totale est d’environ quelques dizaines de millivolts, en fonction de la longueur du tube Tygon. Un tel courant électrique peut être fourni en continu pendant quelques jours à une semaine. L’indicateur rouge phénol changera de couleur dans les chambres d’électrodes (plus acide dans la chambre avec l’électrode positive), mais pas dans l’incubateur de scène, qui est bien calibré. Les cellules resteront saines tant que les conditions des cellules vivantes sont bien maintenues. Les chercheurs peuvent changer le milieu dans l’incubateur sur le dessus de la scène une fois tous les deux jours, et le milieu dans les chambres d’électrodes une fois tous les quelques jours. Fixez les clips de tube lors de la commutation des chambres d’électrodes pour éviter le débordement de fluide. Comme mentionné à l’étape 3.1.1, n’oubliez pas d’avoir un appareil vide pour couvrir l’espace du support. Cela permet de s’assurer que la chambre des cellules vivantes est dans le bon état.

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Résultats

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Tous les résultats présentés ici sont adaptés de la publication précédente4 ; Pour plus de détails, consultez cette publication.

Ce protocole permet l’application d’un courant ionique externe ou d’un champ électrique perpendiculaire au plan des cellules ou des tissus. Cette stimulation électrique perturbe la différence de potentiel électrique transépithéliale (TEPD) endogène et permet d’étudier le rôle de la TEPD dans la régulation du comportement tissulaire. Conforméme...

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Discussion

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Ce protocole fournit des étapes détaillées et une logique de conception pour fabriquer un nouveau dispositif microfluidique afin d’effectuer des expériences de perturbation du potentiel électrique transépithélial et d’étudier les effets bioélectriques à l’aide de méthodes d’imagerie et de mécanobiologie de cellules vivantes. L’importance de cette méthode est évidente lorsqu’on la compare à d’autres méthodes connexes. Par exemple, une méthode connexe utilise une simple puce microfluidique...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Assurez-vous que tous les auteurs ont divulgué tout conflit d’intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

XJ, PX, FF et TBS reconnaissent les discussions utiles avec le Dr Xumei Gao, Xinru Yu et d’autres membres du groupe du Laboratoire de biophysique tissulaire. Nous remercions le Customized Technology Service Facility (CTSF) de l’Université Westlake de nous avoir aidés avec notre dessin schématique. Ce travail a été soutenu par la Westlake Education Foundation, le Westlake Laboratory of Life Sciences and Biomedicine et le Research Center for Industries of the Future (RCIF) de l’Université Westlake.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1x DPBSGibco14190144
Méthacrylate de 3-(triméthoxysilyl)propyle, MPTSigma2530850Conserver sous azote après ouverture.
Tube Falcon de 50 mLCorning430829Percez 4 trous dans le capuchon du tube Falcon de 50 ml, pour permettre au passage de l’électrode et du tube à travers le capuchon et à l’immersion dans le fluide. Pour un ensemble de dispositifs microfluidiques, au moins 2 capuchons sont nécessaires.
Acide acétiqueSinopharm10000208
Solution d’acrylamide, 40 %Sigma79061Toxique
Machine pneumatiqueLaboratoire OKOOKO-APComposant de l’incubateur de microscope
Persulfate d’ammonium, APSAladinA112447
Cartouche--La cartouche est fabriquée sur mesure et la conception fait référence à un matériau supplémentaire. La matière première est PC Makrolon 2858 Medical Grade, et ici vous pouvez trouver plus de détails : https://solutions.covestro.com/zh/products/makrolon/2858_000000000000508397?SelectedCountry=US
Clips--Robert Clip, pour tubing  ; de diamètre extérieur 4,5 mm. https://item.taobao.com/item.htm?id=18717491819&pisk=gAsj0ailDjcjqv-tCE2rVYReT5-1h8rFWA9OKOnqBnKv6A1RBjpxDchRepvBWczD0Ft1wQS2gt-v6c1NQi5NBGJOfnjPucR4ih6OThNUTkrFntYBXWPETzI4tHpikchwH3nJbds8Mz2dntxMXYlT8aBmCOO1qfp968tJCdc9XKnte89wBdK9MFh-ypdJXhdvkYpJBpn9HCnYF3pDKKhv6qK-edJXXCC9X86JZdt96bH_3dwJgtw2FbzzkyxCHQitXiEMlB_i7ci1TKLfXtd5zaSWhEOpWac1uiCPBiSDrzgJjT7C1NCLaqRARp1W8ZNIc61DB6tV4jeJXFQP8E_7McOP0dTpXUMtXTtPPFsWvkhWEaBVWifjCcpc0M86tUwtjF-RYeQdGA2henpOsejatmAAB9jh8HZjtK_Rd3syxDRBL50sFem6FBy7FV0GhSGPYc782SYvEK__F8GxLEpkFBy7FV0MkLvf18wSMv5..&spm=a21xtw.29978518.0.0&skuId=3344063585144
Collagène ICorning354236
Eau DI Milli-QMilli-Q-
Milieu de culture Dulbecco’s Modified Eagle’s, DMEM (high glucose)Gibco11965092DMEM++ est DMEM avec 10 % supplémentaires  ; FBS (Sigma-Aldrich) et 100&thinsp ; unités/mL de pénicilline-streptomycine (Gibco).
Boîtier cage noireLaboratoire OKON° H201Composant de l’incubateur de microscope
Microscope inversé Epi-FluoresenceOlympeIX83
Éthanol absoluSinopharm10009218
Sérum fœtal bovinSigmaRéf. F8318
Perles fluorescentes, 0,1 &mu ; L, rouge (580/605)ThermoF8801
Chambre à gazLaboratoire OKOH201-PRIOR-SP200/400/600Composant de l’incubateur de microscope
Mélangeur manuel à gazLaboratoire OKOMÉLANGEUR 2GFComposant de l’incubateur de microscope
GénétiqueGibco10131027GFP&ndash ; actine et H1&ndash ; GFP MDCK ont été maintenus à l’aide de milieux complétés par 0,5&thinsp ; mg/mL de génétique (Gibco) pour soutenir l’expression de leurs gènes
HEPESSigma736459
IsopropanolSinopharm80109218
Lingettes KimwipesKimberly-Clark ProfessionnelleLH-70155Essuie-glace de laboratoire
Vis plus longue--Vis à métaux cruciforme de précision à tête ronde nickelée, M3 x 10 mm. https://item.taobao.com/item.htm?id=604899872494&pisk=gbX7s64OI40STNJKAQqqhx58y8d9NoyapDtdjMHrvLpJOvIP5HkeT7xIdEsTqUP3Zw1fJZAyyeRedH_wogkUqgrQdMI9yp5yzHQVRZcPz98FuJsG5QkPv9oliNStUTPkLv9kKpUa7RyZqgvHpfPM7c0okhx_LYdKpLvx7Uiz6RyNqiiy2lSYQ9Sp5stS9vQpwIpvqEhKe3QpMKKBkYKKeH3YcEYv24HKwxnvvh0K9wKdDnKkV03KeBKYHhYvJppdJiEXYELK1OzXm7TRVu-iUlqUdgsJlvHdeJAv5LhELvJw2Q6d2EsV0ttWNFRjAbyCeZSdUTA09X9h01_C9NUqaUC6fZONNPM55axdAHQ7IcTAFM6XZsoZBisfv1Rf3leMFLLRTLjEfzSfFaSlhMoKML9PGC6WBR0J8sS1dH63--_1vGfpG9g54UMw5pb-OMiidnTacoGntEWrjhPgtYw2wnxVQoZjPXAJmn1UcoGntQKDm2rbc4Gh.&spm=tbpc.boughtlist.suborder_itemtitle.1.494a2e8d0lg31n
Connecteur microfluidique--Raccord union droit en polypropylène, 1/16"-10-32UNF. https://item.taobao.com/item.htm?abbucket=16&detail_redpacket_pop=true&id=555839592609<k2=1752310108435i7ldxj7ekdgu9qhnphlmj&ns=1&priceTId=2150470617523101021033708e1a4b&query=10-32unf%E8%9E%BA%E7%BA%B9%E7%9B%B4%E9%80%9A%E6%8E%A5%E5%A4%B4%20%E5%A1%91%E6%96%99%E5%A4%96%E8%9E%BA%E7%BA%B9%E6%8E%A5%E5%A4%B4&skuId=3600497427939&spm=a21n57.1.hoverItem.1&utparam=%7B%22aplus_abtest%22%3A%2245243a364caf5527e8392ded0656451a%22%7D&xxc=taobaoSearch
Support de plaques multipuitsLaboratoire OKOH201-MW-HOLDER-NZ500Composant de l’incubateur de microscope
N',N'-méthylènebisacrylamide, 2 %Sigma110269Toxique
NOA 73Produits Norland17-345Adhésif durcissable aux UV
Pénicilline-streptomycine, PS (10 000 U/mL)Gibco15140122
Boîte de Pétri (150 mm & aiguë ; 25 mm)Corning430599Résiste à au moins 80 ° ; C pendant 2 h
Outil Pico PlasmaDiener Electronic GmbH + Co. KGPico PlasmaPour le traitement au plasma O2
Nettoyeur plasmaHarrick PlasmaPDC-002Pour le traitement au plasma d’air
Plat en plastique (diamètre 60 mm, hauteur 15 mm)Nid705001
Électrodes en platineTianjin Aida HengshengRéf. Pt005Diamètre 0,5 mm, longueur 37 mm  ;
Rain-X Original Verre hydrofugeProduits chimiques ITW800002242
Lamelle rectangulaireMarienfeld0107222  ; 1,5 H, 24 et aiguë ; 50 mm2, 170 &mu ; m d’épaisseur
Lamelle ronde en verreMarienfeld0111500  ; 1,5H, rond 10 mm de diamètre
Vis plus courte--Vis à métaux de précision cruciforme à tête ronde nickelée, M3 x 4 mm. https://item.taobao.com/item.htm?id=604899872494&pisk=gbX7s64OI40STNJKAQqqhx58y8d9NoyapDtdjMHrvLpJOvIP5HkeT7xIdEsTqUP3Zw1fJZAyyeRedH_wogkUqgrQdMI9yp5yzHQVRZcPz98FuJsG5QkPv9oliNStUTPkLv9kKpUa7RyZqgvHpfPM7c0okhx_LYdKpLvx7Uiz6RyNqiiy2lSYQ9Sp5stS9vQpwIpvqEhKe3QpMKKBkYKKeH3YcEYv24HKwxnvvh0K9wKdDnKkV03KeBKYHhYvJppdJiEXYELK1OzXm7TRVu-iUlqUdgsJlvHdeJAv5LhELvJw2Q6d2EsV0ttWNFRjAbyCeZSdUTA09X9h01_C9NUqaUC6fZONNPM55axdAHQ7IcTAFM6XZsoZBisfv1Rf3leMFLLRTLjEfzSfFaSlhMoKML9PGC6WBR0J8sS1dH63--_1vGfpG9g54UMw5pb-OMiidnTacoGntEWrjhPgtYw2wnxVQoZjPXAJmn1UcoGntQKDm2rbc4Gh.&spm=tbpc.boughtlist.suborder_itemtitle.1.494a2e8d0lg31n
Sulfo-SANPAH, sans poidsThermoRéférence A35395Solution mère de SS : 20 mg/mL dans du DMSO anhydre, 2 &mu ; L pour chacun ; Solution de travail en acier inoxydable : 0,5 mg/mL de MES dans HEPES (0,1 M, pH 7,4).
SYLGARD 184 Kit d’élastomère de siliconeDow CorningH052KCM147Le produit final est le polydiméthylsiloxane, PDMS. Ce kit comprend de la résine PDMS de base et un agent de réticulation.
Unité de températureLaboratoire OKOH201-T-UNIT-BLComposant de l’incubateur de microscope
Tétraméthyléthylènediamine, TEMEDSigma110189Toxique
Affichage à écran tactileLaboratoire OKOOKO-TOUCHComposant de l’incubateur de microscope
Tridécafluoro-1,1,2,2-tétrahydrooctyl-1-trichlorosilaneSigma78560459
Trypsine-EDTA (0,25 %)gibco25200072
Tubes TygonTygonAJK00002Diamètre extérieur (OD) = 3,2 mm, Diamètre intérieur (ID) = 1,6 mm
Nettoyeur à ultrasonsSupmileKD-300DE
Machine de polymérisation LED UVGHUVGHS-MFLGSource lumineuse UV-LED, portée d’émission : 363&ndash ; 370 nm, densité de puissance maxsium : 230 mW/cm2
Module d’humidification sans vibrationLaboratoire OKOHM-VFComposant de l’incubateur de microscope
VisiviewVisitron Systems GmbH-Logiciel d’imagerie
Couche de plaquettes1Université nationale de Singapour, institut de mécanobiologie installation de microfabrication-La plaquette est fabriquée sur mesure et le design fait référence à un matériau supplémentaire.
Couche de plaquettes2Université nationale de Singapour, institut de mécanobiologie installation de microfabrication-La plaquette est fabriquée sur mesure et le design fait référence à un matériau supplémentaire.

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alberts, B., et al. Molecular biology of the cell. , 4th ed, Garland Science. New York. (2002).
  2. Cogan, S. F. Neural stimulation and recording electrodes. Annu Rev Biomed Eng. 10 (1), 275-309 (2008).
  3. Zhao, M., et al. Electrical signals control wound healing through PI3K-γ and PTEN. Nature. 442 (7101), 457-460 (2006).
  4. Saw, T. B., et al. Transepithelial potential difference governs wound healing by electromechanics. Nat Phys. 18 (9), 1122-1128 (2022).
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