Article de méthode

Dissection des tissus craniofaciaux du poisson-zèbre lors de la coloration au bleu d’Alcian

DOI :

10.3791/68900

⸱

12 septembre 2025

 , 
1Tata Institute of Fundamental Research

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole décrit ici présente une procédure simple et facile à suivre pour colorer et disséquer les cartilages craniofaciaux d’une larve de poisson-zèbre âgée de 5 jours. Il peut être utilisé pour étudier l’anatomie, la forme et la taille de ces structures dans diverses conditions de développement.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le poisson-zèbre, compte tenu de sa transparence optique, est un excellent modèle de vertébré pour étudier les mécanismes par lesquels les cartilages craniofaciaux se forment dans l’embryon. Les cartilages craniofaciaux peuvent être largement classés en deux groupes, le neurocrâne et le viscérocrânium, qui à leur tour peuvent être subdivisés en de nombreux groupes cartilagineux nécessaires au soutien du cerveau et constituant l’appareil alimentaire et respiratoire, entre autres. Ce protocole décrira d’abord une procédure de coloration simple et établie chez le poisson-zèbre pour visualiser ces groupes cartilagineux, suivie d’une méthodologie pour disséquer et séparer le neuro et le viscérocrânium. À partir de ces dissections, des mesures simples de forme et de taille peuvent être facilement obtenues, et dans ce protocole, cela est démontré pour le palais, qui fait partie du neurocrâne antérieur, un tissu souvent affecté dans la plupart des troubles craniofaciaux chez l’homme. Le protocole peut être reproduit de manière simple, même dans des contextes aux ressources limitées, fournissant ainsi un outil éducatif précieux pour les étudiants de premier cycle pour s’initier à la morphologie craniofaciale.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cartilage craniofacial des vertébrés émerge d’une population cellulaire multipotente appelée cellules de la crête neurale crânienne1. Ces cellules sont d’abord spécifiées dans les marges dorsales de la plaque neurale chez les embryons précoces, qui migrent ensuite sur de grandes distances pour atteindre la région craniofaciale et les arcs pharyngiens avant de se différencier 2,3. Les mécanismes de signalisation qui conduisent à cette migration et à cette différenciation sont largement conservés chez les vertébrés 4,5. Malgré cela, l’organisation, la taille et la forme des éléments cartilagineux individuels sont distinctes d’une espèce à l’autre, donnant lieu à diverses morphologies craniofaciales6. Le poisson-zèbre, en particulier, est devenu un système modèle puissant pour étudier la morphogenèse craniofaciale, compte tenu de la nature transparente des embryons jusqu’aux stades larvaires. À l’aide de procédures simples de coloration pour marquer le cartilage, la morphologie de nombreuses structures craniofaciales chez le poisson-zèbre a été caractérisée sous différentes perturbations des voies de signalisation 7,8,9 ainsi que lorsque les embryons ou les larves sont exposés à des polluants courants présents dans l’environnement10. La coloration au bleu d’Alcian décrite ici pour marquer le cartilage implique l’utilisation de conditions non acides normalisées par Walker et Kimmel11, qui ont ensuite été utilisées par de nombreux laboratoires de poissons-zèbres travaillant sur le développement craniofacial 5,12,13,14,15,16,17,18,19 , y compris la description de l’utilisation dans les écoles secondaires20. La coloration sans acide préserve les structures osseuses intactes, ce qui permet de colorer le cartilage et les os ensemble en utilisant respectivement le bleu d’Alcian et le rouge d’alizarine. Cependant, il manque un protocole détaillé pour la coloration ainsi que pour la réalisation d’une dissection précise des cartilages craniofaciaux, en particulier pour aider à entreprendre de telles études dans des contextes aux ressources limitées.

Même si la structure squelettique faciale du poisson-zèbre adulte est assez complexe, composée de 43 os dérivés du cartilage21, le cartilage craniofacial d’une larve à 5 jours après la fécondation (dpf), qui vient d’acquérir la capacité de se nourrir, est relativement simple et peut être largement divisé en un neurocrâne dorsal et un viscérocrâne ventral4. Ces structures soutiennent le cerveau, contribuent à l’appareil alimentaire et donnent naissance à des cartilages de soutien pour les tissus branchiaux. Le protocole décrit ici permettra de colorer les cartilages de poisson-zèbre avec du bleu Alcian, suivi d’une procédure détaillée de dissection du neuro et du viscérocrâne en structures distinctes, ce qui permettra finalement une caractérisation minutieuse de la forme et de la taille des divers cartilages de ces structures. À titre d’exemple, nous mesurons les dimensions de la région antérieure du palais (toit de la bouche) appelée plaque ethmoïdienne, qui fait partie du neurocrâne.

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Protocole

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Les procédures d’entretien et expérimentales du poisson-zèbre utilisées dans cette étude ont été approuvées par le comité d’éthique animale de l’établissement, voir la référence TIFR/IAEC/2023-1.

1. Préparation du réactif

  1. Médias E3 :
    1. Préparez 50x le bouillon 1 en mélangeant 3,25 g de phosphate dibasique de sodium (0,458 mM Na2HPO4), 0,29 g de dihydrogénophosphate de potassium (0,042 mM KH2PO4), 11,93 g de chlorure de sodium (4,084 mM NaCl) et 0,48 g de chlorure de potassium (0,128 mM KCl) dans 1 L d’eau distillée.
    2. Préparez 50 fois le bouillon 2 en mélangeant 2,43 g de chlorure de calcium (0,33 mM CaCl2) et 4,07 g de sulfate de magnésium (0,33 mM MgSO4) dans 1 L d’eau distillée.
    3. Pour préparer 500 mL de 1 milieu E3, à 480 mL d’eau distillée, ajoutez 10 mL chacun des bouillons 1 et 2 (pH = 7,4).
      REMARQUE : Portez des gants pendant la préparation de ces solutions.
  2. 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans 1x PBS (solution saline tamponnée au phosphate) :
    1. Préchauffer 100 mL de 1x PBS à 68 °C. Ajouter 4 g de PFA et incuber la solution à 68 °C en mélangeant périodiquement jusqu’à ce que le PFA soit complètement dissous.
      REMARQUE : Portez des gants et un masque lors de la préparation de ce réactif, de préférence sous une hotte car le PFA est hautement toxique.
  3. Solution de MS-222 à 0,05 % (communément appelée tricaïne) :
    1. Préparez un bouillon de tricaïne à 4 % dans E3 et conservez-le à 4 °C. Pour faire 10 ml de bouillon de tricaïne, ajoutez 0,40 g de MS-222 dans 7 ml de E3. Agiter doucement le tube contenant la solution pour mélanger et porter le volume à 10 ml. Pour préparer 50 mL de solution de tricaïne à 0,05 %, ajoutez 625 μL de la solution mère à 4 % à 49,375 mL d’E3.
      REMARQUE : Portez des gants et un masque lors de la préparation de ce réactif.
  4. Solution de bleu d’Alcian à 0,4 % dans de l’éthanol à 70 %
    1. Pour préparer 2 ml de la solution mère, dissoudre 8 mg de bleu d’Alcian dans 1 ml d’éthanol à 50 %. Chauffer la solution à 37 °C pendant 15 à 20 minutes en mélangeant périodiquement pour la dissoudre. Une fois la tache dissoute, préparez la solution à 70 % d’éthanol en ajoutant 900 μL d’éthanol à 100 % et 100 μL d’eau distillée.
      REMARQUE : La solution mère peut être conservée à température ambiante jusqu’à 2 semaines.
  5. Solution colorante -- 0,02 % de bleu d’Alcian, 200 mM de chlorure de magnésium (MgCl2) et 70 % d’éthanol
    1. Pour préparer 5 mL de solution de coloration au bleu d’Alcian, ajoutez 1 mL de 1 M de MgCl2, 3,5 mL d’éthanol à 100 % et 250 μL de stock de bleu d’Alcian à 0,4 % (8 mg de bleu d’Alcian dans 2 mL d’éthanol à 70 %) à 250 μL d’eau et mélangez bien.
      REMARQUE : Préparez la solution de coloration fraîche pour de meilleurs résultats de coloration.
  6. Solution d’eau de Javel :
    1. Mélangez des volumes égaux de peroxyde d’hydrogène à 3 % (H2O2) et d’hydroxyde de potassium à 2 % (KOH). Pour préparer 2 ml de solution d’eau de Javel, mélangez 1 ml de peroxyde d’hydrogène à 3 % et 1 ml d’hydroxyde de potassium à 2 %.
      REMARQUE : Préparez cette solution à neuf avant de commencer cette étape. Comme H2O2 est sensible à la lumière, protégez-le autant que possible de l’exposition à la lumière. Portez des gants lors de la manipulation deH2,O2 et KOH.
  7. Solution I : 20 % de glycérol + 0,25 % de KOH
    REMARQUE : Comme le glycérol est très visqueux, pipetez avec précaution. Portez des gants lors de la préparation de ces solutions.
    1. Pour préparer 5 ml de solution I, ajoutez 2 ml de glycérol à 50 % et 625 μL de KOH à 2 % à 2,375 ml d’eau et mélangez bien.
  8. Solution II : 50 % de glycérol + 0,25 % de KOH
    1. Pour préparer 5 mL de solution II, ajoutez 3,570 mL de glycérol à 70 % et 625 μL de KOH à 2 % de KOH à 805 μL d’eau et mélangez bien.
  9. Solution de stockage : 50 % de glycérol + 0,1 % de KOH
    1. Pour préparer 5 ml de solution de stockage, ajoutez 3,570 ml de glycérol à 70 % et 250 μL de KOH à 2 % à 1,180 mL d’eau et mélangez bien.
  10. 3 % d’agarose
    1. Dissoudre 3 g d’agarose dans 100 mL d’eau distillée. Passez au micro-ondes jusqu’à ce que la solution devienne claire.
  11. 0,1 % PBST (0,1 % Tween 20 en 1x PBS)
    1. Pour faire 1 L de 1x PBS, ajoutez 8 g de NaCl, 0,20 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4 et 0,24 g de KH2PO4 dans 1 000 mL d’eau distillée. Mélangez la solution et ajustez le pH à 7,4. Pour obtenir 500 ml de PBST à 0,1 %, ajoutez 5 ml de Tween 20 à 495 ml de PBS 1x.
  12. 0,50 μg/mL de solution de DAPI
    1. Préparez 10 mg/mL de DAPI dans 1x PBS. Pour préparer 10 ml de solution de DAPI à 0,50 μg/mL, ajoutez 0,50 μL de la mère à 10 ml de 1x PBS et agitez vigoureusement pour vous assurer que le DAPI se dissout complètement.
      REMARQUE : Portez des gants lors de la préparation de ces solutions. Protégez le DAPI de la lumière car il est sensible à la lumière. Le stock DAPI peut être stocké à 4 °C pendant plus d’un an.

2. Prélèvement d’embryons

  1. Installez des couples de poissons-zèbres mâles et femelles dans des bassins de reproduction la veille de la nécessité de produire des embryons, les poissons mâles et femelles étant séparés par des barrières.
  2. Retirez les barrières le lendemain matin et collectez les embryons dans les 15 à 20 minutes suivant l’élimination des barrières.
    REMARQUE : Le moment de l’élimination de la barrière est utile pour la stadification des embryons et des larves de poisson-zèbre.
  3. Élever les embryons à 28,5 °C jusqu’à ce qu’ils atteignent 5 dpf.
    REMARQUE : Assurez-vous de remplacer le média E3 par un nouveau lot d’E3 préchauffé à 28,5 °C une fois tous les 2 jours.

3. Coloration au bleu d’Alcian

REMARQUE : Portez des gants pendant la réalisation de cette expérience

  1. Anesthésier 20 à 25 larves de poisson-zèbre âgées de 5 jours à l’aide de 0,05 % de tricaïne dans un tube de microcentrifugation (TCM) de 2 ml.
  2. Une fois que les larves cessent de bouger, ce qui prend généralement ~4 à 5 min, retirez l’anesthésique et fixez-les dans 1,5 mL de PFA à 4 % à température ambiante (RT) sur une bascule à 60 tr/min pendant 2 h.
  3. Retirez la plus grande quantité possible de fixateur à l’aide d’une pipette et ajoutez 1,5 mL d’éthanol à 50 % à l’échantillon. Incuber pendant 10 min en se balançant à 60 tr/min à RT.
  4. Prélever la plus grande quantité possible d’éthanol à l’aide d’une pipette et ajouter 1,5 mL de la solution de coloration au bleu Alcian.
  5. Incuber les larves fixes dans la solution de coloration pendant 18 à 20 h sur une bascule à 60 tr/min à RT.
    REMARQUE : L’incubation pendant une durée plus ou moins longue peut entraîner une sous-coloration ou une surcoloration de certaines régions du cartilage, respectivement. Ici, 18 à 20 h de coloration semblaient être les plus efficaces pour visualiser clairement le neuro et le viscérocrâne d’une larve de 5 jours.
  6. Retirez la solution de teinture, ajoutez 1,5 ml d’eau distillée et incubez pendant 1 à 2 minutes sur une bascule à RT.
    REMARQUE : La coloration peut être arrêtée à cette étape pour visualiser les limites cellulaires dans les cartilages disséqués. Cependant, un inconvénient de l’arrêt du protocole de coloration à cette étape sans effectuer les étapes de nettoyage ultérieures est que les limites du neuro et du viscérocrâne resteront toujours légèrement floues, et il devient plus difficile d’effectuer les dissections avec précision.
  7. Ajouter 1 mL de la solution d’eau de Javel à l’échantillon et incuber pendant 20 minutes à RT à l’air libre sans aucun couvercle sur la plaque ou les puits.
    REMARQUE : Ne couvrez pas les TCM pendant cette étape car la réaction entre le peroxyde d’hydrogène et l’hydroxyde de potassium produit de l’oxygène gazeux, ce qui pourrait faire éclater le couvercle s’il est fermé.
  8. Retirez la solution d’eau de Javel et effectuez les étapes suivantes pour éliminer les tissus.
    1. Ajouter 1,5 mL de solution I à l’échantillon et maintenir sur une bascule à 60 tr/min pendant 40 min à RT.
    2. Retirer la solution I et ajouter 1,5 mL de la solution II à l’échantillon et maintenir sur une bascule à 60 tr/min pendant 2 h à RT.
      REMARQUE : Les étapes de nettoyage aident à éliminer l’excès de colorant, améliorant la clarté optique des échantillons et aidant ainsi à effectuer les dissections efficacement. Manipulez les échantillons avec précaution lors du changement de solution, car tout dommage peut affecter l’analyse future de leur morphologie.
  9. Retirer la solution II et ajouter 1,5 à 2 ml de la solution de stockage. En raison de la présence de glycérol, les échantillons colorés coulent progressivement au fond en 10 minutes.
    REMARQUE : Les échantillons colorés peuvent être conservés à 4 °C pendant plus d’un an.

4. Dissection du squelette craniofacial

  1. Faites fondre la solution d’agarose à 3 % au micro-ondes jusqu’à ce que la solution devienne claire.
    REMARQUE : Ne surchauffez pas car la solution peut bouillonner hors du ballon. Vérifiez soigneusement la solution pendant que vous effectuez cette étape.
  2. Enduire une boîte de Pétri de 90 mm d’agarose à 3 % en versant l’agarose fondue jusqu’à ce qu’un tiers de la profondeur de la boîte de Pétri soit recouvert et qu’elle se solidifie. Des dissections seront effectuées dans cette boîte de Pétri.
    REMARQUE : Les boîtes de Pétri avec enrobage d’agarose peuvent être préparées une semaine à l’avance et conservées à 4 °C. Le revêtement à l’agarose fournit un substrat plus souple sur lequel les dissections peuvent être effectuées sans endommager les pinces.
  3. Nettoyez les pinces à utiliser avec de l’éthanol à 70 % et essuyez-les avec un morceau de papier de soie de laboratoire standard.
  4. À l’aide d’une pipette Pasteur, transférez 3 à 4 larves colorées avec 0,5 ml de solution de stockage dans la boîte de Pétri enrobée d’agarose.
    REMARQUE : La solution de stockage assure une plus grande clarté optique pour effectuer les dissections par rapport à la même chose dans E3.
  5. Orientez une larve tachée sur sa face latérale (figure 1A) et grattez soigneusement le jaune du corps de la larve à l’aide de la pince
    REMARQUE : La figure 1B montre un embryon dont le jaune a été retiré. C’est une bonne pratique de transférer l’embryon gratté du vitellin dans une nouvelle boîte de Pétri avant de procéder à d’autres étapes de dissection afin que la masse de vitellus collante qui flotte n’interfère pas avec la dissection.
  6. Une fois le jaune retiré, tenez la larve par la région de sa queue avec une pince et utilisez l’autre pour retirer soigneusement les yeux.
    REMARQUE : La figure 1C montre un embryon dont le jaune et les yeux ont été enlevés. Les yeux doivent être enlevés avec prudence car leur proximité avec le squelette craniofacial peut interférer avec leur dissection.
  7. À l’aide de la pince, tirez et pincez soigneusement le cerveau et les autres tissus dorsaux du neurocrâne. Tenez la larve immobile à l’aide d’une paire de pinces et utilisez l’autre paire de pinces pour faire une incision au milieu (figure 1C, flèche rouge), puis pincez les tissus (figure 1D).
    REMARQUE : Lors de l’exécution de cette étape, veillez à ne pas retirer les tissus plus proches des régions les plus antérieures du neurocrâne, car le cartilage pourrait se détacher avec eux.
  8. Séparez la tête de la larve du reste du corps. La région de la tête après cette étape contient principalement le neurocrâne et le viscérocrâne attachés l’un à l’autre en deux points, aux extrémités antérieure et postérieure, ainsi que quelques petits tissus non colorés attachés à ces structures craniofaciales (Figure 1E).
    REMARQUE : Il est difficile d’enlever entièrement les tissus non colorés directement attachés au neurocrâne et au viscérocrâne. Même si certains tissus résiduels seront présents, leur présence n’affectera pas l’analyse de forme ou de taille en aval car ils ne sont pas colorés.
  9. Coupez soigneusement les deux connexions entre le neurocrâne et le viscérocrâne pour les séparer (Figure 1F, lignes pointillées rouges). Voir la figure 2 pour des images du neurocrâne et du viscérocrâne chez des embryons intacts et disséqués.
  10. Sur une lame de verre propre, ajoutez une goutte ou deux de glycérol à 100 %. À l’aide d’une pince, transférez soigneusement le neurocrâne ou le viscérocrâne disséqué sur cette lame. À l’aide d’une pince, placez délicatement une lamelle sur ces tissus, en veillant à ce qu’aucune bulle ne se forme, et scellez la lamelle sur toutes les lames avec du vernis à ongles.
    REMARQUE : Ces lames peuvent être stockées à 4 °C pendant plus d’un an sans perdre la tache.

5. Quantification des dimensions de la plaque ethmoïdale

  1. Acquérir des images du palais à l’aide d’une caméra fixée au stéréomicroscope (figure 2D). En l’absence d’un appareil photo de qualité scientifique, fixez un smartphone standard au stéréomicroscope pour acquérir des images.
  2. Pour la quantification, chargez l’image d’un palais dans FIJI22, puis utilisez l’outil linéaire pour mesurer la largeur et la hauteur de la plaque ethmoïdale en microns (voir Figure 3A-C) et déterminez les dimensions en utilisant la résolution en pixels de la caméra.
  3. Dessinez un contour autour de la plaque ethmoïdale et cliquez sur Analyser | Définir les mesures | zone pour obtenir l’aire de la plaque ethmoïdale (Figure 3D,E).

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le squelette craniofacial du poisson-zèbre est entièrement cartilagineux 5 jours après la fécondation (dpf) et peut donc être coloré à l’aide de bleu d’Alcian, qui est un colorant basique capable de se lier aux glycosaminoglycanes présents en abondance dans les cartilages23. Le cartilage est alors coloré en bleu (figure 1) afin qu’il puisse être distingué des autres tissus présents dans la larve à l’aide d’un stéréomicroscope standard disponible dans la plupart des la...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les malformations craniofaciales constituent la majorité de toutes les malformations congénitales chez l’homme, conduisant souvent à la mortalité infantile. Cependant, l’étiologie sous-jacente de la plupart des anomalies craniofaciales reste à élucider25. Les structures craniofaciales sont complexes chez n’importe quel vertébré donné, et du point de vue d’un premier cycle, la première condition est donc de disposer d’un outil pédagogique qui donne aux étudiants un...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont pas d’intérêts concurrents à déclarer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions le Dr Kalidas Kohale et son équipe pour l’entretien de l’installation de gestion du poisson. SRN remercie le ministère de l’Énergie atomique (DAE) du gouvernement de l’Inde (Project Identification no. RTI4003, DAE OM n° 1303/2/2019/R\&D-II/DAE/2079 du 11.02.2020), le programme du groupe de partenaires de la Société Max Planck (M.PG. A MOZG0010) et la bourse de recherche pour start-up du Conseil de recherches en sciences et en ingénierie (SSR/2023/001716). Nous remercions la Dre Shweta Verma du laboratoire pour ses commentaires perspicaces. Nous remercions Swetha Nagarajan et Upal Chatterjee pour leur aide dans la réalisation des figures du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AgaroseBiosciences de Lonza50004Pour enrober les boîtes de Pétri
Bleu alcian 8G  ;Sigma-AldrichA3157Pour colorer les cartilages
Chlorure de calcium dihydratéSigma-Aldrich12022Pour la fabrication de tampons
CaméraOlympeDP28Pour l’acquisition d’images
DAPIRoche Sciences de la vie10236276001Pour le marquage des noyaux
ÉthanolHoneywell32221Solvant pour coloration au bleu d’alcian
FIDJIVersion : ImageJ 1.54f
ForcepsDumontDumontPour la réalisation de dissections
GlycérolMP biomédical193996Pour la réalisation de lavages et le montage d’échantillons  ;
Peroxyde d’hydrogèneMP biomédical194057Pour la fabrication d’une solution d’eau de Javel
Chlorure de magnésium hexahydratéSARD BiosciencesSBRC0217Pour la fabrication de tampons
Sulfate de magnésium heptahydratéSigma-AldrichM2773Pour la fabrication de tampons
MS-222 (Tricaïne)Sigma-AldrichA5040Pour anesthésier les larves
Chlorure de potassiumSigma-AldrichP9541Pour la fabrication de tampons
Hydroxyde de potassiumSigma-Aldrich484016Pour la fabrication de tampons
Phosphate de potassium monobasiqueSigma-AldrichRéf. P0662Pour la fabrication de tampons
Chlorure de sodiumSigma-AldrichS3014Pour la fabrication de tampons
Phosphate dibasique de sodiumSigma-Aldrich71640Pour la fabrication de tampons
StéréoscopeOlympeSZX61Pour la réalisation de dissections
Préadolescent-20HIMEDIATC287Détergent, utilisé pour la perméabilisation des cellules

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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