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Article de méthode

Établissement et maintenance d’organoïdes du cancer de la prostate dérivés de patients : un protocole expérimental détaillé

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DOI :

10.3791/68912

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14 novembre 2025

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1Department of Urology, Jiangnan University Medical Center (Wuxi No. 2 People's Hospital), 2Wuxi School of Medicine, Jiangnan University

Dans cet article

Résumé

L’hétérogénéité du cancer de la prostate et la résistance au traitement restent des défis. Nous décrivons un protocole pour générer des organoïdes dérivés du patient (PDO) qui préservent les principales caractéristiques tumorales parentales. Ce modèle standardisé soutient le dépistage des médicaments et les progrès de la médecine de précision.

Résumé

Le cancer de la prostate (PCa) est une tumeur maligne très hétérogène et l’une des principales causes de mortalité liée au cancer chez les hommes, avec des défis cliniques importants pour lutter contre la résistance au traitement et la progression de la maladie. Les modèles précliniques existants, tels que les lignées cellulaires bidimensionnelles (2D) et les xénogreffes dérivées de patients (PDX), ont des limites pour récapituler fidèlement la complexité de la PCa, y compris l’hétérogénéité tumorale, la signalisation dépendante des récepteurs aux androgènes (AR) et les interactions microenvironnementales. Pour combler cette lacune, cette étude présente un protocole robuste et reproductible pour établir des organoïdes dérivés de patients (DO) qui préservent les caractéristiques génétiques, phénotypiques et histologiques des tumeurs parentales. Cette méthode permet la culture d’organoïdes à partir de PCa localisés et avancés, fournissant un modèle biologiquement pertinent pour l’étude des mécanismes de la maladie, la réponse aux médicaments et la découverte de biomarqueurs. Les résultats démontrent la capacité du protocole à générer des organoïdes à partir d’une variété d’échantillons cliniques, avec des applications dans le criblage de médicaments à haut débit et la médecine de précision. En offrant un flux de travail standardisé qui répond aux principaux défis techniques, cette étude souligne l’importance des AOP en tant qu’outils polyvalents pour faire progresser la recherche sur le cancer de la prostate et développer des stratégies thérapeutiques plus efficaces.

Introduction

Le cancer de la prostate (PCa) reste l’une des tumeurs malignes les plus répandues chez les hommes dans le monde, juste derrière le cancer du poumon en termes de mortalité liée au cancer. Selon des études épidémiologiques récentes, l’incidence mondiale de la PCa n’a cessé d’augmenter, et il est prévu que le nombre de nouveaux cas de cancer de la prostate par an passera de 1,4 million en 2020 à 2,9 millions d’ici 20401. Malgré les progrès réalisés dans la détection précoce et le développement de nouvelles thérapies, notamment la thérapie de privation androgénique (TAA) et les agents ciblés, le cancer de la prostate reste un défi clinique important en raison de sa nature hétérogène et du développement inévitable d’une résistance au traitement, en particulier aux stades avancés2. Le cancer de la prostate résistant à la castration (CPRC), qui apparaît après l’échec de l’ADT, représente une forme mortelle de la maladie, caractérisée par de faibles résultats de survie et des options thérapeutiques limitées3. Il est donc essentiel de comprendre les mécanismes moléculaires à l’origine de la progression de la maladie et de la résistance pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et améliorer les résultats pour les patients.

Le développement de modèles précliniques qui imitent avec précision la complexité du cancer de la prostate humain est essentiel pour faire avancer la recherche dans ce domaine. Les cultures cellulaires 2D traditionnelles, bien que largement utilisées, ne parviennent pas à récapituler l’hétérogénéité cellulaire, l’architecture tumorale et le microenvironnement observés in vivo4. En conséquence, l’utilité translationnelle de ces modèles est limitée, en particulier pour l’étude de la progression tumorale, de la résistance aux médicaments et des interactions dynamiques entre les cellules cancéreuses et le microenvironnement tumoral5. En revanche, les xénogreffes dérivées de patients (PDX) et les cultures d’organoïdes sont apparues comme des outils plus sophistiqués qui comblent le fossé entre les lignées cellulaires conventionnelles et les tumeurs cliniques 4,5,6.

Les systèmes de culture d’organoïdes ont révolutionné la modélisation du cancer. Ces structures tridimensionnelles (3D) sont dérivées des tissus du patient et peuvent conserver les caractéristiques histologiques, génomiques et phénotypiques de la tumeur d’origine 7,8,9,10. Il est important de noter que les organoïdes du cancer de la prostate préservent les caractéristiques essentielles de l’hétérogénéité de la maladie, notamment la signalisation AR, la résistance au traitement et l’instabilité génomique, ce qui en fait des outils idéaux pour la recherche translationnelle11. Par rapport aux modèles PDX, les organoïdes sont plus rentables, évolutifs et se prêtent à la manipulation génétique, ce qui facilite le criblage de médicaments à haut débit, la découverte de biomarqueurs et les études fonctionnelles. Les plateformes d’organoïdes ont déjà montré des résultats prometteurs dans d’autres tumeurs malignes, notamment les cancers colorectal, du sein et du pancréas, soulignant leur potentiel pour l’oncologie personnalisée 4,12.

Cependant, l’établissement et la maintenance d’organoïdes du cancer de la prostate (SOPK) présentent des défis techniques uniques. L’épithélium de la prostate dépend intrinsèquement de la signalisation des androgènes et du soutien de la matrice extracellulaire (MEC), ce qui nécessite des conditions de culture spécialisées. De plus, le cancer de la prostate présente un large éventail de comportements cliniques, allant de tumeurs hormonosensibles localisées à des CPRC très agressifs et réfractaires au traitement, ce qui complique encore le développement de systèmes organoïdes reproductibles11,12. Les protocoles efficaces pour la génération de PCO doivent tenir compte de ces complexités biologiques en optimisant les étapes clés, notamment le traitement des tissus, la digestion enzymatique, l’intégration de l’ECM et la supplémentation en facteurs de croissance critiques, en hormones et en petites molécules. De tels protocoles sont essentiels pour garantir la fidélité des organoïdes à leurs tumeurs parentales et faciliter leur application dans les analyses en aval.

Dans cette étude, nous présentons un protocole détaillé et reproductible pour l’établissement et la maintenance à long terme des AOP. Notre flux de travail couvre l’ensemble du processus, de l’acquisition des tissus et du traitement des échantillons biopsiques et chirurgicaux au passage des organoïdes, à la cryoconservation et à la réanimation (Figure 1). Ce protocole a été optimisé pour préserver l’intégrité phénotypique et génomique des tissus cancéreux de la prostate, ce qui permet des systèmes de culture 3D robustes adaptés à un large éventail d’applications, notamment le profilage génomique, les tests de réponse aux médicaments et les tests fonctionnels. Notamment, notre méthode résout les obstacles techniques courants, tels que les faibles taux de réussite dans la culture d’organoïdes, la croissance sous-optimale et les difficultés de passage ultérieur, et fournit des directives standardisées, facilitant ainsi la reproductibilité entre les laboratoires.

Le développement de modèles organoïdes fiables du cancer de la prostate revêt une immense importance pour la recherche fondamentale et translationnelle13. Ces systèmes offrent une plate-forme puissante pour déchiffrer les mécanismes de la maladie, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et faire progresser des approches de médecine de précision adaptées à chaque patient. En comblant les lacunes techniques existantes et en fournissant un protocole complet, notre travail vise à accélérer l’adoption de la technologie des organoïdes dans la recherche sur le cancer de la prostate et à soutenir les efforts mondiaux pour lutter contre cette maladie difficile14.

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Protocole

Cette étude a été examinée et approuvée par le Comité d’éthique médicale de l’Hôpital populaire de Wuxi n° 2 (numéro d’approbation : Y-38 (2023)). Tous les participants ont fourni des formulaires de consentement éclairé écrits. Les données des patients ont fait l’objet d’une dépersonnalisation afin d’assurer la protection de la vie privée dans le respect des normes éthiques.

1. Prélèvement d’échantillons

  1. Acquisition de tissus
    1. Préparation avant échantillonnage
      1. Critères d’inclusion : S’assurer que tous les participants ont un diagnostic confirmé de cancer de la prostate, tel que déterminé par un examen pathologique ou d’imagerie. Dériver des échantillons tumoraux à partir d’une résection chirurgicale, d’une biopsie ou d’autres échantillons cliniques. Assurez-vous que tous les participants sont âgés de 18 ans ou plus et qu’ils n’ont pas d’autres tumeurs malignes, afin d’exclure toute interférence potentielle d’autres cancers dans l’étude du cancer de la prostate. Recueillir auprès de tous les participants le consentement éclairé écrit pour participer à l’étude et permettre l’utilisation de leurs échantillons pour la recherche scientifique.
      2. Critère d’exclusion : Exclure les patients dont les échantillons ne contiennent pas suffisamment de tissu tumoral pour la culture ou l’analyse. Exclure les patients qui retirent leur consentement ou qui ne sont pas en mesure de fournir les échantillons requis au cours de l’étude.
    2. Échantillons de biopsie à l’aiguille de la prostate :Utilisez une aiguille spéciale pour prélever des échantillons de tissu prostatique. Placer immédiatement le tissu dans la solution de conservation (milieu Advanced DMEM/F-12 (adDMEM/F-12) + solution inhibitrice de roche (dilution 1:2000)) et le transporter au laboratoire sur de la glace, en assurant une livraison dans les 24 h.
      REMARQUE : Ciblez précisément le tissu cancéreux de la prostate et effectuez un échantillonnage multisite dans différentes régions anatomiques. Effectuer 1 à 2 ponctions par site, chacune produisant ≥ des échantillons de carottes de 1 cm.
    3. Échantillons de prostatectomie radicale : Après le prélèvement, placer rapidement les échantillons dans une solution de conservation (milieu adDMEM/F-12 + solution inhibitrice de roche (dilution 1:2000)) et transporter sur de la glace, en assurant la livraison au laboratoire dans les 24 heures.
      REMARQUE : Plus de fragments de tissu peuvent être obtenus par prostatectomie radicale15.
      Prélever des échantillons ≥ 1 g (≈ 5 mm de diamètre), en minimisant la contamination par les tissus normaux. Coordonner préopératoirement avec les cliniciens pour spécifier : 1) le noyau tumoral ; 2) tissu péritumoral ; 3) Contrôle normal. Privilégiez les fragments fermes avec une décoloration gris-jaune. En cas d’absence, mettre en place un échantillonnage aléatoire systématique. Voir le tableau 1 pour obtenir des renseignements sur le prélèvement d’échantillons.
  2. Traitement des échantillons
    1. Étiquetage et catégorisation : Étiquetez clairement les échantillons de tissus collectés (y compris le nom du patient, le numéro d’hospitalisation, le nom du tissu, le site du tissu et le type de tissu).
    2. Cryoconservation : Traitez immédiatement les échantillons de tissus (≤ 12h après la collecte). Placer les échantillons dans une solution de conservation pré-refroidie (4 °C) (milieu adDMEM/F-12 + solution inhibitrice de roche (dilution 1:2000)) et les stocker à 4 °C. Passez à d’autres étapes expérimentales dans les 4 à 6 heures pour des résultats optimaux.
  3. Transport et entreposage
    1. Transport de la chaîne du froid : transportez les échantillons de tissus au laboratoire dans des conditions de basse température.
    2. Enregistrement de l’échantillon : À l’arrivée au laboratoire, vérifiez et enregistrez les informations de l’échantillon en détail, y compris les informations personnelles de base du patient, le type de tissu, le nom et le site de prélèvement.
  4. Réception et inspection en laboratoire :
    1. Inspection des échantillons : Ouvrez les échantillons dans une enceinte de biosécurité et vérifiez qu’il n’y a pas de perte, de contamination ou d’anomalie visible.
    2. Dissection de l’échantillon : Extrayez l’échantillon et placez-le dans une boîte de culture. À l’aide de ciseaux à tissus ou d’un scalpel, divisez l’échantillon en petits morceaux (environ 1 à 3 mm³) pour les expériences ultérieures.

2. Procédures expérimentales

  1. Préparation de suspensions de cellules tissulaires primaires
    1. Conservation : Placez les blocs de tissus collectés dans des tubes à centrifuger coniques stériles de 50 ml, en veillant à ce que les tissus soient classés par type. Étiquetez chaque tube de manière appropriée. Ajouter une solution de conservation (milieu adDMEM/F-12 + solution d’inhibiteur de roche (dilution 1:2000)) dans chaque tube jusqu’à ce que le tissu soit complètement immergé. Stocker les échantillons à 4 °C jusqu’à nouvel ordre.
      REMARQUE : Les types de tissus doivent inclure à la fois des tissus tumoraux et non tumoraux. Les étiquettes d’échantillon doivent généralement inclure le numéro de dossier médical.
    2. Séparation des tissus : À l’aide d’une pince à épiler stérilisée, transférez les échantillons de tissu du cancer de la prostate dans une boîte de culture de taille moyenne. Lavez le mouchoir 2 à 3 fois avec 2 ml de solution saline tamponnée au phosphate (D-PBS) de Dulbecco pour éliminer le sang et les débris. Retirez soigneusement le tissu adipeux, les muscles et autres composants non épithéliaux à l’aide d’une pince à épiler à pointe fine, en ne conservant que les régions épithéliales. Ensuite, hachez le tissu nettoyé en petits fragments d’environ 1 à 3 mm³ avec des ciseaux.
      REMARQUE : L’élimination complète des composants non épithéliaux est essentielle pour les applications en aval, car la contamination du tissu stromal ou adipeux peut réduire l’efficacité et la spécificité de l’isolement cellulaire. Maintenez des conditions stériles tout au long de la procédure pour minimiser le risque de contamination microbienne.
    3. Digestion des tissus : Transférez les morceaux de tissu préparés dans des tubes de traitement des tissus. Ajouter la solution de digestion du tissu tumoral (tableau 2) dans chaque tube. Activer le dispositif de digestion (appareil de préparation de suspension unicellulaire) à l’aide du programme de dissociation des tissus moyennement durs pour la dissociation enzymatique-mécanique.
      REMARQUE : Le protocole de digestion est le suivant : rotation avant à 200 tr/min pendant 3 s, rotation arrière à 200 tr/min pendant 3 s, rotation avant à 300 tr/min pendant 4 s, rotation inverse à 300 tr/min pendant 4 s, rotation avant à 600 tr/min pendant 5 s, rotation inverse à 600 tr/min pendant 5 s, rotation avant à 400 tr/min pendant 3 s, rotation inverse à 400 tr/min pendant 3 s. Cette séquence constitue un cycle, qui doit être répété trois fois. Après avoir terminé les deux premiers cycles, continuez avec une rotation lente à 20 tr/min pendant environ 25 min. La durée peut être ajustée en fonction des conditions expérimentales. Digérer les tissus à 37 °C pendant 40 min à 1 h.
    4. Arrêt de la digestion : Ajouter un volume égal ou double de milieu adDMEM/F-12 complété par FBS à la suspension cellulaire pour mettre fin à l’activité enzymatique.
      REMARQUE : S’il reste des résidus non digérés, prélever le surnageant, ajouter des enzymes digestives fraîches au résidu et poursuivre la digestion à 37 °C pendant 15 à 20 minutes supplémentaires. Surveillez le processus périodiquement et combinez les suspensions cellulaires des deux étapes de digestion.
    5. Filtration : Pré-mouiller une crépine cellulaire de 100 μm avec 1 mL de milieu adDMEM/F-12, puis filtrer la suspension cellulaire. Rincer deux fois le tube de traitement des tissus et la crépine cellulaire avec 5 mL de milieu adDMEM/F-12 complété par une solution inhibitrice de roche (dilution 1:2000). Prélever le filtrat dans un tube à centrifuger conique stérile de 50 ml. Passez la suspension dans une crépine de 70 μm et collectez toutes les suspensions de cellules dans un nouveau tube de 50 mL.
      REMARQUE : Le nombre d’étapes de filtration et la taille des pores des crépines peuvent être ajustés en fonction des caractéristiques de l’échantillon.
    6. Lyse des globules rouges :Centrifuger la suspension cellulaire recueillie à 200 × g pendant 5 min à 25 °C. Jetez soigneusement le surnageant, puis remettez en suspension la pastille cellulaire dans 2 ml de tampon de lyse des globules rouges. Incuber la suspension sur de la glace pendant 2-3 min.
      REMARQUE : Le temps d’incubation pour la lyse des globules rouges peut être ajusté en fonction de l’efficacité de la lyse. Une incubation prolongée peut entraîner une augmentation de la mort cellulaire. Il est recommandé de surveiller l’échantillon au microscope pour assurer une lyse complète des globules rouges sans dommages excessifs aux autres types de cellules.
    7. Mettre fin à la lyse : Ajouter 6 mL de milieu adDMEM/F-12 complété par une solution inhibitrice de roche (dilution 1:2000) à la suspension cellulaire. Transvaser le mélange dans un tube à centrifuger conique stérile de 15 mL et centrifuger à 200 x g pendant 5 min à 25 °C. Jetez le surnageant. Lavez la pastille cellulaire 1 à 2 fois avec le même milieu supplémenté et transférez la suspension cellulaire finale dans un tube Eppendorf de 1,5 ml.
    8. Évaluation de la viabilité : Mélanger 10 μL de suspension cellulaire avec un volume égal de solution de bleu de trypan et observer la viabilité cellulaire au microscope.
      REMARQUE : Si des quantités importantes de cellules mortes ou de débris sont observées, effectuez une centrifugation à basse vitesse à 50 x g pendant 5 min à 25 °C pour les éliminer avant de procéder au comptage.
    9. Comptage cellulaire : Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de milieu adDMEM/F-12, diluer la suspension au besoin (généralement dans une dilution de 1:20) et placer 6 μL de la suspension diluée sur un hémocytomètre pour compter les cellules au microscope.
    10. Collecte des granulés cellulaires : Centrifugeuse à 200 x g, 25 °C, pendant 5 min. Prélever la pastille de cellule finale dans un tube Eppendorf de 1,5 ml.

3. Établissement d’organoïdes à partir de suspensions de cellules primaires

  1. Ensemencement : Déterminez le volume requis de gel matriciel en fonction du nombre de cellules. À l’aide d’embouts de pipette pré-refroidis (stockés à -20 °C), transférez soigneusement le volume approprié de gel matriciel dans la pastille de cellule. Mélangez doucement le mélange cellule-gel sur de la glace, en évitant la formation de bulles d’air pour assurer un ensemencement uniforme et une intégrité optimale du gel matriciel.
    REMARQUE : Décongelez le gel matriciel à 4 °C pendant la nuit avant de l’utiliser. Assurez-vous que tous les outils de manipulation, y compris les pointes et les tubes de pipette, sont pré-refroidis pour éviter une gélification prématurée.
  2. Placage : Verser le mélange de gel à matrice cellulaire sur une plaque de culture à 24 puits à faible adhérence, en appliquant environ 30 μL par goutte. Assurez-vous que chaque goutte contient plus de 10 000 cellules pour favoriser la formation efficace d’une structure tridimensionnelle (3D).
    REMARQUE : Évitez une dilution excessive du gel matriciel. Pour maintenir l’intégrité structurelle et soutenir la formation de cultures 3D, le gel matriciel doit constituer plus de 70 % du volume total du mélange. Les organoïdes dérivés d’échantillons de biopsie humaine et de prostatectomie sont de nature équivalente, différant principalement par le rendement cellulaire viable, et des densités d’ensemencement identiques ont été appliquées dans ce protocole.
  3. Incubation : Placez la plaque de culture dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 5 min, en laissant le gel matriciel se solidifier au préalable. Retournez la plaque et laissez-la reposer pendant 20 minutes pour garder le gel matriciel sous forme 3D. Ajouter 800 à 1000 μL de milieu de culture (tableau 3) dans chaque puits. Remplacez le milieu de culture tous les 2-3 jours.
    REMARQUE : Assurez-vous que le gel matriciel n’est pas perturbé pendant l’étape d’inversion pour maintenir la structure 3D.

4. Passage des organoïdes

  1. Collecte et préparation des organoïdes : À l’aide d’une pointe de pipette pré-refroidie, perturber mécaniquement le gel matriciel pour fragmenter les amas d’organoïdes. Rincer chaque puits 1 à 2 fois avec un milieu adDMEM/F-12 + une solution d’inhibiteur de roche (dilution 1:2000). Transférez les grappes fragmentées avec le milieu de culture dans un tube à centrifuger conique stérile de 15 ml. Centrifuger à 200 × g pendant 5 min à 25 °C et jeter le surnageant.
    REMARQUE : Lorsque les organoïdes atteignent un diamètre de 100 μm (généralement au 14e jour de culture). Si un volume excessif du fluide interfère avec les perturbations mécaniques, aspirez une partie du fluide avant de briser les grappes. Pour obtenir un gel matriciel résiduel qui adhère à la surface de la plaque, gratter doucement à l’aide d’une pointe de pipette et rincer 2 à 3 fois avec un milieu adDMEM/F-12 + une solution inhibitrice de roche (dilution 1:2000). Tous les rinçages doivent être regroupés avec la collecte initiale pour un rendement maximal.
  2. Dissociation organoïde : Remettre en suspension la pastille résultante dans 2 mL de solution enzymatique recombinante préchauffée de type trypsine. Pipeter de haut en bas pour initier la dissociation, puis incuber à 37 °C pendant 15 à 30 min. Surveillez la dissociation au microscope toutes les 5 minutes jusqu’à ce que de petits groupes de cellules (environ 5 à 6 cellules par groupe) dominent le champ, puis passez à l’étape suivante.
    REMARQUE : L’arrêt rapide de la digestion est crucial pour éviter une dissociation excessive et préserver la viabilité cellulaire. L’observation microscopique fréquente permet de s’assurer que la digestion est arrêtée au moment optimal pour la formation des grappes.
  3. Mettre fin à la digestion : Terminez la digestion en ajoutant un volume égal ou double de milieu adDMEM/F-12 complété par du sérum fœtal bovin (FBS) pour éteindre l’activité enzymatique. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min à 25 °C et jeter le surnageant.
  4. Élimination du gel matriciel : Remettre la pastille en suspension dans 2 mL de solution de récupération cellulaire et incuber à 4 °C pendant 20 à 40 minutes pour dissoudre le gel matriciel résiduel. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min à 4 °C, jeter le surnageant et répéter le lavage deux fois avec un fluide adDMEM/F-12 pour éliminer les composants résiduels de la matrice. Transférez la pastille finale dans un tube Eppendorf stérile de 1,5 ml pour un traitement ultérieur.
    REMARQUE : L’incubation à basse température est essentielle pour une dépolymérisation efficace du gel matriciel tout en préservant l’intégrité de la cellule. Minimisez le temps passé à l’extérieur de l’environnement froid pour éviter une regélification prématurée.
  5. Ensemencement et culture : Procéder au réensemencement des grappes d’organoïdes dissociés en suivant les procédures décrites aux étapes 3.1 et 3.3. Assurez-vous d’une densité cellulaire et d’un rapport de gel matriciel appropriés pour une reformation optimale de la structure 3D.
    REMARQUE : Des protocoles détaillés pour la cryoconservation organoïde, la décongélation, le réemcastrement et le traitement histologique sont disponibles sur demande.

5. Cryoconservation organoïde

  1. Prélèvement d’organoïdes : Retirer la plaque de culture de l’incubateur et dissocier mécaniquement les agrégats d’hydrogel organoïdes à l’aide d’une pointe de pipette pré-refroidie. Transférez les agrégats dissociés avec le milieu de culture dans un tube à centrifuger conique de 15 ml. Rincez les puits 2 à 3 fois avec le milieu adDMEM/F-12, en combinant les lavages avec la suspension primaire. Centrifuger à 200 × g pendant 5 min à 25 °C et jeter le surnageant.
    REMARQUE : Pour assurer un rendement maximal, perturbez doucement les agrégats organoïdes sans causer de dommages excessifs. Tous les lavages doivent être combinés avec la collection primaire pour réduire la perte d’organoïdes pendant le processus de collecte.
  2. Dissociation enzymatique : Ajouter 2 à 4 mL d’une solution enzymatique recombinante préchauffée de type trypsine à la pastille organoïde dans un tube conique et mélanger doucement la suspension. Incuber la suspension à 37 °C pendant 15-20 min. Surveillez le processus de dissociation au microscope toutes les 5 minutes.
    REMARQUE : Si nécessaire, pipetez doucement pour aider à briser les plus grands amas en agrégats plus petits (environ 5-6 cellules par amas). Des temps de digestion plus courts sont nécessaires pour la cryoconservation afin d’éviter la sur-dissociation et la perte de viabilité cellulaire. Une observation fréquente permet de s’assurer que la digestion se termine au stade approprié pour préserver l’intégrité des organoïdes.
  3. Arrêt de la digestion : Ajouter un volume égal ou supérieur de milieu adDMEM/F-12 complété par FBS pour arrêter l’activité enzymatique. Centrifuger à 200 × g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
    REMARQUE :Si la pastille est exempte de gel matriciel résiduel, passez à l’étape 5.5 pour la cryoconservation. Si la contamination par le gel matriciel persiste, passez à l’étape 5.4.
  4. Retrait du gel matriciel (facultatif) : Suivez la procédure décrite à l’étape 4.4 pour retirer le gel matriciel. Remettre la pastille en suspension dans 2 mL de solution de récupération cellulaire et incuber à 4 °C pendant 20 à 40 min. Centrifugez à 200 × g pendant 5 min à 4°C, jetez le surnageant et répétez le processus de lavage 1 à 2 fois pour assurer une élimination complète du gel matriciel.
    REMARQUE : L’élimination du gel matriciel résiduel est essentielle pour s’assurer que seules les cellules dissociées sont cryoconservées. L’élimination incomplète du gel peut affecter la viabilité et l’intégrité structurelle des organoïdes lors de la décongélation.
  5. Cryoconservation : Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1,5 mL de milieu de congélation organoïde par pipetage doux pour assurer une suspension uniforme. Transférez la suspension dans un flacon cryogénique et conservez-la à -80 °C pour une conservation à court terme. Après 24 h, transférez les flacons dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme.
    REMARQUE : Assurez-vous que le milieu de cryoconservation est bien mélangé aux cellules pour éviter une congélation inégale, ce qui peut entraîner des dommages cellulaires. Les flacons doivent être transférés rapidement dans l’azote liquide après la période de stockage à court terme afin d’assurer la conservation à long terme et d’éviter la dégradation des cellules.

6. Récupération des organoïdes

  1. Décongélation des organoïdes cryoconservés : Retirer les cryoflacons contenant des organoïdes de l’azote liquide ou du stockage à -80 °C. Plongez immédiatement le flacon dans un bain-marie à 37 °C et agitez doucement jusqu’à ce que le contenu soit complètement décongelé. Dès que la décongélation est terminée, transférez la suspension organoïde dans un tube à centrifuger conique de 15 mL à l’aide d’une pointe de pipette pré-refroidie (-20 °C).
    REMARQUE : Une décongélation rapide et uniforme est essentielle pour minimiser les dommages cellulaires induits par la cryothérapie. Utilisez des pointes de pipette pré-refroidies pour éviter un réchauffement prématuré et la reformage du gel matriciel pendant le transfert.
  2. Élimination du cryoprotecteur : Ajoutez soigneusement 1 à 2 ml de milieu adDMEM/F-12 le long de la paroi du tube conique pour diluer progressivement le cryoprotecteur. Mélanger délicatement par inversion. Centrifuger à 200 × g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
    REMARQUE : Évitez le pipetage vigoureux ou le vortex à ce stade, car les changements osmotiques soudains et les contraintes mécaniques peuvent compromettre la viabilité des organoïdes. Une approche de dilution lente minimise le choc cellulaire.
  3. Lavage et remise en suspension : Ajouter 1 mL de milieu adDMEM/F-12 frais à la pastille. Remettez doucement les cellules en suspension à l’aide d’une pointe de pipette pré-refroidie (-20 °C) pour éviter l’adhérence prématurée du gel de matrice. Transférez la suspension dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml.
    REMARQUE : Le maintien d’une température basse pendant le lavage est essentiel pour éviter le réassemblage induit thermiquement des composants du gel matriciel, ce qui pourrait entraver la reformation ultérieure des organoïdes.
  4. Prélèvement : Centrifuger à 200 × g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant. Répétez l’étape de lavage 2 à 3 fois pour assurer l’élimination complète du cryoprotecteur résiduel et des contaminants.
  5. Ensemencement et culture : Remettre en suspension la pastille cellulaire finale dans un milieu de culture organoïde préparé selon les besoins expérimentaux. Procéder à l’ensemencement en suivant le protocole décrit aux étapes 3.1 à 3.3, en veillant à ce que la proportion de gel matriciel et la densité cellulaire soient appropriées pour favoriser le rétablissement de la structure 3D.
    REMARQUE : La viabilité et la récupération des cellules après décongélation dépendent fortement d’une manipulation en douceur, d’une dilution appropriée des cryoprotecteurs et du rétablissement immédiat d’un environnement de gel matriciel 3D favorable.

7. Traitement de pré-analyse pour la caractérisation des organoïdes

  1. Récolte des organoïdes : Dissocier mécaniquement les agrégats lorsque le diamètre des organoïdes atteint 70-100 μm et les transférer dans un tube conique de 15 mL contenant du milieu pour la culture ultérieure. Rincez les puits 2 à 3 fois avec le milieu adDMEM/F-12 et combinez les lavages avec la suspension organoïde. Centrifuger à 200 × g pendant 5 min à 25 °C et jeter le surnageant.
    REMARQUE : Pour les collectes à petite échelle (p. ex., 1 à 2 puits), utilisez un tube de microcentrifugation de 1,5 mL pour assurer une manipulation efficace et réduire les pertes d’échantillons. Veillez à ne pas perturber les structures organoïdes lors de la dissociation.
  2. Resuspension : Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de milieu adDMEM/F-12 et transférer dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Centrifuger à 200 × g pendant 5 min à 25°C et jeter le surnageant.
    REMARQUE : Assurez-vous que le granulé est bien remis en suspension avant la centrifugation pour éviter l’agglutination et pour faciliter un traitement uniforme dans les étapes ultérieures.
  3. Lavage et fixation : Ajouter 1 mL de D-PBS à la pastille et mélanger doucement par pipetage ou inversion. Centrifugez à 200 × g pendant 5 min à 25 °C, jetez le surnageant et répétez l’étape de lavage 1 à 2 fois. Fixez la pastille avec 1 à 2 ml de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) et incubez toute la nuit à 4 °C.
    REMARQUE : Effectuez soigneusement les étapes de lavage pour assurer l’élimination complète du milieu résiduel et autres contaminants. La fixation dans le paraformaldéhyde est cruciale pour préserver la morphologie des organoïdes en vue d’une analyse ultérieure.
  4. Lavage post-fixation : Centrifuger les échantillons à 200 × g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant. Lavez les échantillons fixés 2 à 3 fois avec du D-PBS, en mélangeant doucement par effleurement du doigt ou inversion douce pour assurer une bonne répartition du tampon de lavage et éviter la perte d’organoïdes.
    REMARQUE : Un lavage post-fixation approprié est essentiel pour éliminer l’excès de paraformaldéhyde et réduire les taches de fond dans les applications en aval, telles que l’immunohistochimie.
  5. Refixation à l’éthanol : Remettez la pastille en suspension dans 1 mL de mélange d’éthanol à 70 % doucement en effleurant les doigts et incubez à température ambiante pendant 20 min. Centrifuger à 200 × g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
    REMARQUE : La fixation à l’éthanol à ce stade aide à préserver l’intégrité des organoïdes et à préparer les échantillons pour l’enrobage ou le traitement ultérieur. Assurez-vous d’une suspension uniforme dans l’éthanol pour éviter une fixation inégale.
  6. Élimination du gel matriciel (facultatif) : S’il reste du gel matriciel résiduel dans la pastille, suivez le protocole décrit à l’étape 4.4 pour l’éliminer. Cette étape consiste à remettre le granulé en suspension dans une solution de récupération cellulaire et à l’incuber à 4 °C pendant 20 à 40 minutes, suivi d’une centrifugation et de plusieurs lavages pour assurer une élimination complète du gel.
    REMARQUE : L’élimination du gel matriciel est particulièrement importante pour l’analyse histologique ou l’imagerie en aval, car le gel résiduel peut interférer avec la section et l’analyse des tissus.
  7. Enrobage d’agarose : Préparez environ 6 mL d’agarose à 2 % en le faisant fondre à 96 °C pendant la fixation à l’éthanol organoïde. Mélangez 100 μL d’agarose fondue avec la pastille organoïde, en assurant une formation minimale de bulles d’air. Transférez le mélange dans un moule, solidifiez-le à 4°C, puis procédez à l’enrobage de paraffine.
    REMARQUE : Préchauffez les pointes de pipette (avec les extrémités coupées) pour éviter le colmatage. L’enrobage d’agarose facilite la préservation de la structure organoïde tout en permettant une manipulation et une coupe faciles. Évitez la formation de bulles pendant le mélange pour assurer un enrobage uniforme et une section optimale des tissus.

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Résultats

Caractéristiques morphologiques et de croissance dynamique des organoïdes du cancer de la prostate dérivés de patients
Des organoïdes de cancer de la prostate dérivés de patients ont été établis avec succès à partir de tissus tumoraux frais collectés lors de procédures cliniques. La formation initiale d’organoïdes a généralement été observée dans les 5 à 7 jours suivant la culture (figure 2). En microscopie à fond clair, les organoïdes pr...

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Discussion

La mise en place de PDO pour la PCa représente une avancée critique dans la modélisation préclinique, offrant des avantages significatifs par rapport aux cultures cellulaires 2D conventionnelles et aux PDX16. La méthode présentée dans cette étude permet de générer des organoïdes qui récapitulent fidèlement les caractéristiques histologiques, génétiques et phénotypiques de la tumeur d’origine. En préservant l’hétérogénéité tumorale, y compris la signalisation AR et...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine pour leur soutien (subvention n° 82172831) et le projet de recherche clé de la Commission provinciale de la santé et de la planification familiale du Jiangsu (subvention n° X20240121).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
A 83-01TOCRIS2939
adMEM/F12Gibco12634010
Armoire de biosécuritéJinan Xinbeixi Biotechnology Co., Ltd
Solution de récupération cellulaireCorning354253
centrifugeuseShenzhen Ruiwode Life Technology Co., LtdM1416R
Tubes centrifugeusesNankin iResearch Biotechnology Co., Ltd
Cultrex CheminClear BMR& D3533-010-02
Cultrex facteur de croissance réduit BME, Type 2R& D3533-005-02
Contenants de culture (plaques à faible adhérence à 24 puits)ThermoNunc-174930-ZX
DHTISOREAG521-18-6
Balance électroniqueNankin iResearch Biotechnology Co., Ltd
Sérum fœtal bovinGibco10099141
GlutaminePlus-200mMR& DB90210
HEPESR& D1254/10
Incubateur de cultures cellulaires humidifiées (37° ; C, 5 % de CO2)Shanghai Hetian Scientific Instrument Co., LtdHY-160SY
GlacièreNankin iResearch Biotechnology Co., Ltd
plats culturels de taille moyenneAbsinabs7005
Supplément média N21-MAX (50X)R& DAR008
N-acétylcystéineSigmaA9165-5G
NicotinamideR& D3533-010-02
NormocineInvivogenANT-NR-2
Dispositif de pipetage à aide de pipetInstrument scientifique Hotspot de Nankin Co., Ltd
PipettesInstrument scientifique Hotspot de Nankin Co., Ltd
PrimocinInvivogenANT-PM-2
rhEGFR& D236-EG-01M
rhFGFR& D233-FB-025
rhFGF-10R& D345-FG-025
rhNogginR& D6057-NG-100
rhR-Spondin 1R& D4656-RS-100
SB 202190TOCRIS1264
Appareil de préparation de la suspension à cellule uniquePropulsionDSC-400
Ciseaux tissulaires/scalpelNankin iResearch Biotechnology Co., Ltd
TryplE ExpressGibco126A04013
Kit de dissociation tumorale, humainMiltenyi Biotec130-095-929
Pince à épilerNankin iResearch Biotechnology Co., Ltd
Bain d’eauChangzhou Zhongjie Fabrication d’Instruments Expérimentaux Co., LtdHH-600
Y-27632 dihydrochlorureR& D1254/10

Références

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