Détection du comportement sujet à l’agrégation chez les cellules mutantes P53 V157F du cancer du sein à l’aide de la fluorescence multipoint de thioflavine T

Résumé

Les cellules de cancer du sein Hs578T portant la mutation p53 V157F présentent une fluorescence de thioflavine T significativement plus élevée que les cellules MCF7, indiquant une agrégation protéique accrue. Les mesures de fluorescence multipoint améliorent la précision et la fiabilité de la détection dans l’identification des agrégats riches en feuilles de β, soulignant l’importance des mutations p53 sujettes à l’agrégation dans la recherche sur le cancer et le développement de stratégies thérapeutiques.

Résumé

Le suppresseur tumoral p53, codé par le gène TP53 , joue un rôle central dans le maintien de la stabilité génomique. Les mutations TP53 , en particulier les variants à points chauds, se retrouvent dans environ 50 % des cancers humains et peuvent entraîner la perte de fonctions suppressives tumorales ou l’acquisition de propriétés de gain de fonction, y compris l’agrégation en structures de type prion.

Dans cette étude, nous avons évalué la tendance à l’agrégation de la mutation p53 V157F dans les cellules de cancer du sein Hs578T comparées aux cellules MCF7 exprimant p53 de type sauvage. L’agrégation des protéines a été évaluée par coloration à la thioflavine T (ThT) suivie d’une quantification de fluorescence dans des tests de plaques à 96 puits. Les cellules ont été colorées avec une solution ThT/Hoechst, lavées et analysées à l’aide d’un lecteur de microplaques selon des paramètres d’excitation/émission définis. Une analyse quantitative utilisant des relevés de fluorescence à un et à quatre points a révélé que les cellules Hs578T présentaient une augmentation de 3,20 à 4,26 fois l’intensité de fluorescence de ThT par rapport au MCF7, indiquant des niveaux significativement élevés d’agrégats riches en feuilles de β ou de type amyloïde. Les mesures multipoints ont confirmé la présence généralisée et constante d’agrégats protéiques à la surface du puits. Ces résultats soutiennent l’utilisation de la lecture multipoint des plaques pour détecter avec précision l’agrégation protéique dans les tests cellulaires.

Introduction

Le gène TP53, qui code pour la protéine suppressrice tumorale p53, est muté dans environ 50 % des cancers humains ^1,2. Ces mutations abolissent non seulement les fonctions suppressives tumorales de p53 mais, dans certains variants de points chauds, favorisent également la formation d’agrégats de type^{prion 3,4}. Ces formes agrégées de p53 mutant acquièrent fréquemment des propriétés de gain de fonction, notamment une résistance accrue aux thérapies anticancéreuses ^5,6. Par conséquent, identifier quelles mutations des points chauds p53 sont sujettes à l’agrégation est essentiel pour orienter le développement de stratégies de traitement efficaces chez les cancers mutants^{p53 7,8}.

Dans nos études précédentes, nous avons observé que des mutations spécifiques de p53 dans les carcinomes squameux de la tête et du cou (HNSCC) et les lignées cellulaires de cancer du sein présentent de forts signaux de coloration à la thioflavine T (ThT), indiquant la présence de protéines agrégées. Le ThT est un colorant benzothiazole qui se lie spécifiquement aux structures amyloïdes riches en feuilles de β, produisant une fluorescence accrue lors de la^{liaison 9}. Par exemple, la lignée cellulaire Detroit 562 HNSCC, qui porte la mutation p53 R175H, a présenté de forts signaux de fluorescence^{ThT 10}. De même, deux autres lignées cellulaires du HNSCC, TW01 et HONE-1, toutes deux porteuses de la mutation p53 R280T, ont également montré une coloration prononcée^{de ThT 11}. Dans ces cas, les signaux ThT sont colocalisés avec p53, soutenant la présence de p53^10,11 agrégés.

Dans les cellules du cancer du sein, MDA-MB-231 (mutation p53 R280K) et T47D (mutation p53 L194F) présentaient également une forte coloration ThT avec une co-localisation claire p53/^{ThT 12}. En revanche, les cellules MCF7, qui expriment le p53 de type sauvage, et les cellules MDA-MB-468 (mutation p53 R273H) n’ont montré que des signaux ThT^{faibles 12}. De même, les cellules OECM-1 HNSCC avec la mutation p53 V173L ont montré de faibles niveaux de coloration^{ThT 10}.

Comparé à d’autres méthodes de détection par agrégation protéique — telles que les tests par filtre, la microscopie électronique en transmission (TEM) ou l’immunocoloration par anticorps spécifiques à l’agrégat — l’analyse de fluorescence ThT présente plusieurs avantages. Il est non destructif, rapide et applicable aussi bien aux cellules vivantes qu’aux cellules fixes sans traitement étendu. Bien que les tests à filtre capturent efficacement les agrégats insolubles, ils nécessitent une dénaturation sévère et sont inadaptés à l’utilisation en cellules^{vivantes 13}. TEM permet une visualisation directe de la morphologie des fibrilles mais est laborieux et à faible débit¹⁴. L’immunocoloration spécifique à l’agrégat permet une détection in situ à l’aide d’anticorps dépendants de la conformation, bien que la disponibilité et la spécificité des anticorps puissent^{limiter 15}. En revanche, la fluorescence ThT — surtout lorsqu’elle est combinée à la lecture multipoint des plaques — offre une approche simple, quantitative et spatialement fiable pour détecter des structures riches en feuilles de β ou similaires à des amyloïdes.

Les considérations pratiques sont également essentielles pour la reproductibilité. La fluorescence de ThT est corrélée linéairement avec la concentration d’amyloïde sur une large plage de concentration (0,2-500 μM), et le signal de pic est généralement atteint à 20-50 μM, selon la protéine — bien que l’auto-fluorescence de ThT puisse émerger à ≥5 μM, et des concentrations plus élevées puissent impacter la cinétique d’agrégation¹⁶. Par conséquent, une concentration de ThT de travail autour de 10-20 μM est généralement recommandée afin d’équilibrer la sensibilité tout en minimisant les effets potentiels sur les processus d’agrégation¹⁶. Dans notre protocole, la réserve de 1 000x ThT (12 mM) est diluée à 1:1 000 pour obtenir une concentration de travail d’environ 12. μM, qui se situe dans cette plage recommandée.

Le ThT se lie préférentiellement aux structures amyloïdes riches en feuilles de β, caractéristiques des fibrilles amyloïdes. Cette spécificité provient de l’interaction du colorant avec l’architecture croisée β des fibrilles amyloïdes, où les surfaces formées par les β-brins fournissent des sites de liaison pour ThT. Par conséquent, le ThT peut ne pas détecter efficacement d’autres agrégats mal repliés ou non amyloïdes qui ne présentent pas cette structure riche en^{feuilles de β 17}. Ainsi, bien que le ThT soit un outil précieux pour identifier les fibrilles amyloïdes, il est conseillé d’employer des méthodes de validation complémentaires — telles que la co-localisation avec l’immunofluorescence p53 ou des approches biophysiques — afin de vérifier l’identité et la spécificité des agrégats^{détectés 10,18}.

Des études de prédiction structurelle suggèrent que la mutation p53 V157F adopte une conformation plus sujette à l’agrégation que la protéine sauvage¹⁹. Dans cette étude, nous avons comparé les signaux de fluorescence ThT entre les cellules de cancer du sein Hs578T, qui portent la mutation p53 V157F, sujette à l’agrégation, et les cellules MCF7 exprimant le type sauvage p53. À l’aide d’un test de coloration ThT basé sur un lecteur de plaques multipoint, nous avons cherché à évaluer la propension à l’agrégation de p53 V157F par rapport au p53 de type sauvage.

Protocole

1. Ensemencement cellulaire

1. Pour évaluer la viabilité cellulaire, mélangez 10 μL de bleu de Trypan avec 10 μL de cellules en suspension dans 1x solution de sérum tamponné phosphate (DPBS) de Dulbecco dans un tube microcentrifuge et mélangez soigneusement.
2. Chargez 10 μL du mélange sur une lame de compteur, puis comptez les cellules vives à l’aide d’un compteur automatique.
3. En fonction du nombre de viabilité, semez 30 000 cellules viables par puits dans une plaque de culture de 96 puits, avec un puits désigné comme témoin non coloré et les trois puits restants utilisés pour la coloration.

2. Incubation

1. Placez la plaque de culture dans un incubateur à_CO-2 et faites couver 12 heures à 37 °C.

3. Préparation d’un nouveau stock de teinture ThT (1 000x)

1. Pèser 0,02 g (20 mg) de poudre ThT et dissoudre-la dans 5,0 mL d’eau déionisée. Mélangez soigneusement jusqu’à ce que la poudre soit complètement dissoute.
   REMARQUE : Cette préparation donne une solution de type 1 000x ThT avec une concentration finale de 4 mg/mL, équivalente à 12,5 mM (le ThT a une masse moléculaire de ~318,85 g/mol). Une solution de 4 mg/mL équivaut à 4 g/L. Diviser 4 g/L par 318,85 g/mol donne 0,0125 mol/L, ou ~12,5 mM).

4. Préparation du tampon de coloration ThT avec une contre-teinture nucléaire

1. Préparez la solution colorante en ajoutant ce qui suit à 1 mL de 1x DPBS et mélangez doucement pour assurer l’homogénéité.
   1. Ajoutez 1 μL de bouillon de ThT fraîchement préparé à 1 000x, pour obtenir une concentration finale de ThT de 12,5 μM (1x).
   2. Ajoutez 1 μL de solution Hoechst 33342 à 1 mg/mL, pour obtenir une concentration finale de ~ 1 μg/mL (=1,6 μM).

5. Coloration

1. Retirez le milieu de culture de chaque puits. Ajoutez 100 μL du tampon de coloration ThT/Hoechst préparé à chaque puits de teinture. Ajoutez 100 μL de 1x DPBS à un contrôle non coloré.

6. Incubation

1. Placez l’assiette dans un endroit sombre à température ambiante (25 °C) pendant 30 minutes.

7. Lessive

1. Aspirez soigneusement ou jetez la solution de coloration de chaque puits, en veillant à ne pas déranger la monocouche de la cellule.
2. Ajoutez 100 μL de 1× DPBS à chaque puits et laissez un trempage doux de 30 secondes en option.
3. Aspirez soigneusement ou jetez la solution de lavage DPBS.
4. Répétez le lavage en ajoutant 100 μL de DPBS frais 1x dans chaque puits, en laissant à nouveau un trempage doux optionnel de 30 secondes, puis jetez la solution de lavage DPBS.
5. Après le deuxième lavage, ajoutez 100 μL de 1x DPBS frais dans chaque puits.

8. Mesure de fluorescence

1. Avant de lire le signal de fluorescence, retirez le capuchon de la plaque à 96 puits. Mesurez la fluorescence selon l’une des deux méthodes suivantes : lecture en point unique ou lecture en quatre points.
2. Placez la plaque à 96 puits dans un lecteur de microplaques, et mesurez la fluorescence en utilisant les réglages suivants : Fluorescence ThT : excitation à 450 nm, émission à 490 nm ; Fluorescence de Hoechst 33342 : excitation à 360 nm, émission à 460 nm ; Paramètres du lecteur : Tremblements : 5 s avant la lecture ; Direction de lecture : En tête ; Temps d’intégration : 140 ms ; Hauteur de lecture : 1,00 mm ; Points par well : 1 (point final) ou 4 (balayage du puits) ; Réglage du scan du puits : (Réglage de densité : 2 ; Espacement des points : 2,5).

9. Analyse des données

1. Calculer l’agrégation des protéines comme suit :
   
2. Normaliser l’intensité de fluorescence du ThT en fixant le rapport dans les cellules MCF7 à 1 (contrôle de base).

Résultats

Pour étudier la présence d’agrégats protéiques riches en feuillets de β dans les cellules du cancer du sein, les lignées cellulaires MCF7 et Hs578T ont été soumises à une coloration ThT suivie d’une quantification par fluorescence. Comme montré à la Figure 1, les cellules ont été ensemencées dans quatre puits d’une plaque de 96 puits, dont un puits désigné comme contrôle non coloré. Les trois puits restants ont été colorés avec du ThT selon le protocole stan...

Discussion

Lors de l’ensemencement des cellules en plaques à 96 puits, il est souvent difficile d’obtenir une distribution uniforme sur la surface du puits, car il n’est pas toujours possible de secouer ou taper doucement la plaque pour disperser les cellules. Cette distribution inégale peut introduire une variabilité de l’intensité du signal à travers le puits. La lecture de fluorescence multipoint a révélé une variation significative entre différentes régions au sein d’un même puits, mettant en l...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaque de culture à 96 puits	Simplement	PC396-0100
Contre-dialisier	Invitrogen	C10228
Compteur automatique de cellules Countess II FL	Thermo Fisher Scientific & nbsp ;	AMQAF1000
dPBS	Simplement	CC704-0500
Tube d’Eppendorf	Simplement	PC101-5000
Hoechst 33342	AAT Bioquest	17530
SpectraMax iD3	Dispositifs moléculaires	735-0391  ;
Thioflavine T	Sigma-Aldrich	T3516
Bleu de Trypan	Invitrogen	T10282