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Mutagenèse basée sur CRISPR-Cas9 dans le nématode entomopathogène Steinernema hermaphroditum et le maintien des lignées mutantes

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DOI :

10.3791/68932

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30 décembre 2025

 , 
1Division of Biosphere Sciences and Engineering, Carnegie Institution for Science

Dans cet article

Résumé

Cet article démontre l’ingénierie du génome médiée par CRISPR-Cas9 chez Steinernema hermaphroditum, un nématode entomopathogène (EPN : parasite insecte) et un modèle génétique émergent. La technologie décrite est utile pour créer des mutants, permettant d’élucider les fonctions géniques en biologie des nématodes pertinentes pour la symbiose mutualiste et parasitaire.

Résumé

Les nématodes entomopathogènes (NPE) des genres Steinernema et Heterorhabditis maintiennent des interactions mutualistes avec les bactéries symbiotiques Xenorhabdus et Photorhabdus , respectivement. Ensemble, ces paires nématode-bactérie infectent et tuent des hôtes insectes principalement des larves des ordres des Lépidoptères et des Coléoptères, formant un système tripartite facile à traiter pour disséquer la base moléculaire du mutualisme et du parasitisme. Une étape clé pour pleinement utiliser ce modèle est le développement d’outils génétiques stables et transgénérationnels dans les NPE. Ici, nous démontrons une plateforme fiable d’édition du génome CRISPR–Cas9 dans le modèle émergent Steinernema hermaphroditum, une espèce facilement maintenue in vivo et in vitro, et très adaptée à la microinjection gonadique. Il est important de noter que sa reproduction hermaphrodite simplifie grandement la génération et le maintien de lignées mutantes homozygotes. Nous fournissons un protocole détaillé pour une perturbation génique efficace et ciblée en utilisant la délivrance par microinjection des complexes ribonucléoprotéiques Cas9. À titre de preuve de concept, nous avons modifié le gène conservé associé au muscle unc-22, générant un phénotype caractéristique de spasmes qui valide la mutagenèse ciblée dans ce système. Cette plateforme CRISPR–Cas9 ouvre la porte à une manipulation génétique stable chez S. hermaphroditum, telle que l’expression des transgènes, et fournit un cadre pouvant être étendu à d’autres espèces EPN d’importance agricole et écologique.

Introduction

Les nématodes entomopathogènes (EPN) sont des parasites tueurs d’insectes qui forment des partenariats mutualistes spécifiques à chaque espèce avec leurs symbiotesbactériens 1. Les NPE se composent de deux familles : Steinermatidae et Heterorhabditidae, qui s’associent respectivement aux bactéries Gram-négatives Photorhabdus et Xenorhabdus spp. Pendant le stade juvénile infectieux libre (IJ) des nématodes Steinernema, les bactéries Xenorhabdus sont logées dans une poche intestinale du nématode appelée réceptacle, et lors de la pénétration de l’insecte hôte dans l’hémocoel, les bactéries sont libérées, après quoi elles se multiplient et tuent l’insecte parsepticémie 3,4. Dans cette relation mutualiste, les bactéries produisent des composés antimicrobiens et insecticides, qui protègent contre la réponse immunitaire de l’hôte et fournissent un soutien nutritionnel aunématode 5. En retour, les bactéries bénéficient de la protection offerte par l’hôte nématode contre les microbes environnementaux et sont facilitées dans leur dispersion vers de nouvelles proiesinsectes 6,7.

Au cours des dernières décennies, le partenariat Steinernema-Xenorhabdus s’est établi comme un puissant système expérimental pour étudier divers aspects des interactions parasitaires et mutualistes, tels que les comportements de recherche d’insecteshôtes 3, la colonisation bactérienne dans l’hôtenématode 8, et les comportements adaptatifs des bactéries symbiotiques facilitant leurs transitions entre nématodes et animaux hôtesinsectes 9. Les NPE sont également des espèces importantes pour la durabilité des sols et sont utilisées comme agents organiques de lutte antiparasitaire pour promouvoir la productivitéagricole 10,11.

Malgré le développement rapide des outils génétiques chez les bactéries symbiotiques Xenorhabdus et Photorhabdus12, les outils génétiques cohérents dans les NPE ont été rares. La microinjection gonadale a été établie avec succès chez les nématodes Heterorhabditis etSteinernema 13,14. Auparavant, la microinjection gonadale chez Heterorhabditis bacteriophora a été utilisée pour délivrer systématiquement de l’ARN double brin pour le knockdown génique chez la première génération de descendants13,15. Récemment, l’édition du génome CRISPR-Cas9 chez Steinernema a été développée, délivrée par microinjection gonadicale, et a donné des mutations précises, stables ethéréditaires 14.

Une espèce de Steinernema, S. hermaphroditum, s’est avérée très facile à traiter et possède un grand potentiel en tant qu’organisme génétique modèleémergent 4,14. Initialement isolé du sol enIndonésie 16 et réisolé enInde 17, S. hermaphroditum est constamment hermaphrodite, avec un petit nombre de mâles par génération, deux caractéristiques facilitant l’adaptation des outils génétiques du nématode modèle classique C. elegans4. De plus, le génome de S. hermaphroditum a été séquencé et assemblé en chromosomes, simplifiant la tâche d’identification des sites cibles potentiels Cas9 et la conception desamorces 18.

Lors de la microinjection d’EPN, un mélange d’injection contenant des réactifs appropriés, tels que des ARNds, la protéine Cas9 ou des ARN-guides, est délivré au gonade du nématode syncytial via une aiguille tirée d’un capillaire de quartz. Le volume et la pression appropriés d’injection entraînent un « flux » visible de liquide dans tout le bras gonadique. Puisque ces nématodes possèdent une paire de gonades syncytiales composées de noyaux de la lignée germinale partageant le même cytosol19, cette approche de microinjection permet d’accéder à plusieurs cellules germinales pour l’édition, avant la cytokinésie, séparant ainsi les noyaux germinaux enovocytes en développement 20. Bien que la microinjection gonadiale serve de technique cohérente pour la modulation génétique chez plusieurs espèces de nématodes non modèles 14,21,22,23,24,25, il est crucial d’adapter les techniques d’injection aux structures gonadales, au stade de vie et à l’état physiologique appropriés de chaque espèce de nématode afin d’assurer le succès et une grande efficacité dans la délivrance. Les techniques de récupération post-injection et l’entretien des lignées mutantes sont toutes deux importantes pour garantir que cette technique soit rentable.

Cette étude démontre un protocole d’édition du génome CRISPR-Cas9 chez Steinernema hermaphroditum. La microinjection gonadiale est décrite chez le jeune adulte, un stade résistant à la microinjection à haute pression et réceptif à l’édition génétique14. De plus, des méthodes détaillées décrivant le maintien des lignées mutantes héréditaires et stables sont fournies, à la fois par cryoconservation et propagation par insectes.

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Protocole

Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Préparation du nématode avant microinjection

  1. Préparez des plaques de milieu de croissance nématode (NGM) ensemencées avec les bactéries Xenorhabdus griffiniae et Comamonas aquaticus.
    REMARQUE : Cultivez des nématodes de S. hermaphroditum sur leur bactérie symbiotique native Xenorhabdus griffiniae avant microinjection afin de maximiser la croissance des nématodes et de récupérer des animaux injectés sur la bactérie Comamonas aquaticus afin d’augmenter la survie post-injection14.
    1. Striez la bactérie X. griffiniae sur des plaques d’agar de LB-pyruvate (2,5 g d’extrait de levure, 5 g de tryptone, 2,5 g de chlorure de sodium, 0,5 g de pyruvate de sodium, 7,5 g d’agar dans 500 mL d’eau) et incubez toute la nuit à 30 °C.
    2. Tracez la bactérie C. aquaticus sur des plaques d’agar LB et incubez toute la nuit à 37 °C.
    3. Choisissez une seule colonie de bactéries pour inoculer un milieu liquide LB sombre (5 g d’extrait de levure, 10 g de tryptone, 5 g de chlorure de sodium dans 1 L d’eau). Cultivez des bactéries toute la nuit (16 heures maximum) avec aération (X. griffiniae à 30 °C et C. aquaticus à 37 °C).
    4. Préparer agare NGM : (3 g de NaCl, 2,5 g de peptone et 20 g d’agar ajoutés à 975 mL d’eau, avec 1 mL de cholestérol, 1 mL 1 MCaCl 2, 1 mL 1 M MgSO4, 25 mL 1 MKPO 4 ajouté après autoclavage) 10 mL par boîte de Petri de 60 mm x 15 mm.
    5. Bactéries de graines : Ajoutez quelques gouttelettes de la culture bactérienne de la nuit sur chaque plaque d’agar NGM, secouez doucement pour disperser les gouttelettes bactériennes dans une plaque.
    6. Incubez les plaques NGM ensemencées de bactéries à température ambiante pour permettre à l’agar de sécher et de développer les bactéries.
      REMARQUE : Les plaques à graines de X. griffiniae doivent être utilisées dès que possible ; Les plaques de C. aquaticus peuvent être conservées à température ambiante pendant 1 à 2 semaines.
  2. Stade des nématodes
    REMARQUE : Choisissez le stade J3 de l’hermaphrodite la veille de l’injection et les jeunes adultes le jour de l’injection.
    1. Prélever ou morser les nématodes de S. hermaphroditum sur les plaques NGM préparées ensemées de X. griffiniae. Incubez à une température de 25 à 28 °C pour une croissance optimale.
    2. La veille de la microinjection, prélever le stade J3 des hermaphrodites sur une agar NGM ensemencée avec X. griffiniae. Comme montré à la Figure 1A, le stade J3 est estimé par la taille du nématode et la morphologie des gonades et de la vulve.
    3. Le jour de la microinjection, choisissez les jeunes hermaphrodites adultes (Figure 1B).

2. Préparation CRISPR-Cas9 pour la microinjection

  1. Sélection des crRNA CRISPR et du stockage des réactifs
    1. Extraire la séquence du gène cible du génome de référence Steinernema hermaphroditum en utilisant BlastP, PRJNA982879.
    2. Sélectionnez une séquence d’exon codante précoce, si possible, de préférence le premier exon, et entrez la séquence dans CRISPRScan en utilisant les réglages pardéfaut 26 pour générer une liste d’ARN CRISPR possibles (crRNA).
    3. Bombardez les crRNA supérieurs contre le génome de S. hermaphroditum afin de garantir que seuls des crRNA uniques soient choisis.
      REMARQUE : Optionnel : Confirmez la séquence de la région cible du génome par amplification PCR et séquençage Sanger avant la conception du crARN, afin d’assurer une liaison efficace des crARN.
    4. Stockez les ARN CRISPR (ARNcr) et les ARN CRISPR universels trans-activants (ARNōr-traces) à 100 μM chacun dans un tampon duplex à -80 °C.
    5. Conservez la protéine Cas9 à 10 mg/mL à -20 °C ou -80 °C. Stockez 1 M KCl à 4 °C.
  2. Fabrication du tampon d’agarose à 2 % pour injection (adapté de Berkowitz et al.27)
    1. Faites fondre 2 % d’agarose dans l’eau à l’aide d’un four à micro-ondes.
    2. Transférez 50 μL d’agarose fondue sur un verre de couverture (48 x 60 mm n°1). Couvrez immédiatement la gouttelette d’agarose avec un autre verre de couverture.
    3. Laissez sécher l’agarose à température ambiante pendant 20 minutes. Retirez la vitre supérieure du couvercle. Étiquetez le devant du coussinet d’agarose.
      REMARQUE : Optionnel : Faites cuire le tampon d’agarose à 37 °C toute la nuit pour sécher davantage le tampon d’agarose.
    4. Conservez les tampons à 2 % d’agarose à température ambiante pendant des mois, voire des années.
  3. Préparation de l’aiguille
    1. Fabriquez des aiguilles en quartz en utilisant les paramètres suivants sur un extracteur de filament laser. Avec le tireur d’aiguille utilisé dans cette étude, le programme suggéré est le suivant : Chaleur : 700, Filament : 4, Vitesse : 60, Délai : 145, Tirage : 175.
    2. Retirez les aiguilles en quartz (DO : 1,0 mm, DI : 0,7 mm) juste avant l’injection, ou à l’avance, et stockez-les dans une boîte de rangement pour pipettes.
      REMARQUE : Sinon, nous avons également du succès en injectant des aiguilles borosilicatées (DO : 1,2 mm, DI : 0,68 mm). Notez que différentes tailles d’aiguilles correspondent à différentes tailles de porte-aiguilles.

3. Microinjection CRISPR-Cas9 et récupération des nématodes après microinjection

  1. Préparez le mélange de microinjection CRISPR-Cas9 (adapté de Wang et al.28)
    1. Préparez de nouveaux duplex ARN-guide en mélangeant les crRNA choisis et l’ARN<[><[><[>1<]> universel dans un rapport 1:1, c’est-à-dire ARNr total à ARNr tracrARN dans un tube PCR :
      ARNr #1 (100 μM) - 1,5 μL
      ARNcr #2 (100 μM) - 1,5 μL
      ARNtrace (100 μM) - 3,0 μL
      REMARQUE : Si vous utilisez du co-CRISPR, l’ARNr #1 cible le gène marqueur unc-22 , tandis que l’ARNr #2 peut être remplacé par une autre séquence ciblant un second gène d’intérêt.
    2. Incubez le tube PCR dans un thermocycleur à 94 °C pendant 2 minutes, puis refroidissez à température ambiante.
    3. Assemblez le mélange d’injection en combinant les éléments suivants, puis incubez pendant 5 minutes à température ambiante :
      Cas9 (10 mg/mL) - 2 μL
      1M KCl - 0,58 μL
      Duplex gRNA (à partir de l’étape 3.1.1) - 2,7 μL
    4. Mélangez trois fois en faisant tourner le tube PCR, suivi d’un bref tour (10-15 s) dans une mini-centrifugeuse pour collecter le contenu du tube. Après le mélange final, réduisez la rotation plus longtemps, jusqu’à 1 minute.
  2. Chargez et cassez l’aiguille
    1. Chargez l’aiguille avec 1 à 2 μL de mélange injectable à l’aide d’une pointe microchargeuse.
    2. Assemblez l’aiguille au porte-pipette, puis ouvrez la pointe en faisant glisser l’aiguille sur un morceau de ruban adhésif double face recouvert d’huile d’halocarbone. Testez l’ouverture de l’aiguille en utilisant la fonction CLEAN du micro-injecteur.
  3. Microinjection dans les gonades syncytiales d’un jeune nématode adulte
    1. Transférez une petite gouttelette d’huile d’halocarbone sur un tampon d’agarose à 2 %.
    2. Sous le stéréoscope disséquant, utilisez un fil de platine fin (doux) pour soulever un nématode hermaphrodite adulte jeune et le laver dans un tampon M9 (par litre : 3 g KH2PO4, 11,3 gNa 2HPO 4, 5 g NaCl, avec 1 ml 1 MMgSO 4 ajouté après autoclavage) afin d’éliminer les bactéries (voir nématode adulte jeune à la Figure 1).
    3. Transférez le nématode lavé sur un coussinet d’agarose et placez-le dans la gouttelette d’huile d’halocarbone. Utilisez un fil de platine doux pour brosser doucement le nématode jusqu’à ce que l’animal soit immobilisé.
    4. Placez soigneusement le tampon d’agarose sur l’étage de microinjection. L’orientation du syncytium gonadal doit pointer vers l’aiguille à un angle d’environ 45°. Commencez par un grossissement 5x, puis passez à un grossissement 20x et 40x pour les injections.
    5. Assurez-vous que l’aiguille pénètre le syncytium, puis utilisez la fonction CLEAN du micro-injecteur pour introduire le mélange d’injection à environ 99 psi jusqu’à ce qu’un flux gonadique clair de liquide injecté soit observé afin que les réactifs accèdent aux cellules germinales dans le syncytium gonadique.
    6. Si le second bras gonadal est accessible, déplacez l’étage pour positionner l’aiguille à injecter dans le second bras.
  4. Récupération des nématodes après injection
    1. Immédiatement après l’injection, resuspendez l’animal injecté dans 1-2 μL de tampon M9 sur le tampon d’agarose.
    2. À l’aide d’un fil fin de platine, retirez le nématode injecté sur le tampon d’agarose et rincez l’huile à l’aide d’un tampon M9.
    3. Récupérer les nématodes sur les plaques NGM avec une pelouse de bactéries C. aquatica (préparation de la plaque NGM : voir étape 1.1), ce qui augmente le taux de survie des nématodes aprèsinjection 14. Incubez à 25 °C toute la nuit.
    4. Le lendemain, isolez chaque nématode injecté (P0) sur une plaque NGM individuelle ensemée de X. griffiniae. Laissez les animaux P0 produire une progéniture F1 pendant la nuit (soit en pondant des œufs, soit en sachant) pour le phénotypage et le génotypage (voir étape 4).

4. Dépistage pour confirmer les KO médiés par CRISPR-Cas9

  1. Dépistage à base de nicotine (ATTENTION) de la F1 pour détecter le phénotype de spasmes lors de l’utilisation de unc-22 comme marqueur co-CRISPR
    1. Transférez la progéniture F1 des animaux injectés à P0 dans une solution de nicotine à 2 %.
    2. Choisissez un animal individuel qui tressaille sur la zone de nicotine et récupérez immédiatement l’animal sur de l’agar NGM ensemencé de X. griffiniae. Isoler chaque F1 en contretemps sur une plaque individuelle et laisser produire des animaux F2 pour le génotypage (voir étape 4.2).
  2. Génotypage
    1. Choisissez huit descendants F2 ou F3 de chaque lignée de spasmes F1 pour le génotypage. Ces animaux incluent probablement à la fois des animaux hétérozygotes +/mut et homozygotes mut/ mut.
    2. Préparez un tampon d’extraction d’ADN frais en ajoutant 20 μL de Protéinase K (10 mg/mL) à 180 μL de tampon de lyse de vers (50 mM KCl, 10 mM Tris pH 8,0, 2,5 mMMgCl 2, 0,45 % NP-40, 0,45 % Tween 20, 0,01 % gélatine).
    3. Ajoutez des nématodes à 10 μL du tampon d’extraction d’ADN dans des tubes PCR. Incubez à 65 °C pendant 10 minutes, puis à 95 °C pendant 15 minutes pour extraire l’ADN génomique.
    4. Génotyper les nématodes en amplifiant la région cible Cas9 par PCR selon les instructions du fabricant, en utilisant 1 à 2 μL de lysat de l’étape 4.2.2. Il est important de prévoir un espace suffisant, si possible (au moins 300 pb), entre les sites de coupe Cas9 et les sites de liaison de l’amorce en cas de délétions majeures.
      REMARQUE : L’électrophorèse sur gel d’agarose peut être utilisée pour confirmer une amplification réussie avant le séquençage.
    5. Nettoyez le produit PCR en suivant les instructions du fabricant pour garantir une analyse précise des traces de séquençage Sanger.
    6. Séquencez les amplicons PCR générés à l’étape 4.2.4 en utilisant le séquençage Sanger et analysez les chromatogrammes à l’aide du programmeICE 29.
    7. Si les allèles mutants sont confirmés à l’étape 4.2.6, retournez à la plaque F1 d’origine et isolez au moins huit hermaphrodites sur des plaques individuelles. Laissez chaque nématode produire une descendance, puis massez le génotypage pour confirmer l’homozygosité. Les lignées homozygotes peuvent être maintenues en laboratoire comme indiqué à l’étape 5.

5. Maintenance de la ligne CRISPR

REMARQUE : Il existe trois principales méthodes d’entretien de la ligne. Cela inclut la cryoconservation basée sur le tréhalose-DMSO (étape 5.1), le passage in vivo à travers les vers de cire (étape 5.2), et le maintien in vitro sur les plaques NGM (étape 5.3).

  1. Cryopréservation par tréhalose-DMSO des lignées de type sauvage et mutantes
    REMARQUE : En utilisantune méthode de cryoconservation 4 de tréhalose-DMSO, S. hermaphroditum peut être conservé de manière stable à long terme à -80 °C et récupéré sur un milieu NGM. Les nématodes sont congelés dans des fioles cryogéniques de 2 mL. La congélation optimale est obtenue par un refroidissement progressif à l’aide d’un récipient en mousse de polystyrène.
    1. Cultivez S. hermaphroditum sur des NMG ensemencés de X. griffiniae (voir étape 1.1) jusqu’à ce que la majorité de la population soit J1 ou en train de sacher des hermaphrodites.
      REMARQUE : Évitez les stades juvéniles infectieux (IJ) car ils ne gèlent pas bien avec cette méthode.
    2. Laver les vers nématodes des plaques d’agar NGM dans le tampon M9 et les collecter dans des tubes coniques de 15 mL jusqu’à la marque des 5 mL. Concentrez par centrifugation (1372 x g pendant 1-2:30 min suffisent).
    3. Retirez le surnageant et lavez une fois dans un tampon de congélation Tréhalose-DMSO à température ambiante de 5 mL par centrifugation en suivant les paramètres fournis à l’étape 5.1.2.
    4. Resuspendez les vers dans un tampon de congélation Tréhalose-DMSO à température ambiante de 5 mL. Incubez à température ambiante pendant 30 minutes avec le tube sur le côté. Cela augmente le taux de survie.
    5. Dispensez 1 mL par tube dans 4 fioles cryogéniques.
    6. Placez les fioles dans des boîtes en mousse de polystyrène dans le congélateur à -80 °C.
    7. Une semaine plus tard, testez la décongélation d’un des flacons.
    8. Transférez le reste des fioles dans des congélateurs à -80°C et conservez-les définitivement.
    9. Le test de dégel ou de récupération de S. hermaphroditum à partir de stocks congelés
      1. Sortez un flacon du congélateur et laissez-le complètement décongeler à température ambiante.
      2. Versez le contenu liquide sur une nouvelle assiette NGM. Notez que l’ajout d’une bactérie symbiotique n’est pas nécessaire puisque le stock congelé contient généralement suffisamment de bactéries symbiotiques. Les vers devraient commencer à se rétablir en quelques minutes à quelques heures.
      3. Observez le mouvement et la reproduction du nématode. Après un jour ou deux, transférez plusieurs nématodes sur de nouvelles plaques NGM ensemencées avec X. griffiniae.
  2. Entretien in vivo via Galleria mellonella
    REMARQUE : Pour la croissance in vivo, propagez des lignées mutantes de S. hermaphroditum via des larves de5e stade de Galleria mellonella (ver de cire). Cette méthode est particulièrement utile pour les lignées qui ne sont pas viables après la cryopréservation. Un protocole détaillé et similaire de propagation naturelle des nématodes entomopathogènes par les insectes, ainsi que d’autres milieux pour la croissance des NEP, se trouve dans (McMullen et al.30). En résumé :
    1. Laissez les nématodes mourir de faim et devenir des IJ sur les plaques NGM.
    2. Utilisez le tampon M9 pour retirer les IJ des plaques NGM.
    3. Transférez les IJ pour infecter les insectes Galleria en utilisant le piège blanc.
  3. Pour l’entretien in vitro sur les plaques NGM, suivez les étapes suivantes :
    1. Des plaques de graines NGM contenant environ 100 μL de culture liquide fraîche du symbiote S. hermaphroditum , X. griffiniae.
    2. Laissez la plaque bactérienne sécher complètement avant de transférer les nématodes sur la plaque.
    3. Conservez les assiettes à 25 °C et transférez les nématodes sur des assiettes fraîchement ensemencées environ une fois par mois.

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Résultats

Deux ARN CRISPR ont été conçus (identifiés par le numéro de site Pam - Pam 3 et Pam 5) ciblant l’homologue S. hermaphroditum de unc-22 sur les sitesPam 14 précédemment publiés (Figure 2A). Chaque crRNA s’est complexé avec un tracrARN pour former un ARN-guide unique (sgRNA) et a été incorporé dans Cas9 pour former la ribonucléoprotéine comme décrit à l’étape 3.1. Dans ce protocole, deux crRNA étaient conçus pour cible...

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Discussion

Les systèmes animaux modèles génétiques non conventionnels offrent des opportunités précieuses d’étudier la fonction des gènes eucaryotes dans les contextes écologiques et physiologiques où ces traits apparaissent naturellement, par exemple en présence d’un hôte parasite ou du microbiome natif d’un organisme. Chez les nématodes entomopathogènes (NPE), la manipulation génétique s’est appuyée sur certains cas d’approches basées sur l’ARN13,32...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous remercions Margaret McFall-Ngai et Edward Ruby pour l’utilisation de leur microscope confocal. Nous remercions Alexis (Cody) Hargadon et Grischa Chen pour leur formation à la microscopie confocale, ainsi que Carly R. Myers pour l’aide apportée à l’obtention des images et à l’analyse des vidéos de spasmes. Nous remercions également Stephanie Hampton d’avoir alloué les fonds pour l’achat du système de microinjection. La Carnegie Institution for Science a soutenu ce travail.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Agar (maille 80-100)Fisher ScientificBP26411Également utilisé dans les plaques de pyruvate LB
AgaroseFisher Scientific16500500Également utilisé en génotypage
ARN-trace CRISPR-Cas9 Alt-RIDT1072532
Nucléase Alt-R S.p. Cas9 V3IDT1081058
Aiguilles borosilicatesInstrument de Précision Mondial1B120F-4
Chlorure de calcium (CaCl2)Sigma AldrichC4901
Cholestérol & nbsp ;VWR4335 mg/mL d’éthanol
Comamonas aquatica (DA1877)
Verre de couverture pour le tampon d’agaroseLaboratoires de recherche sur le cerveau#4860-1DÉpaisseur NO1 de 48 x 60 mm
CRISPRScanhttps://www.crisprscan.org/
Diméthyl Sulfoxyde (DMSO)Sigma-Aldrich4723010,5 M
Nettoyage ADN et Concentrateur-5  ;Zymo ResearchD4014
FemtoJet 4x microinjecteur avec set de tête de poignée, porte-aiguille taille 4 0Eppendorf/Calibre5253000017
Larves de 5e stade de Galleria melonellaGrubCohttps://www.grubco.com/index.cfm
Système d’imagerie sur gelAzure400AZI400-01
Colorant de charge en gelThermo Fisher ScientificB72
Gélatine (2 %)Sigma AldrichG1393
GelRedBiotium#41003
Amorces de génotypage : DNA oligo, 25 nmolIDTN/A
Gibco Bacto PeptoneFisher ScientificDF0118-17-0
Gibco Bacto TryptoneFisher ScientificDF0123-17-3Également utilisé dans les plaques Dark LB, LB Pyruvate & nbsp ;
Extrait de levure Gibco BactoFisher ScientificDF0127-17-9Également utilisé dans les plaques Dark LB, LB Pyruvate & nbsp ;
Jeu de tête de poignée 4 porte-aiguilles taille 1CalibreEPE-5196083008(associé à l’aiguille borosilicate 1B120F-4)
Huile d’halocarbone 700Sigma AldrichH8898
Crochet à vis à fil dur de platine pour l’entretien quotidienRecherche TritechPT-9901
Inférence des modifications CRISPR (ICE)SynthegoN/ALogiciels utilisés pour analyser les séquences de Sanger afin d’identifier les indels
KClSigma AldrichP9541
Extracteur d’aiguille laser P-2000SutterP-2000G
Chlorure de magnésium (MgCl2)Sigma AldrichM8266
Sulfate de magnésium (MgSO4)Sigma AldrichM7506Pour le tampon M9, également utilisé dans NGM
Embout du microchargeur 2x96STCalibre930001007
Adaptateur de montage du micromanipulateur pour Zeiss Axio Observer et Axiovert 200Recherche TritechNZ-19-2
MicroscopeTritechSMT1
NicotineSigma AldrichN3876
NP-40Thermo Fisher Scientific85124
Tampon duplex sans nucléaseIDT11-01-03-01
OneTaq MasterMixNEBM0486
Boîte de rangement pour pipettesSutter InstrumentsBX10
Chlorure de potassium (KCl)Sigma Aldrich793590
Phosphate de potassium, dibasique (K2HPO4)Sigma AldrichP3786KOH pour NGM
Phosphate de potassium, monobasique (KH2PO4)Sigma AldrichP5655Pour le tampon M9, également utilisé dans NGM
Protéinase KSigma AldrichP6556
Aiguilles en quartzSutter InstrumentsQF100-70-10
S. hermaphroditium génomeNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCA_030435675.1/
sh-unc-22 Alt-R CRISPR-Cas9 crRNAIDTN/A
Chlorure de sodium (NaCl)VWRSS0430Également utilisé dans les plaques de pyruvate M9, Dark LB, LB
Phosphate de sodium, dibase (Na2HPO4.7H20)Sigma AldrichS9390Pour le tampon M9
Pyruvate de sodiumSigma AldrichP2256Également utilisé dans les plaques de pyruvate LB & nbsp ;
Pic à vis sans fin en fil de platine souple pour microinjectionSurepure Chemetals6824Platine 90 %, fil d’alliage à 10 % d’iridium, diamètre de 0,002 pouce x 5 pieds de long
Porte-aiguille standardRecherche TritechHI-7
Steinernema hermaphroditum
Microscope stéréoscopiqueLeicaInveta 3
TréhaloseCole-ParmerEW-88195-990,08 M
Tris  ;Fisher ScientificAM9855GpH 8,0
Préadolescent 20Sigma AldrichP1379
Adaptateur de montage vertical pour micromanipulateurRecherche TritechNR2
Xenorhabdus griffiniae (HGB2511)

Références

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