Ce protocole évalue le rôle protecteur de la surexpression du klotho dans les cardiomyocytes H9C2 sous hypoxie-réoxygénation à l’aide de tests moléculaires et fonctionnels.
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Article de recherche
Ce protocole évalue le rôle protecteur de la surexpression du klotho dans les cardiomyocytes H9C2 sous hypoxie-réoxygénation à l’aide de tests moléculaires et fonctionnels.
Cette étude visait à étudier le rôle protecteur du klotho chez les cardiomyocytes soumis à une lésion par hypoxie/réoxygénation (H/R). Un modèle H/R in vitro a été établi à partir de cardiomyoblastes de rats H9C2, transfectés avec des vecteurs lentiviraux surexprimant la klotho. Les cellules ont été divisées en six groupes expérimentaux : témoin, H/R, témoins négatif (NC), surexpression de klotho, PDTC (un inhibiteur de NF-κB), et un groupe combiné traité avec klotho et lipopolysaccharide (LPS). Les niveaux d’expression du klotho ont été déterminés par PCR quantitative en temps réel et par western blotting. La viabilité cellulaire a été mesurée via le test MTT, tandis que l’apoptose a été évaluée par cytométrie en flux. L’expression des protéines impliquées dans la voie de signalisation NF-κB a été analysée par western blotting, et l’expression cellulaire des cytokines pro-inflammatoires a été évaluée par coloration par immunofluorescence. La surexpression du klotho a considérablement élevé les niveaux de klotho dans les cellules H9C2 et a conduit à une meilleure viabilité cellulaire, une réduction de l’apoptose et une diminution de l’expression cellulaire des cytokines pro-inflammatoires par rapport au groupe H/R. L’analyse par Western blot a révélé que la surexpression du klotho, ainsi que le traitement par PDTC, ont supprimé l’activation de la voie NF-κB, comme l’indique un rapport p-P65/P65 réduit et une augmentation des niveaux de p-IκBα/IκBα. Ces effets ont été partiellement inversés lors d’un traitement conjoint avec le LPS. Ces résultats suggèrent que le klotho confère une cardioprotection contre les lésions induites par H/R en modulant la signalisation du NF-κB, en réduisant l’inflammation et en favorisant la survie cellulaire. Ce protocole fournit une méthode reproductible pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents à la lésion ischémie-reperfusion myocarde et le potentiel thérapeutique du klotho dans l’inflammation cardiaque.
L’infarctus aigu du myocarde (IMA) est principalement causé par une ischémie suivie d’une réperfusion, ce qui a conduit à des recherches approfondies sur les mécanismes de la lésion de l’hypoxie/réoxygénation (H/R) myocarde 1,2,3. Un aspect clé de la lésion H/R myocarde est l’apoptose cellulaire, qui contribue de manière significative à la progression pathologique del’AMI 4,5.
Des études récentes ont impliqué la voie de signalisation du facteur nucléaire kappa B (NF-κB) dans les lésions H/R du myocarde grâce à sa modulation des réponses inflammatoires à des stimuli tels que le lipopolysaccharide (LPS)6,7,8. L’activation de NF-κB se fait par deux mécanismes distincts : les voies canonique et noncanonique 9. Dans la voie canonique, l’activation dépend de la dégradation induite par phosphorylation de l’inhibiteur de kappa B alpha (IκBα)10. Cependant, il a également été rapporté que la phosphorylation de la sous-unité NF-κB p65 peut entraîner l’apoptose, potentiellement indépendamment de la dégradation d’IκBα11. Le klotho, une protéine transmembranaire à passage unique, régule le métabolisme du phosphate et du calcium et inhibe la signalisation del’insuline 12,13,14. Les preuves émergentes indiquent que le Klotho exerce des effets inhibiteurs sur l’activation du NF-κB dans divers tissus, notamment le rein, l’hippocampe et les cellules vieillissantes, atténuant ainsi l’inflammation et les lésionstissulaires 15,16,17. Malgré ces avancées, le rôle du Klotho dans l’AMI et son interaction potentielle avec la voie NF-κB lors des lésions H/R myocardes restent largement inexplorés.
D’un point de vue méthodologique, le modèle H/R in vitro utilisant des cardiomyoblastes de rats H9C2 offre plusieurs avantages par rapport aux modèles animaux, notamment la tension contrôlée de l’oxygène, la reproductibilité et une variabilité réduite. De plus, la surexpression de Klotho médiée par les lentiviraux permet une modulation stable et efficace de l’expression génique, permettant une investigation directe de son impact fonctionnel. Ces approches rendent le protocole pratique, rentable et accessible pour les études mécanistes, tout en évitant les défis éthiques et logistiques de l’expérimentation in vivo .
En termes de considérations pratiques, les cellules H9C2 sont largement utilisées en recherche cardiocardiovaliste car elles conservent de nombreuses propriétés similaires à celles des cardiomyocytes, bien qu’elles n’imitent pas entièrement le phénotype des cardiomyocytes matures. La condition H/R sélectionnée (hypoxie de 5 heures suivie de réoxygénation en 1 heure) se situe dans une fourchette couramment utilisée pour modéliser la lésion ischémie-reperfusion in vitro. De même, la transduction lentivirale avec des multiplicités d’infection (MOI) autour de 100 est une approche standard pour obtenir une surexpression efficace avec une cytotoxicité gérable. Bien que ces caractéristiques renforcent l’applicabilité du protocole, des limites telles que la récapitulation incomplète de l’environnement in vivo doivent être reconnues. Par conséquent, la présente étude vise à explorer comment Klotho protège les cellules myocardiques contre les lésions H/R et à établir un protocole reproductible pour évaluer son interaction avec la signalisation NF-κB.
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Toutes les procédures impliquant la lignée cellulaire cardiomyoblast de rat H9C2 (ATCC, CRL-1446) ont été réalisées conformément aux réglementations institutionnelles sur la biosécurité. Aucun sujet animal ou humain n’a été directement impliqué dans cette étude. La figure 1 illustre le flux de travail graphique de la chaîne de conception et d’analyse expérimentale. Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.
1. Culture cellulaire
La lignée cellulaire cardiomyoblast de rat H9C2 (ATCC, CRL-1446) a été cryopréservée dans de l’azote liquide à l’aide d’un milieu de congélation composé du Médium Eagle modifié de Dulbecco (DMEM, glycémie élevée, 4,5 g/L) complété avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO). Pour la récupération, les fioles congelées étaient rapidement décongelées dans un bain-marie à 37 °C pendant 2 à 3 minutes, puis immédiatement transférées dans du DMEM préchauffé. Le milieu de culture a été préparé avec 10 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 3,7 g/L de bicarbonate de sodium et 1 mM de pyruvate de sodium. Les cellules étaient maintenues à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO₂. Des cellules H9C2 entre les passages 6 et 20 ont été utilisées pour toutes les expériences. Les premiers passages (P20) n’étaient pas utilisés pour éviter la dérive phénotypique liée au passage.
2. Surexpression lentivirale de Klotho dans les cellules H9C2
Un vecteur lentiviral auto-inactivant de troisième génération, codant pour le gène Klotho (Kl) du rat de pleine longueur sous le contrôle du promoteur EF1α, a été appliqué pour établir une surexpression stable dans les cellules H9C2. La construction contenait un reporter P2A-EGFP pour la visualisation, un élément régulateur post-transcriptionnel (WPRE) du virus de l’hépatite de la marmotte et des éléments du tractus polypuriné central (cPPT) pour la stabilité des transcrits, ainsi qu’une cassette de résistance à la puromycine pilotée par le promoteur PGK pour la sélection. Des particules lentivirales ont été produites dans HEK293T cellules en co-transfectant le plasmide de transfert avec des plasmides psPAX2 (gag/pol/rev) et pMD2.G (VSV-G) à un ratio de 4:3:1 à l’aide de polyéthyléneimine (PEI ; ADN : PEI = 1:3, c/w). Les surnatants ont été récoltés à 48 h et 72 h, clarifiés par centrifugation à 3 000 × g pendant 10 minutes, filtrés à travers une membrane PES de 0,45 μm, puis concentrés par ultracentrifugation à 25 000 × g pendant 2 h à 4 °C. Les granulés viraux ont été resuspendus dans des PBS contenant 1 % d’albumine sérique bovine (BSA), et les titres fonctionnels (TU/mL) ont été déterminés par infection par dilution limitante de cellules HEK293T avec lecture EGFP à 72 heures. Les cellules H9C2 ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits à 2 × 10 cellules5 par puits, ce qui a entraîné une confluence d’environ 60 % au moment de la transduction. Des particules lentivirales ont été ajoutées à une multiplicité d’infection (MOI) de 100 dans 1 mL de milieu de culture frais complété en polybrene (8 μg/mL) pour améliorer l’efficacité de l’infection. L’inoculum a été retiré après 12 heures et remplacé par 2 mL de substrat complet. À 72 heures après l’infection, l’efficacité de la transduction a été vérifiée par la fluorescence EGFP au microscope à fluorescence. Pour l’établissement de lignées cellulaires stables, la puromycine (2 μg/mL, pré-titrate) a été appliquée pendant 3 à 5 jours à partir de 48 heures après l’infection, avec des changements de milieu toutes les 48 heures. La surexpression de Klotho a été confirmée par RT-qPCR et immunobloting. Toutes les procédures lentivirales ont été réalisées sous contrôle de niveau de biosécurité 2 (BSL-2), et tous les déchets viraux ont été inactivés avec de l’eau de Javel à 10 % pendant au moins 30 minutes avant leur élimination.
3. Groupes expérimentaux
Les cellules H9C2 ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits (zone de croissance 9,6 cm²) à 3 × 10⁵ cellules par puits, ce qui a donné une confluence d’environ 70 % à 80 % après 24 heures, la densité requise pour le traitement de l’hypoxie/réoxygénation (H/R) et les tests ultérieurs. Après une implantation nocturne, les cellules ont été réparties en six groupes expérimentaux : (1) Groupe témoin, qui n’a reçu aucun traitement supplémentaire ; (2) groupe H/R, qui a subi une hypoxie/réoxygénation (H/R) dans une chambre modulaire d’hypoxie scellée, suivi d’une exposition à 5 heures d’hypoxie (1 % O₂, 94 % N₂, 5 % CO₂) et 1 heure de reperfusion (5 % CO₂), comme décritprécédemment 18 ; (3) Groupe témoins négatif (NC), dans lequel les cellules ont été transfectées avec un vecteur vide 24 heures avant le traitement H/R ; (4) Groupe Klotho, dans lequel les cellules ont été transfectées avec des vecteurs lentiviraux codant pour Klotho 24 heures avant le traitement H/R ; (5) Groupe de traitement à la pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), traité avec 200 mg/L inhibiteur de la voie NF-κB PDTC pendant 24 heures avant le traitementH/R 19 ; (6) Groupe Klotho + LPS, dans lequel les cellules ont été transfectées avec des vecteurs lentiviraux codant pour Klotho puis traitées avec un lipopolysaccharide à 1 mg/L pendant 24 heures avant le traitement H/R 20.
4. qRT-PCR
Les cellules H9C2 ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits à une densité de 1 × 10⁶ cellules par puits. Après traitement, l’ARN total a été isolé à l’aide d’un protocole d’extraction phénol-chloroforme. En résumé, 1 mL de réactif a été ajouté par puits, suivi d’une extraction au chloroforme, de la précipitation d’isopropanol et d’un lavage à 75 % d’éthanol. La pastille d’ARN a été séchée à l’air et dissoute dans de l’eau sans RNase. La concentration et la pureté de l’ARN ont été déterminées spectrophotométriquement. Pour la synthèse d’ADNc, 1 μg d’ARN total a été transcrit inversement à l’aide d’un kit commercial de transcription inverse selon le protocole du fabricant, incluant l’extraction d’ADN génomique et le déclenchement aléatoire d’hexamères. La PCR quantitative en temps réel a été réalisée dans un système de PCR en temps réel avec la chimie SYBR Green sous les conditions suivantes : dénaturation initiale à 95 °C pendant 30 s, suivie de 40 cycles à 95 °C pendant 5 s et 60 °C pendant 30 s. Les séquences d’amorces ont été conçues avec Primer-BLAST (NCBI) et synthétisées par un fournisseur commercial : (1) Klotho : F 5′-TAAGGTTCAAGTATGGAGAC-3′, R 5′-GGGCGTTCACACTTATTATTAT-3′ ; (2) β-actine (contrôle interne) : F 5′-TGTCACCAACTGGGATA-3′, R 5′-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3′. Les niveaux d’expression relatifs ont été calculés à l’aide de la méthode 2^-ΔΔCT, et la spécificité d’amplification a été confirmée par un seul pic de courbe de fusion.
5. Western blot
Les protéines ont été extraites des cellules H9C2 à l’aide d’un tampon de radioimmunoprécipitation (RIPA) (200 μL par puits d’une plaque à 6 puits) complétés par un cocktail inhibiteur de protéase sur glace. Les concentrations de protéines ont été mesurées par test à l’acide bicinchoninique (BCA), et des quantités égales de protéines (20-30 μg) ont été chargées par voie sur un gel SDS-PAGE à 10 % pour la séparation électrophorétique. Les protéines ont été transférées sur des membranes de polyvinylidène difluorure (PVDF) à l’aide d’un système de transfert humide à 100 V pendant 90 minutes à 4 °C. Les membranes ont été bloquées avec 5 % de lait écrémé préparé en TBST pendant 1 h à température ambiante, puis incubées toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires contre Klotho (1:500), phospho-p65 (1:500), p65 (1:500), phospho-IκBα (1:500), IκBα (1:500) et β-actine (1:1000). Après trois lavages avec TBST, les membranes ont été incubées avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) pendant 1 h à température ambiante. Les bandes protéiques ont été visualisées à l’aide d’un système de détection chimiluminescence amélioré, et les intensités de signal ont été quantifiées avec le logiciel ImageJ en utilisant des paramètres de seuil identiques.
6. Analyse MTT
Les cellules H9C2 ont été ensemencées en plaques de 96 puits à une densité de 2 × 10³ cellules par puits dans 100 μL de milieu complet et incubées toute la nuit pour permettre l’adhérence. Un volume de 10 μL de solution MTT (5 mg/mL dans PBS) a été ajouté à chaque puits et incubé pendant 4 heures à 37 °C dans des conditions humidifiées avec 5 % de CO₂. Après l’incubation, le surnageant a été soigneusement retiré, puis 100 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO) ont été ajoutés pour dissoudre les cristaux de formazan, suivis d’une incubation de 10 minutes à température ambiante avec un léger secouement. L’absorbance a ensuite été mesurée à 490 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques. Le résultat visuel attendu était l’apparition de cristaux de formazan violet dans des cellules viables avant l’ajout de DMSO, et une solution homogène violette après dissolution.
7. Cytométrie en flux
Les cellules ont été prélevées 24 heures après le traitement par trypsinisation et collectées par centrifugation à 1 500 × g pendant 5 minutes à 4 °C. La pellete cellulaire a été remise en suspension dans 100 μL de tampon de liaison 1× (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl₂, pH 7,4). L’annexine V-APC et l’iodure de propidium (PI) ont été mélangés à un ratio de 1:2 pour préparer une solution de coloration de 15 μL, qui a été ajoutée à la suspension cellulaire. Le mélange a été incubé pendant 10 minutes à température ambiante dans le noir. Après l’incubation, 400 μL du même tampon de liaison ont été ajoutés, et les échantillons ont été immédiatement analysés à l’aide d’un cytomètre en flux. Un total de 10 000 événements par échantillon ont été collectés. Les données ont été analysées à l’aide du logiciel FlowJo. Les cellules ont d’abord été verrouillées en fonction de la diffusion directe (FSC) et de la diffusion latérale (SSC) pour exclure les débris, suivies d’un gating en quadrant entre Annexin V et PI pour distinguer les cellules viables (Annexin V-/PI-), les cellules apoptotiques précoces (Annexin V+/PI-) et les cellules apoptotiques/nécrotiques tardives (Annexin V+/PI+). La coloration Annexin V-positive/PI-négative a indiqué une apoptose précoce, tandis que la coloration double positive Annexin V/PI a indiqué une apoptose tardive ou une nécrose.
8. Immunofluorescence
Les cellules H9C2 ont été ensemencées sur des bâtons de verre stériles dans des plaques à 6 puits à une densité de 1 × 10⁵ cellules par puits et soumises à des traitements. Les cellules ont été fixées avec 4 % de paraformoldéhyde pendant 15 minutes à température ambiante, perméabilisées avec 0,1 % de Triton X-100 dans PBS pendant 10 minutes, et bloquées avec 5 % d’albumine sérique bovine (BSA) dans PBS pendant 30 minutes à température ambiante. Les coverslips ont été incubés toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires contre le TNF-α (1:200), IL-1β (1:200) et IL-6 (1:100). Après trois lavages dans PBS, les cellules ont été incubées avec des anticorps secondaires marqués par la phycoérythrine (PE) pendant 1 heure à température ambiante dans l’obscurité. Les noyaux ont été contre-colorés avec du DAPI pendant 5 minutes. Les cache-lames étaient montées sur des lames en verre avec un support antifondu, et les signaux de fluorescence étaient visualisés à l’aide d’un microscope à fluorescence. Les images ont été analysées avec ImageJ (version 1.54). La fluorescence rouge indiquait l’expression des cytokines, tandis que la fluorescence bleue marquait les noyaux.
9. Analyse statistique
Toutes les données ont été analysées à l’aide du logiciel SPSS. Les résultats sont exprimés en moyenne ± écart-type (DE) provenant d’au moins trois expériences indépendantes. Pour les comparaisons de groupes multiples, une analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) suivie du test post hoc de Tukey a été appliquée. Une valeur P < 0,05 était considérée comme statistiquement significative.
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La surexpression du klotho améliore la survie cellulaire et atténue les létions inflammatoires médiées par NF-κB
Pour confirmer l’efficacité de la délivrance génique, l’expression de Klotho a été quantifiée à la fois au niveau de l’ARNm et des protéines. Les cellules à surexpression de Klotho ont montré une augmentation robuste par rapport aux groupes témoins hypoxie/réoxygénation (H/R) et nég...
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Dans cette étude, le rôle protecteur du Klotho dans les cardiomyocytes exposés à une lésion hypoxique/réoxygénation (H/R) a été étudié, et il a été constaté que la surexpression du Klotho améliorait significativement la viabilité cellulaire, réduisait l’apoptose et supprimait l’expression des cytokines pro-inflammatoires. Ces effets étaient accompagnés d’une réduction de la phosphorylation de p65 et d’une phosphorylation accrue de IκBα, suggérant que l’inhibition de la signalisation NF-κ...
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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 4 % de paraformaldéhyde | Biosharp | XG1050 | |
| Solution de coloration Annexin V APC/PI | Elabscience | E-CK-A217 | |
| Kit de synthèse d’ADNc | Qiagen | 205410 | |
| DAPI Solution | BioFroxx | 1155MG010 | |
| Dulbecco » s Eagle Moyen Modifié (DMEM) | HyClone | SH30243.01B | |
| Kit de réactifs de détection ECL | Meilunbio | MA0186-1 | |
| Alimentation par électrophorèse (POWER PAC 200) | Bio-Rad | POWER PAC 200 | |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | VivaCell | C04001-500, C04002-500 | |
| Cytomètre à flux (Gallios) | Beckman Coulter | Gallios | |
| Microscope à fluorescence (BK6000) | Chongqing Optec | BK6000 | |
| Solvant formazan | Solarbio | M1020 | |
| Anticorps anti-lapins de chèvre conjugué HRP | Bethyl | A120-101P | |
| LPS (NF-& kappa ; Agoniste de la voie B) | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| Lecteur de microplaques (Modèle K3) | Thermo | K3 | |
| Chambre d’incubation modulaire (chambre d’hypoxie) | Billups-Rothenberg | MIC-101 | |
| MTT Solution | Les îles Caïmans | 21795 | |
| PDTC (NF-& kappa ; Inhibiteur de la voie B) | Sigma-Aldrich | P8765 | |
| Anticorps anti-IgG de la chèvre conjugué à PE | Bioss | bs-0295G-PE | |
| Polybrene (bromure d’hexadiméthrine) | Invitrogen | X2351 | |
| PVDF Membrane | Merck | ISEQ00010 | |
| Rabbit Anti-Rat IL-1 et bêta ; Anticorps | Biorbyt | orb378927 | |
| Anticorps anti-rat du lapin IL-6 | ZEN BIO | 384702 | |
| Rabbit Anti-Rat I&kappa ; B&alpha ; Anticorps | Biorbyt | orb223182 | |
| Anticorps anti-Rat Klotho du lapin | Biorbyt | orb333711 | |
| Anticorps anti-rat du lapin p65 | Biorbyt | orb229138 | |
| Phospho-I&kappa anti-rats pour lapins ; B&alpha ; Anticorps | Biorbyt | orb223035 | |
| Phospho-NF-& kappa anti-rats pour lapins ; Anticorps B p65 | Biorbyt | orb304662 | |
| Rabbit Anti-Rat TNF-& alpha ; Anticorps | Biorbyt | orb106548 | |
| Anticorps anti-rat & bêta-actine du lapin | Huabio | ET1702 | |
| Système de PCR quantitative en temps réel (LightCycler 96) | Roche | Light Cycler96 | |
| Tampon de lyse RIPA | Mreda | MO52447 | |
| Kit de préparation au gel SDS-PAGE | Elabscience | E-IR-R305 | |
| Kit de réactifs TRIzol | Technologies de vie | 15596-018 |
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