Dosage de l’efflux de phospholipides spécifiques aux lipoprotéines de haute densité

Résumé

Nous décrivons ici les protocoles permettant de mesurer la quantité de phospholipides fluorescents spécifiquement éliminée des particules donneuses de lipides par les lipoprotéines de haute densité (HDL) présentes dans le plasma humain entier ou le sérum. Nous avons montré que cette métrique de la fonctionnalité HDL prédit les maladies cardiovasculaires incidentes.

Résumé

Les taux plasmatiques de cholestérol à lipoprotéines de haute densité (HDL) (HDL-C) sont actuellement une mesure clé pour l’évaluation clinique du risque de maladie cardiovasculaire (MCV). L’élimination des lipides de la plaque des cellules et des dépôts extracellulaires dans la paroi artérielle par le HDL est l’une des nombreuses fonctions anti-athérogènes du HDL qui peuvent expliquer son association inverse avec le risque de MCV. L’élimination du cholestérol cellulaire par le HDL in vitro s’est récemment avérée être un prédicteur encore meilleur du risque de MCV que le HDL-C.

Le HDL est composé d’une population hétérogène de particules, qui remplissent différentes fonctions. Les particules HDL impliquées dans l’élimination des lipides de la plaque d’athérosclérose contiennent des apolipoprotéines échangeables, principalement l’apolipoprotéine A-I, qui se dissocient de la particule puis éliminent les lipides de la plaque. Le HDL naissant est formé par la solubilisation et l’élimination des phospholipides et du cholestérol des domaines de la membrane plasmique cellulaire générés par ABCA1 par des apolipoprotéines échangeables dérivées du HDL. Ce processus joue un rôle essentiel dans la prévention et la régression de la plaque d’athérosclérose.

Nous décrivons ici le protocole du test d’efflux de phospholipides spécifiques du HDL (HDL-SPE), dont nous avons déjà montré qu’il peut prédire le risque de MCV incident. Ce test mesure spécifiquement l’élimination médiée par l’apolipoprotéine HDL d’un phospholipide fluorescent non échangeable d’une particule donneuse de lipides. Nos études cliniques cas-témoins ont établi que le test HDL-SPE fonctionne aussi bien, voire mieux, que le test de capacité d’efflux de cholestérol basé sur les cellules, un test laborieux et techniquement complexe qui utilise souvent du cholestérol radioactif.

L’objectif de ce protocole est de permettre aux chercheurs fondamentaux et cliniques d’évaluer la fonctionnalité des HDL dans la mobilisation des lipides, à l’aide d’un test simple, standardisé, acellulaire et à haut débit. Ce test peut être utilisé par les chercheurs fondamentaux pour mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à l’efflux lipidique médié par les HDL et pour cribler de nouveaux agents thérapeutiques qui améliorent la fonctionnalité des HDL. Le HDL-SPE peut également servir de test de diagnostic en laboratoire clinique pour l’évaluation du risque de MCV.

Introduction

Le test HDL-SPE (High-Density Lipoprotein-Specific phospholipid efflux) mesure la fonctionnalité des HDL et est destiné à être utilisé dans la recherche biomédicale et les laboratoires de diagnostic clinique pour (i) mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à l’élimination des lipides des lésions athéroscléreuses par les HDL, (ii) servir de nouvelle plate-forme pour améliorer l’évaluation clinique du risque de MCV et, (iii) développer de nouveaux traitements pour traiter les maladies cardiovasculaires.

Le cholestérol HDL (HDL-C) est un déterminant important du risque de MCV¹, mais son utilité est compromise dans la mesure où des taux élevés de HDL-C (>80 mg/dL) sont associés à un risque plus élevé de MCV 2,3,4,5. Des taux élevés de HDL-C peuvent représenter l’accumulation de HDL dysfonctionnel qui a une capacité réduite à éliminer les lipides de la plaque artérielle⁶.

Le test de capacité d’efflux cellulaire de cholestérol (CEC) a été le premier test in vitro développé pour mesurer la fonctionnalité HDL. Dans ce test, des macrophages en culture (souris ou humains), généralement marqués avec du cholestérol ^{Bodipy 3}H ou fluorescent, sont incubés avec du plasma ou du sérum appauvri en apoB. Le % d’efflux de cholestérol est calculé sur la base de la quantité de fluorescence/radioactivité associée aux cellules et aux milieux ^7,8,9. Il a été démontré que le test CEC est un meilleur prédicteur de MCV incidente que le HDL-C⁷. Le test CEC ne se prête pas à la conversion en un test de diagnostic clinique de routine, principalement en raison de ses exigences en matière de culture cellulaire et de sa longue durée (p. ex., jours). De plus, le test CEC est limité par sa variabilité inhérente (par exemple, différents types de cellules, techniques de marquage et déplétion en PEG des β-lipoprotéines, qui modifie la composition HDL¹⁰).

Plusieurs groupes de recherche ont mis au point des tests d’efflux de cholestérol HDL acellulaire qui serviront d’outils pour obtenir de nouvelles connaissances sur la fonction des HDL et pour une application potentielle dans un test de diagnostic clinique afin de mieux évaluer le risque de MCV^11,12. Ces tests d’efflux impliquent généralement plusieurs étapes et utilisent une particule donneuse de lipides marquée avec un cholestérol fluorescent, et comme le test CEC, ils nécessitent soit l’appauvrissement des β-lipoprotéines, soit, alternativement, la capture de particules contenant de l’apoA-I à l’aide d’anticorps anti-apoA-I, pour mesurer l’efflux plasmatique de cholestérol HDL. Bien qu’il ait été validé que ces tests alternatifs sont associés à des degrés divers au risque de MCV, à ce jour, il a été démontré qu’un seul¹³, qui évalue le taux de change apoA-I, permet de prédire le risque de MCV^{incident 14}. Il est intéressant de noter qu’il a été démontré que la cinétique de l’échange d’apoA-I sur et hors HDL plasmatique est associée indépendamment à la CEC¹⁵ et qu’elle est nettement réduite chez les patients atteints du syndrome coronarien aigu¹⁶. De plus, il a été démontré que plusieurs apolipoprotéines échangeables HDL médient à la fois le cholestérol et les phospholipides des cellules exprimant ABCA1 in vitro¹⁷.

Nous avons développé une approche alternative pour évaluer la fonctionnalité HDL¹⁸. Le test simple, rapide et fiable décrit ici ne nécessite que deux composants, à savoir des échantillons entiers de plasma humain (ou animal) ou de sérum (frais ou décongelés) et une particule donneuse fluorescente enrobée de lipides. Le test mesure la capacité de l’apoA-I et d’autres apolipoprotéines échangeables associées aux HDL dans le plasma entier/sérum à éliminer une phosphatidyléthanolamine (PE) fluorescente non échangeable, marquée dans un groupe de tête, d’une particule^{donneuse 18} enrobée de lipides (Figure 1).

Les particules donneuses de ce test sont constituées de cristaux d’hydrate de silicate de calcium (CSH) enrobés de cholestérol, de phospholipide phosphatidylcholine (PC) et d’un PE fluorescent. Les apolipoprotéines échangeables associées au HDL, principalement apoA-I, libérées par les particules HDL se lient aux particules donneuses puis se dissocient d’elles avec les lipides des particules donneuses, y compris le PE fluorescent. De cette manière, le HDL, mais pas les autres lipoprotéines présentes dans le plasma entier/sérum, acquiert spécifiquement le PE fluorescent à partir des particules donneuses^18,19. Le plasma entier/sérum est incubé avec des particules donneuses de silicate de calcium hydraté enrobé de lipides fluorescents (LC-CSH) et une solution saline à 37 °C, en agitant pendant 1 h. Étant donné que la densité de l’eau est environ deux fois supérieure à celle de l’eau, les particules donneuses sont facilement séparées du plasma par centrifugation à basse vitesse.

Le % d’efflux de PE mesuré dans les études cliniques est généralement normalisé en divisant par la valeur de la fluorescence PE acquise par le HDL dans le surnageant du mélange réactionnel d’un échantillon clinique par la valeur obtenue par le HDL dans un plasma humain témoin de référence. La normalisation à un plasma de référence est effectuée pour corriger les variations dans la préparation du réactif. Pour les applications de recherche, le % d’efflux de PE peut être déterminé en calculant la fluorescence du PE surnageant divisée par la fluorescence totale (fluorescence PE surnageante + fluorescence LC-CSH). Les valeurs de mesure de la fluorescence surnageante sont collées dans un modèle dans des fichiers tableurs pour calculer le % d’efflux PE (tableau supplémentaire 1 pour les mesures en trois exemplaires et tableau supplémentaire 2 pour les mesures en double). Les instructions pour effectuer ces calculs dans la feuille de calcul sont fournies sous forme de fichiers supplémentaires (Fichier supplémentaire 1, Fichier supplémentaire 2, Fichier supplémentaire 3, Fichier supplémentaire 4, Fichier supplémentaire 5, Fichier supplémentaire 6, Fichier supplémentaire 7 et Fichier supplémentaire 8), et un exemple de calcul est fourni dans le Tableau supplémentaire 3.

Figure 1 : Dosage HDL-SPE. L’efflux de phospholipides spécifiques du HDL est dosé dans des plaques de 96 puits. Des cristaux salins d’hydrate de silicate de calcium (gris) enrobés de lipides (LC-CSH), y compris de la phosphatidyléthanolamine non interchangeable marquée à la lissaminerhodamine (LRh-PE ; couches membranaires rouges), et jusqu’à 30 échantillons entiers de plasma/sérum (jaune ; en trois exemplaires) sont chargés sur des plaques de 96 puits. Après un mélange pendant 1 h à 37 °C dans un thermomélangeur, les plaques sont brièvement centrifugées pour granuler les particules donneuses LC-CSH. Les aliquotes des surnageants, contenant du HDL spécifiquement marqué avec LRh-PE, sont transférées sur une plaque noire contenant un détergent (pour solubiliser le Lh-Rh-PE) et une solution saline. La fluorescence PE est ensuite mesurée à l’aide d’un fluorimètre. Saline (contrôle négatif ; NC), pour la correction du bruit de fond, et du plasma humain sain regroupé (contrôle positif ; PC) pour la normalisation des plaques, sont chargés à la place du plasma/sérum de l’échantillon dans le dernier ensemble de puits. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocole

Le prélèvement sanguin est effectué conformément aux règles de la Déclaration d’Helsinki de 1975 (https://www.wma.net/what-we-do/medical-ethics/declaration-of-helsinki/), révisée en 2013, et doit être conforme aux directives institutionnelles en matière de consentement éclairé.

1. Préparation de particules lipidiques donneuses marquées par des phospholipides fluorescents

1. Formation d’un film lipidique
   ATTENTION : Préparez et distribuez des solutions mères dans une hotte chimique. Portez une blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de protection. Éliminer les solutions de chloroforme dans les déchets chimiques organiques, les solutions Triton X-100 (sans plasma) dans les déchets chimiques et les solutions contenant du plasma dans les déchets biologiques ou médicaux.
   1. Achetez des solutions lipidiques mères de chloroforme auprès d’un fournisseur ou fabriquez-les en laboratoire :
      25 mg/mL : 1,2-Dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DMPC) :
      10 mg/mL : Cholestérol
      1 mg/mL : 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-(lissaminerhodamine B sulfonyle) [LRh-PE]
      REMARQUE : Utilisez des tubes en verre hermétiques à vis. Scellez le capuchon avec du ruban téflon.
      Conserver à -20 ^°C.
   2. Déterminer la quantité de LC-CSH qui sera nécessaire et préparer le nombre approprié de tubes en verre.
      Dans une hotte chimique, ajouter les éléments suivants à chaque tube en verre borosilicaté de 10 mm et 150 mm : 472 μL de solution mère de DMPC (17,7 μmol, 11,8 mg), 339 μL de solution mère de cholestérol (8,8 μmol, 3,39 mg) et 305 μL de LRh-PE (200 nmol, 0,305 mg). Vortex brièvement pour mélanger.
   3. Dans une hotte chimique, sécher le mélange lipidique dans un tube de verre sous un léger jet de N₂ pendant 1 h, pour former un film lipidique sec au fond du tube.
      REMARQUE : Le débit de N₂ ne doit provoquer qu’une légère ondulation sur la surface du fluide.
   4. Pour les tests qui nécessitent plusieurs plaques à 96 puits pendant des jours ou des semaines, préparez un grand lot de LC-CSH qui peut être aliquote dans des tubes, ou utilisé pour fabriquer des plaques LC-CSH prêtes à l’emploi, qui sont stockées à -20 °C ou -80 °C. Voir les étapes 2.2.1 à 2.2.2 ci-dessous.
2. Revêtement de silicate de calcium hydraté avec un film lipidique fluorescent
   ATTENTION : Portez une blouse de laboratoire, des gants, un masque facial et des lunettes de protection lorsque vous manipulez de l’hydrate de silicate de calcium.
   1. Insérez un cône de papier de pesée dans le tube de verre contenant les lipides séchés. Ajoutez 80 mg de poudre d’hydrate de silicate de calcium (CSH) (réactif d’élimination des lipides) dans le tube en verre à l’aide du cône de papier peseur pour diriger la poudre vers la base du tube. Ajouter immédiatement 2 mL de solution saline normale dans le tube de verre contenant les lipides séchés et le CSH. Couvrez le haut du tube avec du parafilm.
   2. Vortex à la main pour déloger la majeure partie du lipide du fond du tube de verre. Insérez le tube de verre dans un trou pratiqué dans une plate-forme en polystyrène fixée au sommet d’un vortex. Fixez le tube à la plate-forme vortex à l’aide de ruban adhésif renforcé.
      REMARQUE : Préajustez la vitesse du vortex pour permettre au mélange de remonter à peu près à mi-hauteur du tube de verre.
   3. Vortex pendant 10 min. Après le vortex, vérifiez qu’il ne reste aucun lipide sur la paroi du tube. Si nécessaire, agitez manuellement au besoin jusqu’à ce qu’il ne reste plus de lipide. Transférez le volume total du tube en verre dans un tube conique en plastique de 15 ml, à l’aide d’une pipette de 1 ml. Lavez les parois du tube de verre avec 3 ml de solution saline supplémentaire et transférez-les dans le même tube de plastique conique de 15 ml.
3. Lavage LC-CSH
   1. Centrifuger le tube en plastique de 15 mL contenant le CSH ENROBÉ DE LIPIDES (LC-CSH) pendant 2 min à 935 × g à 4 °C pour granuler les particules donneuses. Retirez soigneusement le surnageant par aspiration intra-udessous à l’aide d’une pointe de pipette longue et très fine.
   2. Commencez par le haut du surnageant et, tout en faisant glisser lentement la pointe de la pipette le long du côté du tube, inclinez le tube pendant que le surnageant est retiré. Laissez une petite quantité (≈ 200 μL) de solution saline pour éviter l’aspiration accidentelle du LC-CSH de la pastille. Ajouter suffisamment de solution saline pour porter le volume total à 5 ml.
   3. Répétez les étapes 1.3.1 à 1.3.2 quatre fois. Après le lavage final, ajoutez suffisamment de solution saline pour porter le volume final à 2,5 ml.
      REMARQUE : Conserver chez LC-CSH les préparations à 4 °C pendant 2 semaines ou à -20 °C ou -80 °C jusqu’à 6 mois.
4. Préparation de grands lots pour plaques LC-CSH prêtes à l’emploi
   REMARQUE : Cette approche permet de préparer des plaques de mesure avec une composition de réactif uniforme à partir du même lot LC-CSH, minimisant ainsi la variabilité des mesures entre les plaques.
   1. Préparez 12 tubes LC-CSH (2,5 mL x 12 tubes) comme décrit aux étapes 1.1.1 à 1.3.2 ci-dessus. Combinez tout le contenu des 12 tubes dans un tube conique en plastique de 50 ml (volume total de 30 ml). Agiter soigneusement pour obtenir une distribution homogène des particules de LC-CSH et distribuer 6 mL dans un tube conique en plastique de 15 mL. Répétez l’opération quatre fois pour obtenir un total de 5 tubes coniques en plastique, contenant chacun 6 ml de LC-CSH.
   2. Chaque tube fournira suffisamment de LC-CSH pour fabriquer 5 plaques LC-CSH prêtes à l’emploi (contenant 50 μL par puits pour les 96 puits dans une seule plaque). Voir les étapes 2.2.1 et 2.2.2 ci-dessous.

2. Incubation d’échantillons de plasma/sérum avec des particules lipidiques de donneur marquées par des phospholipides fluorescents (LC-CSH)

1. Plaques individuelles pour une utilisation immédiate.
   1. Pipeter 75 μL de solution saline dans chaque puits d’une plaque de 0,3 mL à 96 puits en utilisant autant de puits que nécessaire pour l’ensemble d’échantillons à analyser. Pipeter 100 μL de solution saline dans des puits de contrôle négatif (NC) triples et 75 μL de solution saline dans des puits de contrôle positif (PC) dupliqués (Figure 2). Utilisez une pipette à plusieurs puits pour distribuer.
   2. Avant de distribuer le LC-CSH, faites tourner le tube en plastique de 15 ml 3 fois, 10 s chacune. À l’aide d’une pipette à un seul puits, distribuer 50 μL de LC-CSH le long du côté droit des puits contenant du sel. Distribuez rapidement 50 μL chacun dans seulement 3 puits. Répétez le protocole de vortex avant de distribuer le LC-CSH dans les 3 puits suivants.
      REMARQUE : Cette procédure est essentielle pour s’assurer que le LC-CSH lourd, qui sédimente spontanément, est suspendu de manière homogène, permettant ainsi de distribuer des quantités égales à chaque puits.
   3. Faites pivoter la plaque de 96 puits de 180° de sorte que le côté gauche des puits soit maintenant vers la droite. Pipette de 25 μL d’échantillons de plasma/sérum le long du côté droit du puits (figure 2). Pour les puits de PC, ajouter 25 μL de plasma/sérum normolipidémique humain standard de référence. Le volume total par puits pour l’analyse est de 150 μL.
      REMARQUE : Cette procédure empêche la contamination croisée du plasma/sérum avec le LC-CSH, car ils sont distribués le long des côtés opposés des puits.
   4. Fermez hermétiquement la plaque avec un film adhésif. Incuber la plaque scellée à 96 puits dans l’obscurité pendant 1 h à 37 °C à 1200 tr/min dans un thermomélangeur. Une fois l’incubation terminée, retirez la plaque du thermomélangeur et mettez-la sur de la glace. Centrifuger la plaque pendant 2 min à 4 °C (pour arrêter la réaction de transfert) à 935 g pour granuler les particules donneuses.
2. Plaques LC-CSH prêtes à l’emploi
   1. Pour l’utilisation, décongeler les plaques prêtes à l’emploi congelées (voir les étapes 1.4.1 à 1.4.2 pour la préparation des plaques) au froid (4 °C à 10 °C) pendant 2 h (ou toute la nuit si nécessaire). Centrifuger pendant 2 min à 4 °C à 935 × g pour recueillir tout le matériau (125 μL) ensemble. Retirez soigneusement le film adhésif afin de ne pas éclabousser le contenu des puits.
   2. Distribuer 25 μL d’échantillons de plasma/sérum, de sérum physiologique et de plasma humain de référence, en trois exemplaires, dans les puits appropriés (figure 1) de la plaque prête à l’emploi, sur de la glace, et sceller avec une pellicule adhésive. Incuber le puits scellé à 96 puits dans l’obscurité pendant 1 h à 37 °C à 1200 tr/min dans un thermomélangeur. Retirez la plaque du thermomixeur et mettez-la sur de la glace. Centrifuger la plaque pendant 2 min à 4 °C (pour arrêter la réaction de transfert) à 935 × g (pour granuler les particules donneuses).

Figure 2 : Distribution de réactifs dans des puits sans contamination croisée. Distribuer le plasma/sérum et le LC-CSH sur les parois opposées des puits. La contamination croisée est minimisée si la plaque est tournée de 180° après la première distribution de LC-CSH. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Mesure de l’efflux de phospholipides fluorescents vers le HDL plasmatique/sérique

1. Transfert sur une plaque noire et mesure de fluorescence
   1. Retirez délicatement le film adhésif afin de ne pas déranger la pastille LC-CSH.
      REMARQUE : En cas de rupture des granulés, centrifugez à nouveau.
   2. Transférez 50 μL de surnageant de la plaque réactionnante à 96 puits dans les puits d’une plaque à fond plat en polystyrène noir à 96 puits pour les mesures de fluorescence. Utilisez une pipette multipuits.
      REMARQUE : N’aspirez aucun LC-CSH. Si cela se produit, réinjectez dans le puits et centrifugez à nouveau.
   3. Remplissez un réservoir avec une solution saline normale. Ajouter 50 μL de solution saline dans chaque puits à l’aide d’une pipette multipuits.
   4. Préparez 1 % de TX-100 en ajoutant 90 ml d’eau distillée à 10 ml de solution mère de Triton X-100 à 10 % dans un erlenmeyer en plastique de 125 ml. Remplissez un réservoir avec 1 % de Triton-X 100.
   5. Ajoutez 100 μL de Triton X-100 à 1 % à température ambiante dans chaque puits et mélangez en pipetant doucement de haut en bas 2 à 3 fois à l’aide d’une pipette multi-puits. Évitez de former des bulles. Faites éclater les bulles avec de l’air à l’aide d’une pipette de transfert de 3 ml.
   6. Mesurez la fluorescence de Lissaminerhodamine à l’aide d’un fluorimètre (excitation de 540 nm / émission de 600 nm).
2. Calcul du %PE efflux
   1. Calcul de l’efflux d’EP
      1. %PE efflux = ([GRIPPE surnageante totale plasmatique ou sérique - GRIPPE NC surnageante]/GRIPPE totale)) × 100
         FLU = unités de fluorescence ; NC = contrôle négatif. Étant donné que seulement 50 μL des 150 μL du mélange réactionnel surnageant sont utilisés pour mesurer la fluorescence par puits, il est nécessaire de corriger comme suit :
      2. FLU surnageant total/puits = FLU mesuré de 50 μL (plaque noire) × 3
      3. GRIPPE totale par 150 μL de mélange réactionnel/puits = GRIPPE totale émise par 50 μL de LC-CSH.
         REMARQUE : La fluorescence LC-CSH est calculée comme décrit ci-dessous (étape 4.2.5).
   2. Calcul normalisé du %PE de l’efflux
      1. Utilisez le % d’efflux normalisé pour corriger la variation entre les tests effectués dans différentes conditions (c.-à-d. expérience réalisée à des jours différents, différences de lots).
      2. Utilisez cette formule pour calculer le % d’efflux PE normalisé :
         Efflux normalisé en %PE = Surnageant de l’échantillon %Valeur d’efflux PE (FLU)/surnageant de contrôle positif %Valeur FLU d’efflux PE.
      3. Utilisez du plasma humain mélangé identique provenant de donneurs sains avec un profil lipidique normal comme témoin de référence. Il n’est pas nécessaire de calculer le surnageant total FLU/well puisque cette valeur est la même pour l’échantillon et la référence.
      4. Pour les échantillons en trois exemplaires, collez les données brutes obtenues à l’étape 3.1.6 dans la feuille de calcul (tableau supplémentaire 1). Pour les échantillons en double, collez les données brutes obtenues à l’étape 3.1.6 dans la feuille de calcul (tableau supplémentaire 2).

4. Courbe standard LC-CSH

REMARQUE : La courbe standard LC-CSH est utilisée pour calculer la quantité de signal fluorescent PE présente dans l’aliquote de LC-CSH par puits. En règle générale, 50 μL de LC-CSH/puits sont utilisés. Cette valeur peut être utilisée pour calculer le % d’efflux PE vers le HDL dans un échantillon normalisé à la grippe totale (voir étape 3.2.1) présente dans le mélange réactionnel.

%PE efflux = ((unités de fluorescence de l’échantillon surnageant [FLU] - sérum physiologique surnageant) / (LC-CSH FLU totale)) x 100.

1. Dilution en série de LC-CSH
   1. Préparer des dilutions 10 fois et 100 de LC-CSH sous forme mère (comme préparé aux étapes 1.1.1 à 1.3.3) :
      Dilution 10 fois : 100 μL de LC-CSH + 900 μL de Triton X-100 à 1 %
      Dilution 100 fois : 100 μL de LC-CSH 10 fois dilué + 900 μL de Triton X-100 à 1 %
   2. Distribuer des échantillons triples de LC-CSH dilué 10 et 100 fois dans une plaque d’incubation à 96 puits pour la courbe standard (voir figure 3).
   3. Ajouter un volume suffisant de Triton X-100 à 1 % dans les puits contenant du LC-CSH pour atteindre un volume final de 200 μL (voir le tableau 1).
2. Solubilisation du LC-CSH pour la mesure de fluorescence
   1. Sceller la plaque avec un film adhésif et incuber pendant 1 h à 24 °C en secouant à 1200 tr/min. Plaque de centrifugation pendant 2 min à 4 °C à 935 × g. Retirez délicatement le film adhésif.
   2. À l’aide d’une pipette multipuits, mélangez les échantillons en pipetant vers le haut et vers le bas 2 à 3 fois. Transférez 100 μL de LC-CSH par puits sur une plaque à fond plat en polystyrène noir de 96 puits pour les mesures de fluorescence, à l’aide d’une pipette multipuits.
   3. Ajouter 100 μL par puits de Triton-X à 1 % à température ambiante dans chaque puits, à l’aide d’une pipette multipuits. Mélanger en pipetant de haut en bas 2-3x.
   4. Mesurez la fluorescence à l’aide d’un fluorimètre (excitation 540 nm / émission 600 nm).
   5. Collez les valeurs de fluorescence mesurées à l’aide du fluorimètre dans le modèle d’analyse de régression linéaire du tableau supplémentaire 1 , comme indiqué dans le fichier supplémentaire 3. Les concentrations finales de LC-CSH dans la plaque de mesure de la courbe standard sont indiquées dans le tableau 2.

Figure 3 : Plaque pour la courbe standard LC-CSH. Le LC-CSH marqué LRh-PE-dilué en série est distribué dans une plaque à 96 puits, comme indiqué. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Concentration finale	10 fois dilué	100 fois dilué	1 % Triton X-100	Total
LC-CSH	LC-CSH	LC-CSH	Détergent	Volume
(μL/puits)	(μL)	(μL)	(μL)	(μL)
10	100	0	100	200
5	50	0	150	200
2.5	25	0	175	200
1	0	100	100	200
0.5	0	50	150	200
0.25	0	25	175	200

Tableau 1 : Volumes de réactifs ajoutés aux puits de la plaque d’incubation pour la courbe standard LC-CSH.

Solubilisé	Salin	Total	Supplémentaire	Mesuré
LC-CSH	Volume	Volume	LC-CSH	LC-CSH
(μL)	(μL)	(μL)	(μL/puits)	(μL/puits)
100	100	200	10	5
100	100	200	5	2.5
100	100	200	2.5	1
100	100	200	1	0.5
100	100	200	0.5	0.25
100	100	200	0.25	0.125

Tableau 2 : Volumes de réactifs ajoutés aux puits de la plaque de mesure pour la courbe standard LC-CSH.

Résultats

Méthodes analytiques

Comme indiqué ci-dessus, les analyses d’échantillons HDL-SPE peuvent être modifiées pour différentes applications, comme démontré ci-dessous. Avant de mener des études avec des échantillons de recherche, la validation de la courbe standard LC-CSH, la reproductibilité et les tests de concentration plasmatique sont d’abord effectués afin de maîtriser les techniques requises. Tout d’abord, effectuez l’analyse de la courbe sta...

Discussion

Le HDL-C est un déterminant clé utilisé pour évaluer cliniquement le risque de maladie cardiovasculaire (MCV) et donc la nécessité d’un traitement hypolipidémiant ou d’autres traitements préventifs potentiels¹. Il a été démontré que la fonction du HDL dans l’efflux cellulaire du cholestérol in vitro est un meilleur prédicteur de l’incidence des maladies cardiovasculaires que le HDL-C⁷. Malheureusement, ce test cellulaire ne se prêt...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine	Avanti Research	850345	14:0 PC (DMPC) Soluiton au chloroforme
1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (sel d’ammonium)	Avanti Research	810150-C	Solution de chloroforme LRh-PE
Film adhésif	Applied Biosystems  ;	4306311	Film adhésif transparent MicroAmp   ;
Ruban en téflon haute densité Bay Corporation 1/2 pouce x 520	Solutions de tests médicaux	86732
Tubes en verre borosilicaté de 20 mm et aigus ; 150 mm	Fisher Scientific	14-961-33
Centrifugeuse	Thermo Scientific	Série Sorvall X Pro
Chloroforme	Sigma-Aldrich	366927	adapté aux HPLC, &ge ; 99.8%
Poudre de cholestérol	Sigma-Aldrich	C8667	3&bêta ;-hydroxy-5-cholestène, 5-cholestène-3&bêta ;-ol
Papier de pesée en verre	Cole-Palmer	; UX-01338-02	Pour la gestion du LC-CSH
Plaque d’incubation	USA Scientific & nbsp ;	1402-9700	Plaque TempDouble jupe semi-jupe à 96 puits 0,2 mL Plaques PCR   ;
Agent d’élimination des lipides (LRA)	Supelco	13358-U	LC-CSH
Plaque de mesure	Greiner bio-one  ;	655076	Microplaque, PS, 96 puits, F-BOTTOM (PUITS DE CHEMINÉE), NOIR ; FLUOTRAC, LIAISON MÉDICALE
Microsoft Excel	Microsoft 365 MSO  ;	Version 2507
Embouts de pipet MultiFlex	Fisher Scientific	50-550-206	Pour aspirer le surnageant lors des lavages LC-CSH
Lecteur de plaques multi-étiquettes	Perkin Elmer & nbsp ;	1420-050	Compteur multi-étiquettes Victor3 Wallac1420
Solution saline normale	Qualité biologique   ;	114-055-101	Pour des usages multiples   ;
Parafilm	Cole-Palmer	HS23452	Couvrir le dessus du tube de verre lors du vortex
Fioles Erlenmeyer polycabonées	Fisher Scientific	10-041-8	Pour une solution Triton-X à 10 %
Plasma humain regroupé (dérivé du sang) Héparine Li)	Innovation Research Inc	IPLAWBLIH	Plasma de référence, contrôle positif (PC) et nbsp ;
Surfact-Amps X 100  ;	Thermo Scientific	28314	10 % Triton X-100, dilué 10 fois avec de l’eau distillée
Thermomixeur	Eppendorf	5382000023	Thermomixeur C avec bloc thermique à 96 puits
Bloc intelligent thermomixeur	Eppendorf	5306000006	SmartBlock à 96 puits
Pipettes de transfert (3 mL, Falcon)	Fisher Scientific	13-711-9CM	Pour retirer les bulles du dessus du puits
Mélangeur vortex	Daigger	3030A	Porte-affixe pour tube en verre sur le dessus