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Article de méthode

Identification de biomarqueurs moléculaires liés au système immunitaire dans les troubles du spectre autistique à l’aide de la protéomique d’acquisition indépendante des données et de l’apprentissage automatique

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DOI :

10.3791/68949

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26 septembre 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Life Sciences, Hunan Normal University, 2Changsha Maternal and Child Health Hospital, Affiliated to Hunan Normal University, 3Changsha Central Hospital, Affiliated to University of South China, 4Shanghai Bioprofile Technology Co., Ltd.

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole utilisant la spectrométrie de masse d’acquisition indépendante des données et l’apprentissage automatique qui a identifié huit protéines liées au système immunitaire comme biomarqueurs précis pour le diagnostic précoce des troubles du spectre autistique, validé par un test immuno-enzymatique.

Résumé

Cette étude présente un protocole reproductible pour identifier les biomarqueurs protéiques sériques associés aux troubles du spectre autistique (TSA) à l’aide de la spectrométrie de masse d’acquisition indépendante des données (DIA) combinée à l’apprentissage automatique (ML). La DIA permet un profilage non biaisé et à haute résolution du protéome sérique, y compris des protéines de faible abondance, tout en garantissant la reproductibilité d’un échantillon à l’autre. Des approches d’apprentissage automatique ont été appliquées pour sélectionner des panels de protéines informatives sur le plan diagnostique et améliorer la robustesse du modèle. L’analyse a porté sur le sérum de 99 enfants atteints de TSA et de 70 témoins du même âge. Les protéines à haute abondance ont été épuisées, les peptides ont été préparés à l’aide de procédures normalisées de digestion et de fractionnement, et l’analyse divisionnaire a été réalisée sur un spectromètre de masse à haute résolution. Le traitement et la quantification des données ont permis d’identifier des protéines exprimées de manière différentielle, qui ont fait l’objet d’une analyse d’enrichissement fonctionnel. Huit protéines liées au système immunitaire sont apparues comme de solides candidats pour le développement de biomarqueurs. Un modèle de régression logistique entraîné sur ces protéines a atteint une précision de 95,27 %, une valeur Kappa de 0,9025 et une AUC de 1,000 en validation croisée. Ces résultats démontrent le potentiel de la protéomique basée sur la DIA, combinée à l’apprentissage automatique, en tant que cadre solide pour la découverte de biomarqueurs dans les TSA et pour l’adaptation dans la recherche clinique plus large.

Introduction

Le trouble du spectre autistique (TSA) est un groupe de troubles neurodéveloppementaux précoces caractérisés par une hétérogénéité d’étiologie et de présentation clinique. Les caractéristiques principales comprennent des déficits persistants dans la communication et l’interaction sociales, ainsi que des comportements, des intérêts ou des activités restreints et répétitifs. Aux États-Unis, la prévalence est d’environ 2,3 % chez les enfants de 8 ans et d’environ 2,2 % chez les adultes, ce qui souligne son impact sur la santé publique 1,2,3,4. Les facteurs de risque sont divers, notamment les prédispositions génétiques, la dysrégulation immunitaire et les expositions environnementales prénatales 5,6,7. Un diagnostic et une intervention précoces peuvent améliorer considérablement les résultats du développement, ce qui fait de l’identification de biomarqueurs objectifs et fiables un objectif majeur de la recherche sur les TSA 8,9,10. Ce protocole s’appuie sur nos travaux précédemment publiés, appliquant la protéomique d’acquisition indépendante des données (DIA) et l’apprentissage automatique pour identifier les protéines immunitaires comme biomarqueurs potentiels pour le diagnostic précoce des TSA11.

Malgré des efforts considérables, il n’existe actuellement aucun biomarqueur spécifique et universellement validé pour le diagnostic clinique des TSA12. Les candidats proposés, tels que les altérations du microbiome intestinal13, l’élévation de l’interleukine-6 (IL-6)14, les modifications du facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF)15 et les marqueurs de stress oxydatif comme le glutathion16, restent préliminaires et manquent de reproductibilité pour une utilisation clinique. La protéomique est apparue comme une approche prometteuse pour identifier les signatures moléculaires spécifiques à la maladie, et plusieurs études ont examiné différents échantillons biologiques (sang, salive, urine, PBMC) pour les protéines exprimées de manière différentielle 8,17,18,19,20,21,22 . Par exemple, Bao et al. ont démontré que les protéines inflammatoires identifiées par la protéomique d’Olink peuvent aider au diagnostic précoce des TSA (17), tandis que d’autres études suggèrent que les voies protéomiques et métaboliques partagées peuvent produire des biomarqueurs robustes malgré l’hétérogénéité génétique des TSA23.

La spectrométrie de masse DIA a attiré de plus en plus l’attention pour son profilage protéique complet et reproductible. Contrairement à l’acquisition dépendante des données (DDA) traditionnelle, qui fragmente sélectivement les ions les plus intenses, la DIA fragmente tous les ions précurseurs dans des fenêtres m/z prédéfinies. Cela permet une couverture protéomique plus profonde et une reproductibilité améliorée dans de grandes cohortes, un avantage clé pour les comparaisons cliniques14. Des études comparatives montrent que la DIA détecte plus de peptides quantifiables que la DDA, en particulier pour les protéines de faible abondance, avec une variation plus faible entre les cycles14.

S’appuyant sur ces avancées, nous avons appliqué l’analyse protéomique basée sur la DIA à des échantillons de sérum de 99 enfants atteints de TSA et de 70 témoins, après épuisement des protéines à haute abondance. Nos résultats mettent en évidence le potentiel des protéines immunitaires en tant que marqueurs moléculaires pour le diagnostic précoce des TSA et démontrent la valeur de la protéomique basée sur le DIA dans la découverte de biomarqueurs lorsqu’elle est associée à une méthodologie rigoureuse11.

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Protocole

Le protocole a été mis en œuvre conformément à la Déclaration d’Helsinki et a été approuvé par le Conseil d’examen institutionnel de l’hôpital de santé maternelle et infantile de Changsha ; Un consentement éclairé a été obtenu des sujets.

1. Identification des enfants autistes avec le DSM-5

  1. Collecte d’informations sur les antécédents médicaux et les antécédents
    1. Histoire du développement
      1. Recueillir des informations sur le développement précoce du patient, y compris la progression du langage, des compétences sociales et motrices.
      2. Notez tout retard ou anomalie du développement (par exemple, retard de langage, difficultés d’interaction sociale).
    2. Antécédents familiaux
      1. Renseignez-vous sur tout antécédent familial d’autisme ou d’autres troubles neurodéveloppementaux.
    3. Niveau fonctionnel actuel
      1. Évaluez les performances du patient dans la vie quotidienne, y compris l’apprentissage, le travail, les interactions sociales et les compétences de vie autonome.
  2. Utilisation des critères de diagnostic du DSM-5
    1. Déficits persistants en matière de communication sociale et d’interaction sociale
      1. Assurez-vous qu’au moins deux des trois critères suivants sont remplis :
        1. Les déficits de réciprocité socio-émotionnelle sont dus à un manque de contact visuel, d’expressions faciales ou de langage corporel normaux et à la difficulté à nouer des amitiés ou des relations adaptées à l’âge.
        2. Déficits dans les comportements de communication non verbale - recherchez des défis dans l’utilisation des gestes, des expressions faciales ou du ton de la voix pour transmettre des émotions et une compréhension limitée des indices non verbaux des autres.
        3. Les déficits dans le développement, le maintien et la compréhension des relations sont la recherche d’une difficulté à s’adapter à différents contextes sociaux et d’un manque d’intérêt pour les pairs ou d’une incapacité à s’engager dans un jeu imaginatif.
    2. Modèles de comportement, d’intérêts ou d’activités restreints et répétitifs
      1. Assurez-vous qu’au moins deux des quatre critères suivants sont remplis :
        1. Mouvements moteurs stéréotypés ou répétitifs (p. ex., battement des mains, balancement du corps ou utilisation répétitive d’objets).
        2. L’insistance sur la similitude ou les modèles de comportement ritualisés - recherchez une détresse extrême pour des changements mineurs dans la routine.
        3. Intérêts très restreints et fixes - recherchez une concentration anormalement intense sur des sujets ou des activités spécifiques.
        4. Hyper- ou hyporéactivité aux entrées sensorielles - recherchez des réponses atypiques aux stimuli sensoriels tels que les sons, les lumières ou le toucher.
  3. Évaluation de l’apparition et de la gravité des symptômes
    1. Moment de l’apparition des symptômes - confirmer que les symptômes étaient présents dans la petite enfance (généralement avant l’âge de 3 ans), même s’ils deviennent plus apparents plus tard.
    2. Impact des symptômes - confirmer que les symptômes causent une altération significative du fonctionnement social, professionnel ou d’autres domaines importants.
    3. Niveaux de gravité
      REMARQUE : Selon le DSM-5, la gravité des TSA est classée en trois niveaux (tableau supplémentaire S1).
      1. Classer au niveau 1 si le patient n’a besoin que d’un soutien léger.
      2. Classer au niveau 2 si le patient a besoin d’un soutien substantiel (modéré).
      3. Classer au niveau 3 si le patient nécessite un soutien très important (sévère).
  4. Exclusion d’autres causes potentielles
    1. Effectuer les évaluations médicales nécessaires (p. ex., tests génétiques, imagerie cérébrale) afin d’exclure d’autres affections qui pourraient causer des symptômes similaires (p. ex., syndromes génétiques, déficiences auditives, déficiences intellectuelles).
    2. Évaluation de la comorbidité : Évaluez la présence de comorbidités (p. ex., trouble déficitaire de l’attention avec hyperactivité, troubles anxieux, dépression, épilepsie, etc.).

2. Préparation de l’échantillon pour l’analyse par spectrométrie de masse DIA

  1. Respect de l’éthique et prélèvement d’échantillons
    1. Obtenir le consentement éclairé des parents ou des tuteurs légaux d’enfants âgés de 3 à 7 ans diagnostiqués avec un trouble du spectre de l’autisme (TSA).
    2. Classer les patients dans les niveaux de gravité 1 à 3 selon les critères diagnostiques décrits dans le DSM-5 américain pour l’autisme (étape 1.3.3).
    3. Prélever des échantillons de sérum auprès des participants. Assurez-vous que tous les échantillons sont traités dans les quatre heures suivant le prélèvement sanguin afin d’éviter la dégradation des protéines. Conservez les échantillons sur de la glace pendant le traitement.
  2. Élimination des protéines de haute abondance
    1. Utilisez une trousse commerciale pour épuiser les protéines à haute abondance à partir de 60 μL de sérum par échantillon, en suivant les instructions du fabricant. Brièvement, équilibrez la colonne d’appauvrissement avec un tampon de liaison, chargez l’échantillon de sérum et laissez-le passer à travers la colonne sous l’effet gravitaire. Récupérez le flux, qui contient la fraction protéique de faible abondance.
    2. Mesurez la concentration totale en protéines à l’aide d’un test BCA. Normaliser tous les échantillons à une concentration finale de 0,5 à 1,0 μg/μL avant la digestion en solution. Assurez-vous que chaque échantillon contient au moins 100 μg de protéines pour l’analyse ultérieure.
  3. Digestion des protéines
    REMARQUE : La digestion des protéines a été effectuée à l’aide de la méthode FASP décrite par Wisniewski et al.24.
    1. Ajoutez le détergent, le dithiothréitol (DTT) et l’iodoacétamide (IAA) dans le tampon UA (tampon d’urée) pour bloquer la cystéine réduite.
    2. Digérer la suspension protéique avec de la trypsine dans un rapport de 50:1 pendant la nuit à 37 °C.
  4. Dessalage des peptides, nettoyage et fractionnement en phase inverse à pH élevé
    1. Centrifuger les mélanges peptidiques à 16 000 × g pendant 15 min à °C pour éliminer les débris insolubles.
    2. Transférez le surnageant (contenant des peptides digérés) dans un nouveau tube de microcentrifugation à faible liaison pour minimiser les pertes par adsorption.
    3. . Préparez des microcolonnes en C18 (remplies en interne de résine C18) en les préconditionnant avec du méthanol à 100 % (20 μL) et en les équilibrant avec 0,1 % (v/v) d’acide trifluoroacétique (TFA) dans de l’eau (tampon A ; 20 μL).
    4. Chargez l’échantillon de peptide sur la microcolonne. Lavez la colonne avec 20 μL de tampon A pour éliminer les sels, les détergents et les contaminants non peptidiques.
    5. Éluer les peptides purifiés avec 20 μL d’acétonitrile à 80 % contenant 0,1 % d’AGF.
    6. Sécher les peptides élués sous vide à l’aide d’un concentrateur centrifuge. Conservez les peptides séchés à -8 °C jusqu’à nouvel ordre.
    7. Reconstituer les peptides séchés dans de l’acide formique à 0,1 % avant l’analyse LC-MS/MS.
    8. 2.4.8Quantifier la concentration peptidique en mesurant l’absorbance à 280 nm (DO280) à l’aide d’un spectrophotomètre, en tenant compte des contributions des résidus de tryptophane et de tyrosine pour une quantification précise.
      Pour fractionner des mélanges peptidiques à l’aide d’une HPLC en phase inverse à pH élevé, utilisez une colonne C18 (3,5 μm, 2,1 x 150 mm) sur un système HPLC avec un débit de 0,3 mL/min, phase mobile A : 10 mM de formiate d’ammonium dans l’eau, pH 10 (ajusté avec de l’hydroxyde d’ammonium), phase mobile B : 10 mM de formiate d’ammonium dans de l’acétonitrile à 90 %, pH 10. Effectuez une élution en gradient pour collecter 60 fractions par échantillon sur ~60 min.
    9. Combinez toutes les trois fractions pour réduire la redondance, ce qui donne 20 fractions regroupées par échantillon. Séchez chaque fraction regroupée sous vide pour une analyse en aval.
      REMARQUE : Les fractions peptidiques résultantes sont maintenant prêtes pour l’analyse nano-LC-MS/MS.

3. Demande d’analyse par spectrométrie de masse DIA

  1. Analyse par spectrométrie de masse DIA
    1. Augmenter le peptide d’acquisition dépendante des données (DDA) de la fraction HPRP avec des peptides standard iRT et les séparer à l’aide de la chromatographie liquide à haute performance en phase inverse (RP-HPLC) sur un système nano-HPLC avec une colonne (75 μm x 150 mm ; 2 billes de C18 μm, 120 Å) à un débit de 300 nL/min avec phase mobile A : 0,1 % d’acide formique dans l’eau, phase mobile B : 0,1 % d’acide formique dans de l’acétonitrile à 95 %.
    2. Éluer les peptides sur 60 min avec un gradient linéaire du tampon B défini comme suit : 0 - 2 min, gradient linéaire de 2 % à 5 % du tampon B ; 2 à 42 min, gradient linéaire de 5 % à 20 % de tampon B ; 42 - 50 min, gradient linéaire de 20 % à 35 % de tampon B ; 50 - 52 min, gradient linéaire de 35 % à 90 % du tampon B ; 52 à 60 min, le tampon B maintenu à 90 %.
    3. Analysez les peptides élués sur le spectromètre de masse référencé. Acquérir des données MS à l’aide d’une méthode top20 dépendante des données, en choisissant dynamiquement les ions précurseurs les plus abondants du balayage du relevé (350 - 1500 m/z) pour la fragmentation du HCD.
    4. Exécutez l’instrument avec le mode de reconnaissance des peptides activé. Utilisez une masse de verrouillage de 445.120025 Da comme étalon interne pour l’étalonnage de la masse. Obtenez les balayages MS complets à une résolution de 70 000 à m/z 200 et de 17 500 à m/z 200 pour le balayage MS/MS. Réglez le temps d’injection maximal à 50 ms pour MS et 30 ms pour MS/MS, l’énergie de collision normalisée à 28, la fenêtre d’isolement à 1,6 th et la durée d’exclusion dynamique à 30 s.
  2. Analyse LC-MS/MS pour l’acquisition indépendante des données (DIA)
    1. Enrichissez les peptides de chaque échantillon avec iRT de manière égale et séparée.
    2. Réaliser des LC-MS/MS sur un spectromètre de masse quadripolaire couplé à un système nano-HPLC. Définissez la condition LC de la même manière que pour la méthode DDA ci-dessus. Effectuez un balayage de levé de 400 à 1 200 m/z à une résolution de 60 000 avec une cible AGC de 3E6 et un temps d’injection de 30 ms. Acquérez les balayages DIA MS/MS à une résolution de 15 000 avec une fenêtre d’isolation de 20 m/z et avec une cible AGC de 1E6 et un temps d’injection de 50 ms. Réglez l’énergie de collision normalisée sur 30.
    3. Enregistrez les spectres des balayages MS et DIA complets dans les types de profil et de centroïde, respectivement.
  3. Recherche dans la base de données de séquences
    1. Analyser les données DDA MS à l’aide du logiciel DIA2.
    2. Recherchez les données MS dans la base de données humaine UniProtKB (186 532 entrées au total, téléchargée le 10/2019), enrichie de protéines composées de 11 séquences peptidiques iRT.
    3. Sélectionnez la trypsine comme enzyme de digestion. Définissez les deux sites de clivage manqués maximaux et la tolérance de masse de 4,5 ppm pour les ions précurseurs et de 20 ppm pour les ions fragment pour la recherche dans la base de données. Définir la carbamidométhylation des cystéines comme une modification fixe et l’acétylation de la protéine N-terminale et l’oxydation de la méthionine comme des modifications variables pour la recherche dans les bases de données.
    4. Filtrez les résultats de recherche dans la base de données et exportez-les avec un taux de fausses découvertes (FDR) de <1 % aux niveaux appariés au spectre peptide et aux protéines, respectivement.
  4. Effectuer le traitement des données brutes
    1. Les données de la DIA MS ont été analysées avec le logiciel DIA [34, 35] pour une génération de bibliothèque spectrale à partir des résultats de recherche. Utilisez les paramètres par défaut pour la recherche et l’iRT dynamique pour la prédiction du temps de rétention. Assurez-vous que la correction des interférences pour le balayage MS/MS est activée.
    2. Exporter les résultats avec <1 % de FDR au niveau peptidique.

4. Analyse différentielle des protéines

  1. Effectuez des tests d’hypothèse à l’aide du test t de Student combiné au changement de pli (FC) à http://www.omickits.com/open/tooldetail?id=70.
    1. Connectez-vous à la plateforme cloud et accédez à l’outil d’analyse des tests d’hypothèses . Téléchargez le fichier de données de quantification des protéines prétraité (par exemple, au format CSV ou TXT).
    2. Dans les paramètres définis, sélectionnez le test t de Student comme méthode statistique et le seuil de signification à la valeur p < 0,05. Définissez le seuil de changement de pli comme FC > 1,5 ou FC < 1/1,5. Cliquez sur Exécuter l’analyse et attendez que les résultats soient générés.
    3. Téléchargez le fichier de sortie contenant les valeurs p, log2(FC) et l’état de signification de chaque protéine.
      REMARQUE : Cette approche à double critère équilibre la signification statistique et la pertinence biologique, garantissant une identification robuste des protéines exprimées différentiellement (DEP).

5. Analyse du chemin du signal

  1. Visualisation du tracé du volcan
    1. Accédez à l’outil à l’http://www.omickits.com/open/tooldetail?id=63 puis à la page de l’outil Tracé du volcan .
      1. Téléchargez le fichier de résultats de l’analyse DEP à partir de la section 4.
      2. Configurer le paramètre de visualisation : Axe X : log2(Fold Change) - indique la direction du changement ; Axe des Y : -log10(p-value) - reflète la signification statistique ; Code couleur : Rouge : protéines significativement régulées à la hausse (p < 0,05 et FC > 1,5) ; Bleu : protéines significativement régulées à la baisse (p < 0,05 et FC < 0,667) ; Gray : protéines non significatives (p ≥ 0,05 ou 1/1,5 ≤ FC ≤ 1,5).
      3. Cliquez sur Générer une image et téléchargez l’image haute résolution (format PDF/SVG) pour la publication.
  2. Carte thermique de clustering hiérarchique
    1. Accédez à l’outil à l’http://www.omickits.com/open/tooldetail?id=17
      1. Accédez à l’outil de carte thermique de clustering .
      2. Chargez la matrice d’expression DEP filtrée.
      3. Définissez les paramètres suivants : Méthode de normalisation : score Z par ligne pour éliminer les différences d’échelle ; Distance métrique : distance euclidienne ; Méthode de clustering : regroupement hiérarchique de liaison complète ; Facultatif : activez le clustering de colonnes et/ou de lignes en fonction du regroupement d’échantillons.
      4. Cliquez sur Exécuter pour générer la carte thermique.
      5. Téléchargez et enregistrez la carte thermique en tant qu’image prête à être publiée.
        REMARQUE : La carte thermique représente visuellement la similitude et la divergence des modèles d’expression des protéines entre les échantillons.
  3. Analyse fonctionnelle d’annotation et d’enrichissement GO
    1. Installez et chargez les packages R requis :
      library(clusterProfiler)
      library(org. Hs.eg.db)
      Bibliothèque(ggplot2)
    2. Convertissez les identifiants de protéines (par exemple, Uniprot ou symboles de gènes) en identifiants Entrez :
      entrez_ids <- bitr(diff_proteins, fromType = « UNIPROT », toType = « ENTREZID », OrgDb = org. Hs.eg.db)
    3. Effectuer une analyse d’enrichissement GO :
      go_enrich <- enrichGO(gene = entrez_ids$ENTREZID, OrgDb = org. Hs.eg.db, keyType = « ENTREZID », ont = « BP »)
    4. Visualisez les résultats à l’aide de diagrammes à points :
      1. dotplot(go_enrich, showCategory = 20)
        Formule:
        Facteur riche = (a/b) / (c/d)
        Où:
        a = nombre de PED annotés au terme ;
        b = nombre total de PED ;
        c = nombre de protéines de fond annotées au terme ;
        d = nombre total de protéines de fond.
  4. Analyse de l’annotation et de l’enrichissement du parcours KEGG
    1. Effectuer l’analyse d’enrichissement de KEGG :
      kegg_enrich <- enrichKEGG(gène = entrez_ids$ENTREZID, organisme = « a »)
    2. Visualisez les résultats du parcours KEGG :
      barplot(kegg_enrich, showCategory = 20)
    3. Personnalisez les tracés à l’aide de ggplot2 pour le formatage de la publication.

6. Criblage initial des protéines à l’aide de l’analyse de la courbe ROC

  1. Préparation des données : Chargez l’ensemble de données protéomiques contenant toutes les protéines exprimées différentiellement (DEP) identifiées à partir des groupes de troubles du spectre autistique (TSA) et de contrôle. Assurez-vous que l’ensemble de données comprend des valeurs d’expression protéique pour les deux groupes, avec des étiquettes claires indiquant les échantillons ASD et de contrôle.
  2. Effectuez une analyse de la courbe ROC.
    1. Utilisez le package pROC dans R pour effectuer une analyse de la courbe ROC (Receiver Operating Characteristic) pour chaque protéine.
    2. Évaluez la capacité de chaque protéine à faire la distinction entre l’ASD et les groupes témoins en calculant l’aire sous la courbe (AUC).
      AUC = 0,5 : Pas de discrimination (équivalent au hasard).
      0,7 ≤ AUC < 0,8 : Discrimination acceptable.
      0,8 ≤ AUC < 0,9 : Excellente discrimination.
      AUC ≥ 0,9 : Discrimination flagrante.
      REMARQUE : L’ASC représente la probabilité qu’un individu sélectionné au hasard dans le groupe TSA ait un taux de protéines plus élevé qu’un individu sélectionné au hasard dans le groupe témoin. Une AUC plus élevée indique une meilleure performance diagnostique, avec des valeurs supérieures à 0,8 généralement considérées comme cliniquement significatives dans les études de biomarqueurs.
    3. Enregistrez les valeurs de l’ASC pour toutes les protéines.
  3. Sélectionnez les biomarqueurs candidats.
    1. Identifier les protéines dont l’AUC est supérieure à 0,7 en tant que biomarqueurs candidats.
    2. Exporter la liste des biomarqueurs candidats pour une analyse plus approfondie.
  4. Visualisez les résultats.
    1. Utilisez le package ggplot2 dans R pour créer des visualisations des courbes ROC pour les protéines les plus performantes.
    2. Incluez les valeurs AUC dans les légendes des parcelles pour plus de clarté.

7. Criblage secondaire à l’aide de la forêt aléatoire

  1. Préparez les données d’entrée.
    1. Utiliser la liste des biomarqueurs candidats obtenus à partir de l’analyse ROC comme données d’entrée pour l’analyse aléatoire des forêts.
    2. Assurez-vous que l’ensemble de données est formaté de manière appropriée, avec des lignes représentant des échantillons et des colonnes représentant des valeurs d’expression de protéines.
  2. Entraîner le modèle de forêt aléatoire.
    1. Appliquez l’algorithme de forêt aléatoire à l’aide du package randomForest dans R.
    2. Définissez le nombre d’arbres (ntree) sur 500 et le nombre de variables échantillonnées de manière aléatoire à chaque division (mtry) sur la racine carrée du nombre total d’entités.
    3. Évaluez l’importance d’une caractéristique à l’aide de la métrique MeanDecreaseAccuracy, qui mesure la réduction de la précision du modèle lorsqu’une fonction spécifique est supprimée.
    4. Entraînez un modèle de forêt aléatoire à l’aide du package randomForest dans R :
      R. library(randomForest)
      # Exemple : prédire le groupe (p. ex., TSA vs témoin) à l’aide des niveaux de protéines
      rf_model <- randomForest(x = protein_data,
      y = as.factor(groupe),
      importance = TRUE, # Requis pour calculer l’importance de la caractéristique
      ntree = 500) # Nombre d’arbres
    5. Extrayez les métriques d’importance des fonctionnalités à l’aide de la fonction importance() :
      R. importance_scores <- importance(rf_model)
    6. Récupérez les valeurs MeanDecreaseAccuracy et triez-les par ordre décroissant :
      R. mean_dec_acc <- importance_scores[ , « MeanDecreaseAccuracy"]
      importance_rank <- sort(mean_dec_acc, décroissant = VRAI)
    7. Visualisez l’importance des fonctionnalités à l’aide de la fonction intégrée varImpPlot() :
      R. varImpPlot(rf_model, main = « Importance de la caractéristique (diminution moyenne de la précision) »)
      REMARQUE : La métrique MeanDecreaseAccuracy reflète l’importance de chaque fonctionnalité pour les performances prédictives du modèle. Une forte diminution de la précision lors du retrait indique une grande importance. Cette approche est particulièrement utile pour la découverte de biomarqueurs, car elle permet de hiérarchiser les protéines ou les gènes ayant le plus fort pouvoir discriminant entre les groupes.
    8. Exportez les scores d’importance pour le reporting ou l’analyse en aval :
      R. importance_table <- data.frame(
      Caractéristique = noms(importance_rank),
      MeanDecreaseAccuracy = importance_rank
      )
      write.csv(importance_table, « feature_importance.csv », row.names = FAUX)
    9. Classez les protéines en fonction de leurs scores MeanDecreaseAccuracy.
    10. Sélectionnez les 15 protéines ayant les scores MeanDecreaseAccuracy les plus élevés comme caractéristiques les plus significatives pour la modélisation ultérieure.
    11. Exportez la liste de ces protéines pour une validation ultérieure.
      REMARQUE : Les protéines dont les valeurs MeanDecreaseAccuracy sont faibles peuvent avoir un impact minime sur les performances du modèle si elles sont supprimées.
    12. Mettre en évidence la pertinence biologique des protéines sélectionnées, en particulier celles liées aux fonctions immunitaires ou aux voies impliquées dans les TSA.

8. Combinez les résultats pour la sélection finale des biomarqueurs.

REMARQUE : Assurez-vous que R est installé avec les packages suivants : pROC, randomForest et ggplot2. Assurez-vous que le jeu de données protéomiques est prétraité et normalisé avant l’analyse. Enregistrez les listes de biomarqueurs candidats et les graphiques de visualisation dans des fichiers séparés à titre de référence.

  1. Intégrez les résultats.
    1. Croisez les résultats de l’analyse ROC et du criblage aléatoire des forêts pour identifier les protéines qui se chevauchent.
    2. Privilégiez les protéines qui apparaissent dans les deux analyses comme des biomarqueurs candidats très fiables.
    3. Effectuez des étapes de validation supplémentaires, telles que la validation croisée sans exclusion (LOOCV), pour confirmer la robustesse des biomarqueurs sélectionnés.
    4. Utilisez des modèles de régression logistique pour évaluer la précision prédictive de l’ensemble de biomarqueurs combinés.
    5. Créez des courbes ROC et des tracés de rappel de précision pour l’ensemble final de biomarqueurs à l’aide du package ggplot2.
    6. Inclure des paramètres tels que l’AUC et les valeurs de rappel de précision pour démontrer le potentiel diagnostique des biomarqueurs sélectionnés.

9. Sélection bidirectionnelle des caractéristiques

  1. Préparez les données et définissez le modèle.
    1. Chargez l’ensemble de données contenant les valeurs d’expression des protéines et les étiquettes correspondantes (par exemple, TSA ou contrôle). Assurez-vous que l’ensemble de données est prétraité et normalisé.
    2. Définir le modèle initial : utilisez un modèle linéaire généralisé (GLM) avec une famille binomiale pour la classification.
    3. Utilisez AIC comme mesure d’évaluation pour comparer les modèles lors de la sélection des fonctionnalités.
  2. Effectuez la sélection de fonction en avant.
    1. Commencez avec un modèle vide contenant uniquement le terme d’interception.
    2. Ajoutez une fonctionnalité à la fois en fonction de la plus grande réduction de l’AIC.
    3. Notez la valeur AIC après chaque ajout. Arrêtez lorsqu’aucune réduction supplémentaire de l’AIC n’est observée.
  3. Effectuez la sélection de fonctions vers l’arrière.
    1. Entraîner un modèle à l’aide de toutes les fonctionnalités disponibles.
    2. Supprimez une fonctionnalité à la fois en fonction de la plus petite augmentation de l’AIC.
    3. Enregistrez la valeur AIC après chaque retrait. Arrêtez lorsqu’aucune réduction supplémentaire de l’AIC n’est observée.
    4. Combinez les pas en avant et en arrière.
  4. Alternez entre la sélection avant et arrière.
    1. Effectuez une série de sélection de fonctions avant, suivie immédiatement d’une série de sélection de fonctions arrière. Répétez ce processus jusqu’à ce qu’aucune autre amélioration de l’AIC ne soit observée.
    2. Autre approche : commencez par la sélection de caractéristiques vers l’arrière, puis effectuez la sélection de caractéristiques vers l’avant. Évaluez l’effet de l’ajout de fonctions précédemment supprimées dans le modèle.
  5. Finalisez les fonctionnalités sélectionnées.
    1. Exportez la liste finale des entités sélectionnées et leurs coefficients correspondants (figure supplémentaire S1).

10. Validation croisée de la sélection de caractéristiques bidirectionnelles à l’aide de la régression logistique avec la méthode leave-one-out

REMARQUE : Assurez-vous que R est installé avec les packages suivants : caret, pROC et ggplot2. L’ensemble de données protéomiques doit être prétraité et normalisé avant l’analyse. Enregistrez la matrice de confusion, la courbe ROC et le résumé du modèle dans des fichiers distincts à titre de référence.

  1. Préparez les données et définissez le modèle.
    1. Chargez l’ensemble de données contenant les valeurs d’expression des protéines et les étiquettes correspondantes (par exemple, ASD vs. contrôle) à partir du fichier GLMSTEP/bothFitModel.txt. Assurez-vous que l’ensemble de données est prétraité et normalisé.
    2. Définissez le modèle initial à l’aide d’un modèle linéaire généralisé (GLM) avec une famille binomiale pour la classification.
    3. Utilisez la précision et le coefficient Kappa comme mesures d’évaluation pour évaluer les performances du modèle lors de la validation croisée.
  2. Effectuez une validation croisée de type « leave-one-out ».
    1. Initialisez la validation croisée à l’aide du package d’insertion dans R pour implémenter la validation croisée LOOCV (Leave-one-Out).
    2. Ajustez le modèle de régression logistique à l’aide des huit entités sélectionnées.
    3. Notez la précision et le coefficient Kappa pour chaque itération de validation croisée.
  3. Analysez les résultats de la validation croisée.
    1. Résumez les résultats.
      REMARQUE : Les résultats du processus LOOCV ressembleront (comme dans cette étude) : Modèle linéaire généralisé, 169 échantillons, 8 prédicteurs, 2 classes : 'A', 'B', Rééchantillonnage : Leave-One-Out Cross-Validation , Résumé des tailles d’échantillon : 168, 168, 168, 168, 168, 168, ... , Résultats du rééchantillonnage : Précision Kappa 0.9526627 0.9024531.
    2. Interprétez les métriques.
      REMARQUE : Ici, le modèle a atteint une précision de 0,9527 et un coefficient Kappa de 0,9025, indiquant une excellente concordance entre les résultats prédits et observés.
      1. Regardez le coefficient Kappa pour évaluer le pouvoir prédictif du modèle. Le coefficient Kappa est compris entre -1 et 1, où 0 indique une prédiction aléatoire et 1 indique une concordance parfaite.
        REMARQUE : Dans cette étude, la valeur Kappa de 0,9025 reflète le fort pouvoir prédictif du modèle.
  4. Évaluez les coefficients du modèle.
    1. Examinez les coefficients du modèle de régression logistique pour comprendre la contribution de chaque caractéristique. Évaluez l’écart nul, l’écart résiduel et l’AIC pour confirmer l’ajustement du modèle.
      REMARQUE : Par exemple, dans cette étude, nous avons obtenu une déviance nulle : 2,2928e+02 sur 168 degrés de liberté, une déviance résiduelle : 2,2378e-07 sur 160 degrés de liberté, AIC : 18, nombre d’itérations de score de Fisher : 25.
  5. Visualisez les résultats.
    1. Créez une matrice de confusion pour visualiser les performances prédictives du modèle.
    2. Tracez la courbe ROC (Receiver Operating Characteristic) pour évaluer les performances de classification du modèle.
    3. Interpréter le résultat s. Calculer l’aire sous la courbe (AUC) pour obtenir l’indice de performance de classification du modèle.
      REMARQUE : La courbe ROC illustre le compromis entre le taux de vrais positifs et le taux de faux positifs. L’aire sous la courbe (AUC) doit être proche de 1, ce qui indique d’excellentes performances de classification. La courbe ROC reflète les variations du taux de vrais positifs et du taux de faux positifs du modèle à différents seuils. Plus la valeur AUC est élevée, meilleures sont les performances du modèle.

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Résultats

L’étude a porté sur 99 enfants atteints de TSA et 70 témoins appariés selon l’âge (3 à 7 ans), avec une répartition équilibrée selon le sexe (tableau supplémentaire S2). Le sérum a été prélevé après le jeûne d’une nuit selon des protocoles standardisés : le sang a été prélevé dans des tubes séparateurs de sérum, laissé coaguler à température ambiante pendant 30 min, puis centrifugé à 1 500 × g pendant 10 min à 4 °C. Le surnageant a été aliquote et stocké à −80 °...

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Discussion

Le protocole décrit dans ce manuscrit décrit une approche complète pour identifier les biomarqueurs moléculaires liés au système immunitaire dans les troubles du spectre autistique (TSA) à l’aide de techniques d’acquisition indépendante des données (DIA), de spectrométrie de masse et d’apprentissage automatique. Les étapes importantes du protocole garantissent des résultats fiables et reproductibles, tout en mettant en évidence les domaines où des modifications ou un dépannage peuvent êt...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Merci à tous les membres du laboratoire central et à ceux qui ont aidé à ce projet.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
réactifs et produits chimiquesAcétonitrile (grade HPLC)Fisher ScientificA18-50
réactifs et produits chimiquesLe bicarbonate d’ammonium (NH ? HCO ?)Sigma-Aldrich38939
réactifs et produits chimiquesFormiate d’ammoniumSigma-Aldrich90265
réactifs et produits chimiquesAlbumine sérique bovine (BSA)Thermo Fisher Scientific23212
réactifs et produits chimiquesDithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815
réactifs et produits chimiquesAcide formique (0,1 %)Thermo Fisher Scientific28905
réactifs et produits chimiquesIodoacétamide (IAA)Sigma-AldrichI1149
réactifs et produits chimiquesMéthanol (grade HPLC)Fisher ScientificRéf. A452-4
réactifs et produits chimiquesAcide trifluoroacétique (TFA)Sigma-AldrichRéf. T6508
réactifs et produits chimiquesUréeSigma-AldrichRéférence U5378
Kits et réactifs spécialisésKit de dosage des protéines BCAThermo Fisher Scientific23227
Kits et réactifs spécialisésCartouches C18 Sep-PakEauxWAT023590
Kits et réactifs spécialisésC18 StageTips (fait maison)3M Empore&commerce ;
Kits et réactifs spécialisésKit d’épuisement des protéines à haute abondanceMillipore Sigma122642
Kits et réactifs spécialisésPeptides étalons iRTBiognosys AG
Kits et réactifs spécialisésLysozyme ELISA KitWuhan Fine Biotech Co.Ltée
Kits et réactifs spécialisésMélange d’enzymes trypsine/lysCPromegaRéf. V5071
équipementCentrifugeuseEppendorfRéférence 5430R
équipementSystème Easy-nLC 1200Thermo Fisher Scientific
équipementSpectrophotomètre Nanodrop OneThermo Fisher ScientificND-ONE-W
équipementQ Spectromètre de masse Exactive HF-XThermo Fisher Scientific
équipementConcentrateur SpeedVacThermo Fisher ScientificSPD131DDA
équipementCentrifugeuse à rotor à godets de swinningDivers
équipementColonne Waters XBridge BEH130EauxC18, 3.5 &mu ; m, 2.1& fois ; 150 millimètre
équipementSystème HPLC Agilent 1260Agilent1260 Infinity II
Logiciels et outils en ligneBioconducteur (boîtiers R)bioconductor.org
Logiciels et outils en lignecaret (package R)CRANcaret_6.0-93
Logiciels et outils en ligneclusterProfiler (package R)Bioconducteur4.0.5
Logiciels et outils en ligneDIA-NNLogiciel DIA-NNv1.8
Logiciels et outils en ligneggplot2 (package R)CRAN3.4.0
Logiciels et outils en ligneMaxQuantInstitut Max Planck1.6.17
Logiciels et outils en ligneomickits.comPlateforme cloud OmiKitshttp://www.omickits.com
Logiciels et outils en lignepROC (package R)CRAN1.18.0
Logiciels et outils en lignerandomForest (package R)CRAN4.7-1.1
Logiciels et outils en ligneSpectronaute Pulsar XBiognosys AG17
Logiciels et outils en ligneBase de données humaine UniProtKBuniprot.orgParution 2019_10
Autres matériauxTubes de microcentrifugation à faible liaisonEppendorf30120094
Autres matériauxTubes séparateurs de sérum (SST)BD Biosciences367988
Autres matériaux3M Empore&commerce ; Disques C183M

Références

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