Analyse de données de microscopie multidimensionnelle à l’aide de Cell-ACDC

Summary

L’analyse précise des données de microscopie multidimensionnelle nécessite des flux de travail complexes. Cet article vous explique comment utiliser le logiciel Cell-ACDC. Il s’appuie sur des modèles de pointe basés sur l’IA pour la segmentation, le suivi, l’analyse du pedigree cellulaire et la quantification des données de microscopie. De manière cruciale, il complète ces modèles avec un cadre innovant pour la correction semi-automatisée de la sortie des modèles.

Abstract

Les progrès récents de la microscopie quantitative pour les sciences de la vie ont permis aux biologistes expérimentaux de sonder les cellules avec une résolution et une vitesse sans précédent. Dans le même temps, la révolution de l’IA a considérablement augmenté la quantité d’informations pouvant être extraites des données de microscopie multidimensionnelle. Cependant, la grande quantité de données générées et la complexité des modèles d’IA de pointe constituent un grave goulot d’étranglement au stade de l’analyse d’images. Cell-ACDC est un logiciel open source et convivial qui fournit une solution puissante de bout en bout pour la segmentation, le suivi et l’analyse quantitative de cellules uniques dans des données de microscopie multidimensionnelle. Il est conçu pour les biologistes expérimentaux qui peuvent manquer de l’expertise technique avancée requise pour mettre en œuvre de tels modèles. Cet article montre comment utiliser le cadre pour exploiter facilement les modèles les plus récents, ainsi que de nombreux outils de correction de données intelligente et semi-automatisée, afin de maximiser la quantité d’informations biologiques pouvant être obtenues. Cell-ACDC prend en charge les données de microscopie multicanal, time-lapse et z-stack, et fournit un ensemble d’outils dédiés adaptés à chaque type de dimensionnalité des données. En raison de sa conception modulaire, qui permet aux biologistes d’intégrer de manière transparente de nouveaux modèles et d’y accéder directement, Cell-ACDC a le potentiel de servir d’outil de référence pour l’analyse des données de microscopie.

Introduction

La microscopie est devenue fondamentale pour accélérer les découvertes biologiques à toutes les étapes de la recherche et du développement, de la science fondamentale ^1,2,3 à la découverte et aux tests de médicaments ^4,5 et à travers une gamme remarquable de tailles, des cultures cellulaires aux tissus ^6,7, en passant par les organoïdes ^8,9 et les organismes entiers¹⁰. Ces techniques de microscopie avancées présentent toutefois deux inconvénients principaux. Tout d’abord, les données de microscopie sont intrinsèquement volumineuses¹¹, en particulier lors de l’acquisition de plusieurs dimensions (par exemple, le temps et les volumes). Deuxièmement, l’extraction précise des informations biologiques riches dans les données nécessite le déploiement de cadres d’analyse d’images avancés qui s’appuient souvent sur des modèles d’IA. Cette tâche peut être intimidante pour les biologistes expérimentaux. Par conséquent, les étapes de traitement, de traitement et d’analyse des données peuvent considérablement ralentir la recherche scientifique tout en réduisant le potentiel de nouvelles découvertes. Idéalement, les cadres logiciels pour l’analyse des bioimages devraient aider l’utilisateur à chaque étape de l’analyse, de la gestion des fichiers de microscopie brute à l’analyse en aval pour extraire des informations biologiques, en passant par la segmentation et le suivi. En pratique, le développement rapide de nouveaux logiciels d’analyse de bioimages, tout en étant un résultat positif, a eu pour effet secondaire de créer un paysage dispersé d’outils spécifiques à une étape d’analyse particulière ou nécessitant une expertise avancée en programmation. L’utilisateur se retrouve donc avec la tâche difficile d’assembler le flux de travail d’analyse, ce qui entraîne souvent des pipelines sous-optimaux où les données sont enregistrées, manipulées et converties plusieurs fois pour les rendre compatibles avec l’outil suivant. De plus, le développement de l’analyse des bioimages n’est pas standardisé dans un seul langage de programmation, de nombreux outils étant développés sous forme de plugins ImageJ¹² ou QuPath¹³ (Java), de plugins Napari (Python)¹⁴ ou de scripts Python. Dans certains cas, cet environnement difficile conduit les scientifiques à opter pour l’analyse manuelle, un processus qui est non seulement lent, mais qui introduit également des biais humains et entrave la reproductibilité.

Pour résoudre ce problème, Cell-ACDC (Cell-Analysis of the Cell Division Cycle)¹⁵ a été développé, un ensemble d’outils logiciels open source basés sur une interface graphique écrite en Python pour analyser des données de microscopie multidimensionnelle. De manière cruciale, Cell-ACDC fournit une multitude de modèles de pointe pré-implémentés et installés automatiquement (si nécessaire) pour les deux segmentations (Cellpose, StarDist, Segment Anything, YeaZ, YeastMate, etc.16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26^,27,28) et le suivi (Trackastra, Trackpy, Bayesian Tracker, Cell-ACDC, etc.19,29,30,31,32,33,34). Ces modèles sont complétés par un cadre de visualisation des données annotées et des corrections manuelles assistées par ordinateur. De plus, dans le même cadre, Cell-ACDC fournit un module pour chaque étape du pipeline d’analyse d’images, prenant automatiquement en charge la gestion, le traitement et l’enregistrement des données (Figure 1). Plus précisément, il permet à l’utilisateur d’effectuer la segmentation d’instance (par exemple, les cellules uniques), le suivi d’objets, l’annotation d’états cellulaires (par exemple, l’étape du cycle cellulaire) et diverses formes de quantification, y compris l’analyse des canaux de fluorescence disponibles.

L’une des principales forces de Cell-ACDC est l’analyse des données de microscopie time-lapse de cellules vivantes, ce qui pose des défis importants en raison de la nécessité d’une cohérence entre les points temporels. Bien qu’il existe de nombreux modèles de segmentation et de suivi automatisés de cellules uniques, les corrections manuelles restent essentielles pour répondre à des questions biologiques complexes. Cell-ACDC offre une suite d’outils spécialement conçus pour rationaliser le processus de correction. Il intègre des algorithmes intelligents pour minimiser le nombre de réglages manuels. Notamment, les corrections sont automatiquement propagées sur toutes les trames futures et passées pertinentes, préservant ainsi l’intégrité des données tout au long de l’analyse. Compte tenu de sa conception modulaire et de sa base d’utilisateurs croissante, le développement continu de ce logiciel est une priorité, avec des efforts continus axés sur l’intégration de nouveaux modèles et la réponse aux besoins changeants de la communauté.

Protocol

REMARQUE : Cell-ACDC est conçu pour être aussi clair et intuitif que possible pour les utilisateurs sans aucune expérience en programmation. Pour ce faire, il suffit principalement de décomposer le flux de travail d’analyse en étapes plus petites et faciles à suivre et de fournir des informations supplémentaires par le biais d’info-bulles et de boutons d’information. Étant donné que Cell-ACDC couvre un large éventail d’étapes dont l’ordre d’exécution n’est souvent pas séquentiel, un tableau de décision est illustré à la figure 2. Le guide suivant passe en revue un exemple spécifique. Les étapes 10 et 11 peuvent être utilisées pour importer d’autres données au lieu d’utiliser les données fournies téléchargées à l’étape 3.

1. Installation de Cell-ACDC

REMARQUE : Cell-ACDC est actuellement distribué en tant que paquet Python via le Python Package Index (PyPI) et peut être installé avec la commande pip install « cellacdc[torch] ».

1. Configurer Miniforge
   1. Téléchargez l’installateur sur le site Web de Miniforge (voir la table des matériaux pour plus de détails).
   2. Installer Miniforge : Pour Windows, exécutez le programme d’installation téléchargé et suivez les instructions. Pour Mac ou Linux, ouvrez le terminal et exécutez la commande suivante :
      curl -L -O "https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Miniforge3-$(uname)-$(uname -m).sh
   3. Une fois l’installation terminée, ouvrez le bon terminal en suivant les instructions ci-dessous :
      1. Sous Windows, appuyez sur Win + S, tapez Miniforge Prompt , puis appuyez sur Entrée.
      2. Pour Mac/Linux : ouvrez l’application Terminal.
2. Gérer l’environnement virtuel.
   1. Dans l’invite, tapez la commande suivante pour créer un environnement virtuel. Appuyez ensuite sur Entrée pour exécuter la commande.
      conda create -y -n acdc python=3.12
   2. Activez l’environnement en exécutant :
      Conda Activate ACDC
3. Installation
   1. Avec l’environnement actif, installez Cell-ACDC en exécutant la commande suivante :
      pip install « cellacdc[torch] »
   2. Après l’installation, exécutez Cell-ACDC -y pour laisser le logiciel terminer sa configuration.

2. Cellule de course-ACDC

1. Ouvrez le bon terminal (voir étape 1.1.3).
2. Activez l’environnement en exécutant la commande :
   Conda Activate ACDC
3. Démarrez Cell-ACDC en exécutant la commande suivante :
   Cellule-ACDC

3. Téléchargement d’exemples de données

REMARQUE : Les données d’exemple seront téléchargées dans « C :\Users\ %USERNAME %\acdc-appdata\acdc-examples\TimeLapse_2D\Position_8 » sous Windows, et dans « ~/acdc-appdata/acdc-examples/TimeLapse_2D/Position_8 » sous MacOS et Linux. Si le guide de bienvenue ne s’affiche pas, sélectionnez Aide > Guide de bienvenue (Figure 3B) dans la barre de menu de la fenêtre principale du lanceur Cell-ACDC (Figure 1), .

1. Sélectionnez Télécharger et tester à l’aide d’un exemple de time-lapse (Figure 3B).
2. Attendez que le téléchargement soit terminé.
3. Cliquez sur Non, merci d’arrêter de charger les données directement dans l’interface graphique.

4. Module de préparation des données

REMARQUE : Les données peuvent être alignées avant la segmentation et les régions d’intérêt (ROI) peuvent être sélectionnées . Ces étapes sont facultatives mais bénéfiques si le champ de vision est déplacé au fil du temps ou si seules des parties des données sont intéressantes, respectivement.

1. Cliquez sur Lancer le module de préparation des données... dans la fenêtre principale pour ouvrir le module de préparation des données (Figure 1A, Module de prétraitement des données).
2. Sélectionnez le dossier contenant les données.
   1. Cliquez sur l’icône de dossier dans la barre d’outils de la nouvelle fenêtre pour charger les données de microscopie (Figure 4A).
   2. Sélectionnez le dossier contenant les données, puis confirmez la sélection en appuyant sur Sélectionner un dossier.
3. Sélectionnez un canal pour le processus d’alignement à l’aide du menu déroulant pour sélectionner le canal phase_contr . Appuyez ensuite sur OK pour confirmer la sélection (Figure 4B).
4. Appuyez sur OK pour confirmer les propriétés de l’image (Figure 4C).
   REMARQUE : Si vous utilisez des données de pile z, mais qu’une seule tranche doit être utilisée pour la segmentation, sélectionnez la tranche z appropriée à l’aide du curseur. Utilisez les boutons de la barre d’outils pour appliquer la sélection à d’autres cadres si nécessaire.
5. Exécutez le processus d’alignement.
   1. Cliquez sur le bouton Démarrer , qui se trouve également dans la barre d’outils (Figure 5A).
   2. Cliquez sur Oui pour démarrer le processus d’alignement.
      REMARQUE : Cliquez sur Non pour ignorer l’alignement.
   3. Appuyez sur OK pour confirmer que les informations sur le remplissage ont été prises en compte.
      REMARQUE : L’alignement peut prendre du temps, en fonction de la taille des données.
   4. Appuyez sur Ok pour terminer l’alignement une fois le processus terminé.
6. Définissez les retours sur investissement et les retours sur investissement en arrière-plan.
   1. Accédez à la dernière image de la vidéo de segmentation à l’aide du curseur de sélection d’images dans la partie inférieure de l’interface graphique de préparation des données.
   2. Ajustez le retour sur investissement de l’arrière-plan ajouté automatiquement en le faisant glisser sur l’image ou en le redimensionnant à l’aide des diamants. Assurez-vous que le retour sur investissement de l’arrière-plan n’a pas de cellules. Laissez le retour sur investissement tel quel (Figure 5B).
      REMARQUE : Pour définir des retours sur investissement supplémentaires, cliquez sur le bouton Ajouter une zone d’intérêt de recadrage (situé dans la barre d’outils) et sélectionnez-les dans le visualiseur. Habituellement, le retour sur investissement doit être aussi faible que possible tout en englobant toutes les cellules d’intérêt sur les trames pertinentes. Cependant, pour assurer la reproductibilité au sein de ce protocole, il est recommandé de ne pas le modifier.
7. Pour recadrer les zones d’intérêt sélectionnées dans de nouveaux fichiers image, cliquez sur le bouton Recadrer le plus à gauche.
   REMARQUE : Cette étape est facultative. Si les images recadrées ne sont pas nécessaires, la fenêtre peut être fermée. Les coordonnées de tous les ROI et des ROI d’arrière-plan sont enregistrées automatiquement et peuvent être utilisées ultérieurement pour la segmentation. Si le retour sur investissement n’a pas été modifié, ces boutons ne feront rien. Les options de recadrage incluent les directions XY, les tranches z ou des plages horaires spécifiques. Chaque bouton est étiqueté avec les dimensions qui seront recadrées.
8. Enregistrer les données alignées
   1. Fermez la fenêtre à l’aide du bouton de fermeture de la fenêtre (par exemple, le X dans le coin supérieur droit sous Windows ou le point rouge dans le coin supérieur gauche sous macOS ou Linux).
   2. Appuyez sur Oui, enregistrer les données alignées pour enregistrer les données alignées.
   3. Cliquez sur Oui, enregistrez à nouveau les données alignées pour confirmer.
9. Sauvegardez les données recadrées si l’étape 4.7 n’a pas été ignorée et que le retour sur investissement n’a pas été modifié.
   1. Sélectionnez Oui, enregistrer les données recadrées pour enregistrer les données recadrées.
   2. Appuyez sur Oui, recadrez s’il vous plaît pour confirmer l’enregistrement de la recadrage.
   3. Cliquez sur OK pour confirmer le chemin d’accès au dossier par défaut.
      REMARQUE : Sélectionnez un autre dossier pour conserver les données non rognées.
   4. Sélectionnez Oui, remplacer pour confirmer si le chemin d’accès par défaut a été utilisé auparavant.
   5. Appuyez sur OK pour confirmer une fois le processus terminé.

5. Trouver le meilleur modèle et les meilleurs paramètres pour la segmentation

REMARQUE : Cell-ACDC propose une interface graphique avec un retour d’information en temps réel pour trouver les meilleurs paramètres de segmentation (Figure 6). En général, ces modèles sont fournis par des tiers, chacun disposant de sa propre documentation. Il est de la responsabilité de l’utilisateur de déterminer le meilleur modèle de segmentation et ses paramètres optimaux, et les utilisateurs doivent consulter la documentation du modèle respectif qu’ils essaient pour plus d’informations.

1. Cliquez sur Lancer l’interface graphique... dans la fenêtre principale (Figure 1A, Visualiser et corriger le module).
2. Chargez les exemples de données.
   1. Cliquez sur l’icône de dossier dans la barre d’outils de la nouvelle fenêtre pour ouvrir le menu de sélection de dossier.
   2. Sélectionnez le dossier contenant les données, puis appuyez sur Sélectionner un dossier pour confirmer la sélection.
3. Sélectionnez un canal pour la visualisation. Utilisez le menu déroulant pour sélectionner le canal phase_contr pour la segmentation, puis sélectionnez OK pour confirmer.
4. Terminez le chargement des données.
   1. Appuyez sur OK pour confirmer le nom du masque de segmentation par défaut.
   2. Cliquez sur OK pour les positions chargées afin de confirmer les propriétés de l’image.
   3. Sélectionnez Non pour empêcher le chargement de données de fluorescence supplémentaires.
5. Dans le sélecteur de mode (Figure 6, « Sélecteur de mode »), sélectionnez le mode Segmentation et suivi.
6. Trouvez les meilleurs paramètres de prétraitement.
   1. Accédez à Image > Pré-traitement... dans la barre de menu supérieure pour ouvrir la fenêtre de prétraitement personnalisé (Figure 7A).
   2. Sélectionnez Supprimer les pixels chauds ou une autre étape de prétraitement souhaitée dans le menu déroulant.
   3. Utilisez l’icône en forme de roue dentée pour initialiser et modifier les paramètres d’une étape. Utilisez le bouton info pour afficher des informations sur l’étape et les paramètres disponibles. Laissez les paramètres inchangés.
   4. Utilisez l’icône plus pour ajouter une étape supplémentaire.
   5. Sélectionnez Redimensionner les intensités et confirmez les paramètres en répétant les étapes 5.6.1 et 5.6.2.
   6. Cochez la case d’aperçu pour voir les effets des étapes en temps réel.
   7. Cliquez sur Appliquer à tous les cadres (Figure 7B).
   8. Appuyez sur Enregistrer les données prétraitées pour lancer le processus d’enregistrement.
   9. Appuyez sur OK pour confirmer le nom par défaut.
   10. Fermez la fenêtre Recette de prétraitement .
7. Trouvez les meilleurs paramètres de segmentation.
   1. Sélectionnez Segment > Segment affiché dans le ruban supérieur, puis sélectionnez YeaZ_v2 (Figure 8A).
   2. Appuyez sur OK pour télécharger YeaZ_v2 si vous y êtes invité.
      REMARQUE : Le téléchargement peut prendre plusieurs minutes. La progression s’affiche dans la fenêtre de la console. Ne fermez pas l’interface graphique pendant le téléchargement, même si elle ne répond pas.
   3. Laissez les paramètres par défaut inchangés.
      REMARQUE : La plupart des paramètres ont des boutons d’information qui fournissent des conseils détaillés.
   4. Activez le post-traitement en vérifiant les paramètres de segmentation du post-traitement (Figure 8B).
   5. Acceptez les paramètres en cliquant sur OK.
      REMARQUE : La segmentation peut prendre un certain temps, en fonction de la complexité du modèle, de la taille de l’image et des spécifications de l’ordinateur. En particulier, la version 4 de Cellpose peut être très lente.
   6. Si vous êtes interrogé sur l’activation de la segmentation automatique, sélectionnez Non.
   7. Vérifiez que la segmentation fonctionne correctement.
   8. Répétez l’étape 5.7.1 pour rouvrir les paramètres de segmentation.
   9. Si les résultats de segmentation sont tels que prévus, appuyez sur Enregistrer tous les paramètres dans le fichier de recette. Sinon, modifiez les paramètres de segmentation et répétez les étapes 5.7.4 à 5.7.8.
   10. Utilisez l’entrée de texte pour donner à la recette de segmentation le nom test.
   11. Cliquez sur OK pour accepter le nom.
   12. Appuyez sur OK pour terminer l’enregistrement du flux de travail.
   13. Fermez l’écran de sélection des paramètres.
8. Fermeture de la fenêtre de l’interface graphique
   1. Fermez la fenêtre de l’interface graphique.
   2. Appuyez sur Non pour ne pas enregistrer avant de fermer.

6. Segmentation et suivi (traitement par lots)

1. Cliquez sur Lancer le module de segmentation... dans la fenêtre principale (Figure 1A, module « Segment et piste »).
   1. Sélectionnez les exemples de données. Utilisez le sélecteur de dossier de Cell-ACDC pour choisir le dossier contenant les données, puis appuyez sur Sélectionner un dossier pour confirmer la sélection.
2. Sélectionnez les paramètres pour le traitement par lots.
   1. Sélectionnez le canal phase_contr_preprocessed comme canal pour la segmentation. Appuyez sur OK pour confirmer la sélection.
      REMARQUE : Certains modèles utilisent un canal supplémentaire comme entrée. Ce canal peut être sélectionné ultérieurement lors du réglage d’autres paramètres de segmentation.
   2. Confirmez les propriétés de l’image en cliquant sur OK.
3. Définissez les paramètres du modèle de segmentation.
   1. Choisissez-YeaZ_v2 comme modèle à utiliser pour la segmentation, puis confirmez la sélection en cliquant sur OK.
   2. Cliquez sur le bouton Charger la recette enregistrée... pour charger la recette précédemment enregistrée.
   3. Sélectionnez segmentation_recipe_test.ini dans la liste, puis confirmez la sélection en cliquant sur OK.
   4. Fermez le message de chargement réussi en appuyant sur Ok.
   5. Confirmez les paramètres en sélectionnant OK.
4. Confirmez les autres paramètres de segmentation.
   1. Appuyez sur OK pour accepter le nom par défaut du fichier de segmentation.
   2. Sélectionnez Non pour confirmer que l’image entière doit être segmentée.
   3. Sélectionnez OK pour définir l’image d’arrêt comme image finale du timelapse.
5. Définissez les paramètres de suivi. Sélectionnez YeaZ comme méthode de suivi à utiliser, puis confirmez la sélection en appuyant sur Ok.
6. Exécutez la routine de segmentation et de suivi.
   1. Cliquez sur Exécuter maintenant pour exécuter le pipeline de segmentation et de suivi.
      REMARQUE : Cela peut prendre plusieurs heures en fonction de la taille de l’image, de la complexité du modèle et des spécifications de l’ordinateur. Lors des tests, la segmentation des données de test avec YeaZ_v2 a pris environ 2 minutes sur un appareil sans GPU.
   2. Cliquez sur OK pour terminer la segmentation.

7. Correction des erreurs de segmentation et de suivi

REMARQUE : En général, les cellules manquantes dans l’image actuelle par rapport à la précédente sont indiquées par un contour et un ID jaunes. Les cellules nouvellement détectées apparaissent avec un ID rouge et un contour épais. Les cellules qui ont été acceptées comme perdues sont représentées par un contour et un ID verts.

1. Cliquez sur Lancer l’interface graphique... dans la fenêtre principale (Figure 1A, module « Visualiser et corriger »).
2. Chargez les exemples de données.
   1. Cliquez sur l’icône du dossier dans la barre d’outils de la nouvelle fenêtre.
   2. Sélectionnez le dossier contenant les données, puis appuyez sur Sélectionner un dossier pour confirmer la sélection.
3. Sélectionnez un canal pour la visualisation. Utilisez le menu déroulant pour sélectionner le canal phase_contr_preprocessed, puis sélectionnez OK pour confirmer.
4. Sélectionnez le nom du masque de segmentation. Sélectionnez Charger pour charger le fichier de segmentation créé à l’étape précédente.
5. Terminez le processus de chargement des données.
   1. Confirmez les propriétés de l’image en cliquant sur OK pour les positions chargées.
   2. Sélectionnez Non pour empêcher le chargement de données de fluorescence supplémentaires.
6. Utilisez le sélecteur de mode (Figure 6, « Sélecteur de mode ») pour sélectionner le mode Segmentation et suivi .
   REMARQUE : Utilisez les cases à cocher en bas de l’interface graphique pour modifier les annotations affichées. Les images de gauche et de droite peuvent afficher des annotations différentes.
7. Sélectionnez un traqueur en temps réel. Dans la barre de menus (Figure 6, « Barre de menus »), accédez à Suivi > Sélectionnez l’algorithme de suivi en temps réel et sélectionnez le traqueur en temps réel souhaité. Utilisez Cell-ACDC ou Cell-ACDC 2 étapes pour les levures bourgeonnantes ou la division symétrique Cell-ACDC pour d’autres organismes.
8. Corrigez la segmentation et le suivi.
   1. Utilisez les touches fléchées gauche et droite pour naviguer entre les cadres.
   2. Accédez à l’image 10.
   3. Appuyez sur la touche S pour activer l’outil de séparation manuelle des bourgeons.
   4. Utilisez le clic droit pour diviser automatiquement le masque de segmentation de la cellule 1.
   5. Accédez à l’image 14.
   6. Appuyez sur la touche B pour activer la brosse.
   7. Dessinez le masque de segmentation manquant pour l’écouteur à l’aide du bouton gauche de la souris.
   8. Parcourez les images suivantes tout en corrigeant les erreurs de segmentation et de suivi. Utilisez les outils disponibles (Figure 6, « Barre d’outils Modifier »). Corrigez au moins jusqu’à l’image 42.
      REMARQUE : La plupart des outils ont une infobulle expliquant leur fonctionnalité. Passez la souris sur un outil pour afficher l’info-bulle.

8. Annotations du cycle cellulaire

REMARQUE : Ne passez à cette étape qu’après avoir terminé les corrections de segmentation et de suivi pour toutes les images qui vous intéressent. Utilisez le mode d’annotation correct en fonction du type de division cellulaire (symétrique, par exemple, cellules de mammifères, ou asymétrique, par exemple, levure bourgeonnante). Pour les exemples de données, reportez-vous à l’étape 8.1 « Division asymétrique des cellules ». L’étape 8.2 décrit le flux de travail général pour la division symétrique des cellules.

1. Cellules à division asymétrique
   REMARQUE : Pour les organismes comme les levures bourgeonnantes, les bourgeons peuvent être attribués aux mères. Les deux objets doivent être présents dans le même cadre. Par défaut, l’étape attendue du cycle cellulaire basée sur les annotations pour la levure bourgeonnante est affichée. L’étape du cycle cellulaire des bourgeons est affichée en rouge, tandis que celle de tous les autres objets est affichée en blanc. Les mères sont reliées à leurs bourgeons par une ligne jaune pointillée.
   1. Activez l’analyse du cycle cellulaire à l’aide du sélecteur de mode (Figure 6, « Sélecteur de mode »).
   2. Sélectionnez Oui, passez à l’image 1 lorsque vous y êtes invité.
   3. Utilisez les touches fléchées gauche et droite pour naviguer entre les cadres.
   4. Naviguez jusqu’à l’image 41. Cliquez sur OK pour accepter l’initialisation de la table d’annotation du cycle de cellules lorsque vous y êtes invité.
   5. Faites un clic droit sur la cellule 1 ou son écouteur pour séparer la connexion et annoter l’événement de division cellulaire.
   6. Continuez jusqu’à ce que toutes les images pertinentes aient été affichées. Corrigez les erreurs dans l’attribution automatique des écouteurs à l’aide des outils disponibles (Figure 6, « Barre d’outils Modifier »).
   7. Outils disponibles
      REMARQUE : Ces outils, à l’exception de l’outil Break/Rebind Mother-Bud Association , peuvent être activés à l’aide d’un raccourci personnalisable ou en appuyant sur les boutons associés dans la barre d’outils.
      1. Attribuer l’écouteur à la mère (A) : Activez l’outil Attribuer l’écouteur à la mère . Appuyez sur le bouton droit de la souris sur l’écouteur et maintenez-le enfoncé. Faites glisser le curseur jusqu’à la cellule mère correspondante et relâchez le bouton de la souris.
         REMARQUE : Utilisez cet outil lorsque l’attribution automatique des écouteurs aux mères est incorrecte.
      2. Annoter l’historique inconnu (U) : Activez l’outil Annoter l’historique inconnu . Utilisez le bouton droit de la souris pour cliquer sur la cellule qui doit être annotée comme ayant un historique inconnu.
         REMARQUE : Utilisez cet outil pour annoter manuellement les cellules dont l’historique est inconnu, ce qui permet de corriger les ambiguïtés de traçabilité lorsque l’inférence automatique est insuffisante.
      3. Réinitialisation de l’annotation du cycle cellulaire
         REMARQUE : utilisez cette option pour réexécuter l’algorithme d’annotation du cycle cellulaire à partir de l’image actuelle. Cela permet d’assurer la cohérence avec les corrections ou mises à jour récentes apportées aux données de segmentation/suivi.
      4. Rompre/réassocier l’association mère-écouteur : Assurez-vous qu’aucun autre outil n’est sélectionné. Faites un clic droit sur une paire mère-écouteur existante pour rompre l’association, ou cliquez à nouveau avec le bouton droit de la souris pour rétablir la connexion.
2. Cellules à division symétrique
   REMARQUE : cette fonctionnalité est en cours de test bêta et sera bientôt officiellement publiée. Il est possible d’attribuer deux cellules filles ou plus à une seule cellule mère. Les cellules mères potentielles sont celles présentes dans le cadre précédent mais absentes dans le cadre actuel, tandis que les cellules filles potentielles sont des cellules nouvellement apparues dans le cadre actuel.
   1. Activez l’option Division normale : Arbre de lignage à l’aide du sélecteur de mode (Figure 6, « Sélecteur de mode »).
   2. Sélectionnez Oui, passez à l’image 1 lorsque vous y êtes invité.
   3. Utilisez les touches fléchées gauche et droite pour naviguer entre les cadres.
   4. Corrigez les erreurs dans les affectations automatiques mère-fille à l’aide des outils disponibles (Figure 6, « Barre d’outils Modifier »).
   5. Propager les modifications lorsque vous y êtes invité en cliquant sur Propagation.
   6. Outils disponibles
      REMARQUE : Ces outils peuvent être activés à l’aide du raccourci ou des boutons respectifs dans la barre d’outils.
      1. Trouver la mère pour un nouvel ID de cellule (F) : Activez l’outil Rechercher la mère pour un nouvel ID de cellule . Faites un clic droit sur la nouvelle cellule pour faire défiler les cellules mères candidates. Maj + clic droit pour revenir en arrière parmi les candidats.
         REMARQUE : Utilisez cet outil pour attribuer ou modifier la mère d’une cellule fille.
      2. Définir une mère inconnue (U) : Activez l’outil Définir une mère inconnue . Faites un clic droit sur la cellule dont la mère est inconnue.
         REMARQUE : Utilisez cet outil pour désigner manuellement la mère d’une cellule comme inconnue.

9. Sauvegarde des données

1. Accédez à Fichier > Enregistrer dans le ruban supérieur.
2. Cliquez sur Définir les mesures... pour sélectionner les mesures souhaitées.
3. Cochez la case en regard de mCitrine metrics ou de toute autre mesure souhaitée.
4. Cliquez sur OK pour confirmer.
5. Cliquez sur Oui pour enregistrer les mesures.
6. Cliquez sur OK pour confirmer le cadre dans lequel les mesures doivent être enregistrées.
7. Cliquez sur Non lorsque vous êtes invité à propos de la concaténation des données.

10. Créer la structure de données

REMARQUE : Cette section traite de la préparation des données de microscopie pour la segmentation et le suivi. Cela peut être ignoré lors de l’utilisation de données de démonstration, qui sont téléchargées dans « Téléchargement d’exemples de données ». La structure des données qui sera générée est décrite à la figure 9.

1. Placez le(s) fichier(s) de microscopie dans un dossier vide.
   REMARQUE : Les formats de microscopie tels que .czi (Zeiss), .lif (Leica) et .nd2 (Nikon), ainsi que les fichiers .tif et .png uniques, sont pris en charge.
2. Cliquez sur le module 0. Créer une structure de données... dans la fenêtre principale (Figure 1A, module « Créer une structure de données »).
3. Sélectionnez BioIO ou Fiji Macro.
   1. Si Windows est utilisé, cliquez sur Utiliser BioIO, tandis que pour les utilisateurs de MacOS et Linux , sélectionnez Utiliser la macro Fidji.
      REMARQUE : Dans ce qui suit, il est supposé que Windows est utilisé.
   2. Si vous êtes invité à installer BioIO, appuyez sur OK pour l’installer.
   3. Sélectionnez la disposition des fichiers de microscopie. Sélectionnez l’option qui correspond à la disposition des fichiers de microscopie à l’aide du menu déroulant, puis appuyez sur OK pour confirmer.
4. Sélection des dossiers source et de destination et de la stratégie de chargement des données
   1. Appuyez sur Terminé pour confirmer que les fichiers se trouvent dans un dossier vide.
   2. Utilisez le sélecteur de dossier de Cell-ACDC pour choisir le dossier contenant le(s) fichier(s).
   3. Appuyez sur Sélectionner un dossier pour choisir un dossier.
   4. Appuyez à nouveau sur Sélectionner un dossier pour choisir le même dossier que le dossier de destination.
      REMARQUE : Le fichier de microscopie brut n’est pas supprimé.
   5. Sélectionnez Oui, charger toute la position en une seule fois.
5. Si vous êtes invité à installer un sous-package BioIO, appuyez sur OK pour l’installer.
6. Définissez les métadonnées du fichier d’entrée.
   1. Corrigez les métadonnées.
      REMARQUE : Vérifiez deux fois l'"Ordre des dimensions » en cliquant sur la petite icône en forme d’œil à côté des champs Nom du canal . Les autres métadonnées qui n’ont pas pu être chargées à partir du fichier brut sont mises en surbrillance.
   2. Appuyez sur OK pour confirmer les métadonnées.
   3. Appuyez sur Oui pour confirmer l’ordre des dimensions.
7. Attendez la fin du processus.
8. Appuyez sur Oui pour fermer la fenêtre une fois le processus terminé.
   REMARQUE : La création de la structure de données peut prendre des heures en fonction de la taille des données.

11. Utilitaires de prétraitement des données

REMARQUE : Plusieurs options de traitement des images avant de passer à l’analyse sont disponibles dans la fenêtre principale. Pour accéder à ces outils, allez dans le menu déroulant Utilitaires dans la barre de menus de la fenêtre principale (Figure 1B, « Utilitaires »), passez la souris sur Prétraitement de l’image, puis sélectionnez l’option à utiliser. En voici deux exemples :

1. Combiner les couches : utilisez cette option pour fusionner deux couches d’image ou plus.
   REMARQUE : Par exemple, deux canaux de fluorescence peuvent être moyennés.
2. Redimensionner les images : utilisez cette option pour réduire la taille des jeux de données d’images très volumineux.
   REMARQUE : Cela peut accélérer considérablement le temps de traitement et, dans de nombreux cas, n’a que peu ou pas d’impact sur la qualité de la segmentation.

12. Dépannage

1. Si Cell-ACDC se bloque, créez un rapport de bogue sur la page GitHub de Cell-ACDC en accédant à l’onglet Problèmes et en cliquant sur le bouton vert Nouveau problème . Suivez le modèle fourni pour inclure tous les détails pertinents nécessaires au diagnostic et à la résolution du problème. Sinon, n’hésitez pas à chercher de l’aide dans le forum image.sc en utilisant le tag #cell-acdc ou à contacter l’un des auteurs correspondants. Dans de nombreux cas, en particulier après l’installation d’un paquet, le simple fait de redémarrer le logiciel peut résoudre le problème.
2. Si Cell-ACDC se bloque ou ne répond plus, vérifiez les mises à jour de progression de la console. De longs temps de segmentation, en particulier lors de l’utilisation de modèles à forte intensité de calcul, tels que Cellpose version 4, ou du traitement de grands ensembles de données, sont normaux. Si Cell-ACDC ne répond pas, reportez-vous à l’étape 12.1 pour plus d’instructions.
3. Si la segmentation automatique inclut incorrectement l’arrière-plan, vérifiez qu’une étape de prétraitement n’a pas trop lissé l’arrière-plan. De nombreux modèles de segmentation sont entraînés sur des images brutes (non prétraitées) et peuvent ne pas fonctionner correctement lorsque l’arrière-plan manque de texture suffisante.

Results

Quantification du volume nucléaire chez les sphéroïdes tumoraux en 3D

La microscopie 3D automatisée (z-stacks) permet aux scientifiques de visualiser des systèmes multicellulaires complexes tels que des organoïdes. Pour quantifier les propriétés morphologiques et du signal de fluorescence au niveau de la cellule unique, la segmentation cellulaire en 3D est souvent nécessaire. L’exemple suivant montre comment Cell-ACDC peut segmenter les noyaux d’organoïdes contenant des milliers de cellules du canal de coloration nucléaire et quantifier leur volume (données de ^Ref.9). La segmentation a été effectuée à l’aide d’un modèle Cellpose personnalisé qui a été formé et publié dans la réf.9. Le modèle Cellpose entraîné peut être utilisé directement dans Cell-ACDC en fournissant le chemin du fichier de poids dans l’interface graphique lors de la sélection des paramètres du modèle pour Cellpose v2. La segmentation a été réalisée à l’aide du deuxième module de Cell-ACDC pour traiter par lots toutes les images (Figure 1A, module « Segment and track »). Ensuite, le résultat a été visualisé dans l’interface graphique du troisième module (Figure 1A, module « Visualiser et corriger »). Ce module a été optimisé pour visualiser des milliers d’objets uniques avec plusieurs options d’annotation (par exemple, des contours, des masques de segmentation superposés ou des ID de texte). Une fois les mesures des masques 3D calculées, toutes les mesures disponibles ont été documentées directement dans l’interface graphique. Ils sont accessibles en accédant à la barre de menu supérieure (Figure 6, « Barre de menus »), en sélectionnant le menu Mesures, puis en définissant les mesures.... La boîte de dialogue contextuelle permet aux utilisateurs d’obtenir des informations spécifiques aux mesures à partir des boutons d’information et de sélectionner les mesures à enregistrer. Pour les résultats représentatifs de la figure 10, on a utilisé le « cell_vol_fl_3D », c’est-à-dire le volume de chaque objet calculé en multipliant le nombre total de voxels dans l’objet par la taille de pixel au carré et la profondeur du voxel. Ces propriétés sont soit automatiquement extraites du fichier brut de microscopie, soit fournies par l’utilisateur. Le calcul des mesures à partir de cette interface graphique nécessite le chargement des images brutes. Ainsi, pour rationaliser le processus et permettre le traitement par lots, les mesures peuvent également être calculées à partir du menu Utilitaires (Figure 1B, « Utilitaires »), en allant dans le sous-menu Mesures, puis Calculer les mesures pour une ou plusieurs expériences. Enfin, la distribution du volume nucléaire a été tracée comme résultat représentatif (figure 10). Cette analyse révèle une fraction significative de petits noyaux, probablement due à des artefacts de segmentation. Ils pourraient facilement être supprimés en filtrant les petits objets du masque de segmentation. Dans le même temps, les très gros noyaux pourraient être dus à des noyaux fusionnés lors de la segmentation. Il est toujours recommandé de tracer la distribution du volume des objets (p. ex., des cellules uniques) pour identifier les artefacts et extraire des informations biologiques supplémentaires sur la taille des cellules.

Quantification des données de microscopie time-lapse

Avec la microscopie time-lapse, la dynamique cellulaire peut être observée directement au niveau de la cellule unique. Outre la segmentation cellulaire, l’extraction de la dynamique temporelle nécessite une analyse supplémentaire, notamment le suivi cellulaire et l’annotation du pedigree cellulaire. En raison de l’interdépendance de ces étapes d’analyse, les erreurs introduites tôt dans le pipeline peuvent se propager aux étapes ultérieures. Par conséquent, il est nécessaire de visualiser et de corriger en permanence les erreurs de segmentation, de suivi et d’annotation. Ce qui suit démontre que Cell-ACDC est adapté pour s’attaquer à ces tâches. Deux ensembles de données de deux organismes modèles différents ont été sélectionnés : 1) des levures bourgeonnantes (souche DCY001-1 de la ^réf.35, où les deux protéines d’histone H2B, Htb1 et Htb2, sont marquées avec de la mCitrine), et 2) des cellules souches embryonnaires de souris (mESC, données de la réf.22).

Ces deux ensembles de données mettent en évidence deux modes d’annotation disponibles dans Cell-ACDC : la division cellulaire asymétrique et symétrique (c’est-à-dire la cytokinèse symétrique, ou « normale »). Comme le mode de division diffère, les deux organismes nécessitent un cadre de suivi et d’annotation différent.

Dans la division asymétrique, la cellule mère forme un bourgeon qui se développe et finit par se séparer pour devenir une cellule fille. Après la division, la cellule mère conserve son ID de cellule d’origine et son numéro de génération augmente de un, tandis que la cellule fille se voit attribuer un nouvel ID de cellule et son numéro de génération est défini sur un. La phase de bourgeonnement correspond aux phases S/G2/M du cycle cellulaire et est annotée comme telle dans Cell-ACDC. Ces choix d’annotation aident à répondre à des questions biologiques typiques liées au cycle cellulaire chez la levure en bourgeonnement.

Dans le cas d’une division « symétrique » (par exemple, des cellules de mammifères), la cellule mère se divise en deux cellules filles. La cellule mère, c’est-à-dire son ID, disparaît lors de la division, et les deux cellules filles reçoivent de nouveaux ID. De plus, le nombre de générations des cellules filles est augmenté d’une unité par rapport à la cellule mère. Cell-ACDC garde également une trace de l’ID parent, de l’ID racine (la cellule ancêtre d’origine au début d’une lignée) et de l’ID sœur.

Pour les deux modes d’annotation, un cadre innovant a été développé pour corriger les erreurs d’annotation, où la correction est automatiquement propagée à tous les points temporels pertinents passés et futurs. La visualisation, l’annotation et la correction ont été effectuées dans l’interface graphique du troisième module (Figure 1A, module « Visualiser et corriger » et Figure 6). Pour segmenter et suivre les cellules de l’ensemble de données 1, le modèle YeaZ_v2²⁶ a été appliqué au canal de contraste de phase, tandis que pour le canal nucléaire (histone), le modèle StarDist²⁵ a été utilisé. Ensuite, à l’aide de l’utilitaire Suivi et traçabilité > Suivre et/ou compter les objets subcellulaires (Figure 1B, barre de menu Utilitaires ), Cell-ACDC a attribué à chaque noyau l’ID de cellule de sa cellule correspondante, assurant ainsi la cohérence entre les tables générées à partir des masques de cellule et de noyau.

Pour l’ensemble de données 2, le modèle de segmentation DeepSea²² a été utilisé. Les trois modèles sont déjà disponibles dans Cell-ACDC, ce qui démontre l’avantage d’intégrer plusieurs modèles de segmentation dans le logiciel.

Une fois les erreurs de segmentation et de suivi corrigées, les pedigrees des cellules ont été annotés, les caractéristiques numériques ont été calculées et une analyse en aval a été effectuée. Pour l’ensemble de données 1, la TaYFP_amount_autoBkgr de la colonne et le nombre de noyaux segmentés (figure 11A) ont été tracés en fonction du temps. « TaYFP » est le nom de la chaîne nucléaire. « amount_autoBkgr » est une approximation de la quantité totale de protéines cellulaires extraite des images d’épifluorescence³⁶. Elle est calculée comme la différence entre l’intensité moyenne de fluorescence dans chaque masque cellulaire et la médiane d’arrière-plan, multipliée par la surface de la cellule (en pixels). Ici, la médiane d’arrière-plan est calculée à partir de tous les pixels qui ne sont pas segmentés en tant que cellules. Comme prévu, la quantité de H2B commence à augmenter à l’émergence des bourgeons (Figure 11A-ii) et atteint une valeur constante avant la division nucléaire (Figure 11A-iii). Il s’agit d’un contrôle de qualité important dans l’homéostasie des protéines d’histones, car la quantité de protéines d’histones devrait dépendre du cycle cellulaire. De plus, le tracé du nombre de noyaux au fil du temps confirme que les quantités de protéines d’histones atteignent leur maximum à peu près autour de la division nucléaire.

Pour l’ensemble de données 2, la surface cellulaire au fil du temps d’une cellule sélectionnée subissant une division cellulaire a été tracée. Comme prévu, la surface de la cellule augmente jusqu’à atteindre une valeur maximale (Figure 11B-i). Ensuite, il diminue jusqu’à la division cellulaire (Figure 11B-ii) lorsque la cellule se contracte. Enfin, le cycle redémarre pour les deux cellules filles. Il s’agit d’une autre analyse recommandée, car il est essentiel de vérifier les changements de taille des cellules au cours du cycle cellulaire pour confirmer que les cellules se développent et se divisent comme prévu (ou non dans le cas de mutants spécifiques).

Figure 1 : Modules Cell-ACDC. (A) Vue d’ensemble des 4 modules principaux qui peuvent être lancés à partir du lanceur principal Cell-ACDC. Après avoir segmenté, suivi et annoté les données de microscopie, les caractéristiques numériques peuvent être calculées soit à partir du troisième module (« Visualiser et corriger »), soit à partir de (B) le menu Utilitaires de la barre de menu supérieure. Les « Utilitaires » sont les routines qui peuvent s’exécuter automatiquement sur plusieurs ensembles de données sans intervention de l’utilisateur. Outre le calcul des mesures, d’autres utilitaires incluent la concaténation de plusieurs tables de sortie en une seule table, le suivi d’objets subcellulaires et le prétraitement d’images. Cell-ACDC prend en charge les données 2D, 3D (pile z ou time-lapse) et 4D (piles z au fil du temps), avec n’importe quel nombre de canaux supplémentaires. La table de sortie avec les caractéristiques numériques peut ensuite être utilisée pour l’analyse en aval et la découverte biologique (Figure 10 et Figure 11). À cette fin, des notebooks Jupyter sont disponibles sur la page GitHub Cell-ACDC, qui incluent des exemples de tracés pouvant être obtenus à partir de la table de sortie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Organigramme de décision Cell-ACDC. Un organigramme décrivant le module à utiliser en fonction du type d’ensemble de données et des exigences d’analyse. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Téléchargement d’exemples de données (A) Ouvrez le Guide de bienvenue. (B) Téléchargez des exemples de données nécessaires à la réplication du protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Chargement des données pour la préparation des données. (A) Chargez les données dans l’interface graphique de préparation des données. (B) Sélectionnez le canal à charger. (C) Modifiez et confirmez les métadonnées de l’image. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Exécution du processus de préparation des données (A) Démarrez le processus. (B) Positionnez les zones d’intérêt (pour le recadrage) et les zones d’intérêt d’arrière-plan. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6 : Interface graphique du troisième module pour visualiser et corriger les résultats. Capture d’écran de l’interface graphique du troisième module (« Visualiser et corriger » dans la figure 1A) avec les éléments en surbrillance. Notez que la plupart des boutons des barres d’outils ont une infobulle (accessible en passant le curseur de la souris sur le bouton) expliquant comment utiliser cette fonction spécifique. Le sélecteur de mode peut être utilisé pour basculer entre 5 modes : « Viewer », « Segmentation and Tracking », « Cell cycle analysis » (pour les cellules à division asymétrique), « Division normale : Arbre de lignage » (pour les cellules à division symétrique, par exemple, les cellules de mammifères) et « Annotations personnalisées ». Notez qu’une barre d’outils ou une barre de menus est souvent présente dans les autres interfaces graphiques (par exemple, le module « Prétraitement des données », Figure 1). La barre d’outils d’édition contient toutes les fonctions qui peuvent être utilisées pour modifier et corriger les erreurs de segmentation et de suivi (par exemple, pinceau, gomme, ID d’édition, etc.). L’image chargée est affichée dans une vue à deux panneaux, ce qui est utile lorsque différentes options d’annotation sont nécessaires (par exemple, les informations sur le cycle de cellule sur l’image de gauche et les ID sur l’image de droite). L’image de droite peut également être désactivée (clic droit sur l’image et désélectionnez Afficher l’image en miroir). Chaque panneau d’image comprend un curseur LUT sur le côté pour ajuster rapidement les niveaux d’intensité. En cliquant avec le bouton droit de la souris sur la commande LUT, l’utilisateur peut sélectionner différentes cartes de couleurs pour les images d’intensité. De plus, sur le côté droit, il y a un sélecteur LUT pour la couleur des étiquettes de segmentation à superposer sur les images d’intensité (option d’annotation appelée masques Segm.). Sur le côté gauche des options d’annotation de l’image de gauche, il y a des bascules supplémentaires pour contrôler certains paramètres, tels que l’enregistrement automatique, la taille de la police, etc. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7 : Visualisez le prétraitement dans l’interface graphique principale. (A) Ouvrez la boîte de dialogue de prétraitement. (B) Dialogue de prétraitement avec les paramètres utilisés dans le protocole initialisé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : Visualisez la sortie de segmentation dans l’interface graphique principale. (A) Sélectionnez un modèle de segmentation. (B) Configurez les paramètres de segmentation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9 : Structure de dossiers requise par Cell-ACDC. Pour fonctionner avec Cell-ACDC, les données doivent être organisées dans une structure de dossiers spécifique. Bien que Cell-ACDC fournisse un module permettant de générer automatiquement cette structure, il est important de comprendre à quoi devrait ressembler cette structure. Tout d’abord, tous les fichiers doivent se trouver dans un dossier appelé Images. Ensuite, ils doivent tous commencer par le même nom, ce que l’on appelle le « basename_ ». L’ensemble minimum de fichiers requis est un fichier TIFF monocanal (2D, 3D z-stack ou 3D+time) et un fichier CSV se terminant par « _metadata.csv ». Ce fichier doit être une table avec deux colonnes, la première colonne appelée Description et la deuxième colonne appelée valeurs, et il doit contenir au moins des entrées pour SizeT et SizeZ pour le nombre de cadres et de tranches z, respectivement. Si un fichier image n’a pas de tranches z, SizeZ doit être défini sur 1. Il en va de même pour les images sans time-lapse, où SizeT doit être 1. S’agissant d’un fichier CSV, une entrée est constituée d’une seule ligne de Description,value, séparée par une virgule, par exemple, SizeZ,1. Pour plusieurs canaux, un fichier TIFF par canal doit être généré. Le dossier Images doit ensuite être placé à l’intérieur d’un dossier appelé « Position_1 ». Plusieurs positions sont autorisées, et elles doivent être nommées avec un numéro consécutif. Lors du chargement de données dans l’un des modules Cell-ACDC, l’utilisateur peut sélectionner soit un dossier Position spécifique, soit l’ensemble du dossier de l’expérience. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 10 : Quantification 3D d’organoïdes tumoraux. Capture d’écran d’un organoïde tumoral représentatif (données de⁹) chargé dans l’interface graphique du troisième module de Cell-ACDC (à gauche), exemple de tranches z avec des contours rouges mettant en évidence les masques de segmentation (au centre) et histogramme de la distribution du volume cellulaire calculée à partir des masques de segmentation 3D (à droite). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 11 : Quantification des données de microscopie time-lapse. (A) Capture d’écran des données de microscopie time-lapse de cellules de levure bourgeonnantes chargées dans l’interface graphique du troisième module de Cell-ACDC (à gauche), et quantification de la quantité de protéines d’histone H2B au fil du temps dans un cycle cellulaire représentatif (à droite). Les images zoomées montrent la cellule exemple et son bourgeon (flèches blanches) au début du cycle cellulaire (i), à l’émergence du bourgeon (ii) et à la division nucléaire (iii). Les données sont tirées de Chatzitheodoridou et ^al.35 (B) Capture d’écran des données de microscopie time-lapse de cellules souches embryonnaires de souris chargées dans l’interface graphique du troisième module de Cell-ACDC (à gauche) et de la surface cellulaire (μm²) tracée en fonction du temps d’une cellule représentative subissant une division cellulaire. Les images zoomées montrent la cellule d’exemple et ses filles à la surface maximale de la cellule avant la division (i), la division en deux cellules filles (ii) et la dernière image analysée après la division (iii). Les données sont tirées de Zargari et ^al.22,33. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

L’analyse de données de microscopie multidimensionnelle nécessite souvent l’utilisation de modèles de pointe pilotés par l’IA. Cependant, ces outils sont développés rapidement et présentent un obstacle important à l’entrée pour l’adoption. De plus, les biologistes ont souvent besoin de visualiser le résultat pour une correction efficace des erreurs. Ici, il est démontré comment les scientifiques peuvent utiliser Cell-ACDC pour relever ces défis.

Une étape critique du protocole présenté consiste à sélectionner le modèle de segmentation optimal. Cell-ACDC intègre une interface graphique permettant la sélection visuelle (Figure 1A, module « Visualiser et corriger »). Des outils de préparation des données et de traitement par lots de plusieurs ensembles de données sont également fournis (Figure 1A, Création d’une structure de données, Prétraitement des données, Modules de segment et de suivi, et Utilitaires). Les utilisateurs sont encouragés à signaler des problèmes et à donner leur avis sur le forum image.sc (en utilisant la balise #cell-acdc) ou en ouvrant un problème sur la page GitHub de Cell-ACDC.

Bien que Cell-ACDC ait déjà été utilisé sur des données relativement volumineuses, comme avec des sphéroïdes dans des images avec des milliers de noyaux⁹, ou des données en accéléré de levures bourgeonnantes avec des centaines de cellules par image, le programme doit charger l’intégralité des données monocanal dans la RAM pour fonctionner correctement. Il est recommandé d’utiliser environ trois fois la taille du fichier image dans la mémoire disponible pour garantir des performances stables. À l’heure actuelle, les ensembles de données dépassant la mémoire système disponible ne peuvent pas être traités, mais la prise en charge du chargement hors cœur (paresseux) est prévue grâce à l’intégration d’OME-Zarr³⁷.

Actuellement, l’une des principales limitations de Cell-ACDC est la prise en charge partielle des ensembles de données 3D+time, car la plupart des outils ont été développés pour les données 3D z-stack ou 2D+time. Par conséquent, les futures versions de Cell-ACDC étendront ses capacités avec une prise en charge complète des données 3D+temps. De plus, nous travaillons à l’extension du cadre d’annotation du pedigree cellulaire pour les cellules qui se divisent « symétriquement » (par exemple, les cellules de mammifères), qui sont les cellules où la cellule mère se divise en deux cellules filles (par opposition à la levure bourgeonnante, où la cellule mère, une fois par cycle cellulaire, donne naissance à une seule cellule fille par bourgeonnement). Enfin, à l’heure actuelle, Cell-ACDC est limité aux données dont les données monocanal tiennent entièrement dans la RAM. Par conséquent, nous prévoyons d’implémenter le chargement paresseux comme mentionné ci-dessus.

Depuis sa sortie, Cell-ACDC n’a cessé d’être amélioré, par exemple en ajoutant de nouveaux modèles de segmentation et de suivi, de nouveaux cadres d’annotation (par exemple, pour les cellules de mammifères, actuellement en phase de bêta-test) et diverses améliorations de performances. Grâce à ces développements, les scientifiques ont pu utiliser Cell-ACDC pour accélérer la recherche et permettre la découverte scientifique 6,9,16,35,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48 ^,49. Ce qui rend ce cadre logiciel unique par rapport aux méthodes existantes 14,27,50,51, c’est sa capacité à exploiter et à compléter les modèles existants, bénéficiant ainsi des développements de la communauté. Le développement continu de Cell-ACDC est activement maintenu afin de l’établir comme cadre de référence pour l’analyse des données de microscopie multidimensionnelle.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BÉBÉ	Julian Pietsch	10.7554/eLife.79812	Un logiciel de segmentation et de suivi, optionnel, peut être installé automatiquement avec Cell-ACDC
Traceur bayésien	Kristina Ulicna	10.3389/fcomp.2021.734559	Un logiciel de suivi, optionnel, peut être installé automatiquement avec Cell-ACDC
Cell-ACDC	Francesco Padovani	10.1186/s12915-022-01372-6	Logiciel
Noyaux germinaux de la lignée cellulaire	Cristina Piñ ; eiro Ló ; pez / Ana Rita Rodrigues Neves / Ivana avka	10.17912/MICROPUB. BIOLOGY.001062	Un logiciel de segmentation, optionnel, peut être installé automatiquement avec Cell-ACDC
Cellpose version 2	Carsen Stringer	10.1038/s41592-020-01018-x	Un logiciel de segmentation, optionnel, peut être installé automatiquement avec Cell-ACDC
Cellpose version 3	Carsen Stringer	10.1038/s41592-025-02595-5	Un logiciel de segmentation, optionnel, peut être installé automatiquement avec Cell-ACDC
Cellpose version 4 (Cellpose-SAM)	Marius & nbsp ; Pachitariu	10.1101/2025.04.28.651001	Un logiciel de segmentation, optionnel, peut être installé automatiquement avec Cell-ACDC
Ordinateur	-	-	Voir les spécifications recommandées ci-dessous
Ordinateur - CPU	Quelconque	-	Minimum recommandé de 4 cœurs, 2,5 GHz & nbsp ;
Ordinateur - GPU	Nvidia (préféré) & nbsp ;	-	(Optionnel) Minimum recommandé de 8 Go de VRAM
Ordinateur - Espace disque dur	Quelconque	-	4 Go + 3 x taille du fichier microscopique
Ordinateur - Système d’exploitation	Microsoft, Apple, d’autres	-	Windows, MacOS et Linux sont pris en charge
Ordinateur - RAM	Quelconque	-	3 x taille de fichier en position unique, minimum 16 Go
DeepSea	Abolfazl  ; Zargari	10.1016/j.crmeth.2023.100500	Un logiciel de segmentation et de suivi, optionnel, peut être installé automatiquement avec Cell-ACDC
DeLTA & nbsp ;	Jean-Baptiste Lugagne / Owen M. O' Connor	10.1101/720615 / 10.1371/journal.pcbi.1009797	Un logiciel de segmentation et de suivi, optionnel, peut être installé automatiquement avec Cell-ACDC
InstanSeg	Thibaut Goldsborough	10.48550/arXiv.2408.15954	Un logiciel de segmentation, optionnel, peut être installé automatiquement avec Cell-ACDC
Miniforge	Conda-Forge	-	Lien pour télécharger l’installateur depuis le site de Miniforge : https://conda-forge.org/download/
Omnipose	Kevin Cutler	10.1038/s41592-022-01639-4	Un logiciel de segmentation, optionnel, peut être installé automatiquement avec Cell-ACDC
pomBseen	Makoto Ohira	10.1371/journal.pone.0291391	Un logiciel de segmentation, optionnel, peut être installé automatiquement avec Cell-ACDC
SAM (Modèle Segment Anything)	Alexander Kirillov	10.48550/arXiv.2304.02643	Un logiciel de segmentation, optionnel, peut être installé automatiquement avec Cell-ACDC
StarDist	Uwe Schmidt / Martin Weigert	10.1007/978-3-030-00934-2_30 / 10.1109/WACV45572.2020.9093435 / 10.1109/ISBIC56247.2022.9854534	Un logiciel de segmentation, optionnel, peut être installé automatiquement avec Cell-ACDC
TAPIR	Carl Doersch	10.48550/arXiv.2306.08637	Un logiciel de suivi, optionnel, peut être installé automatiquement avec Cell-ACDC
Trackastra	Benjamin Gallusser	https://doi.org/10.48550/arXiv.2405.1570	Un logiciel de suivi, optionnel, peut être installé automatiquement avec Cell-ACDC
Trackpy	Daniel Allan	10.5281/zenodo.1213240	Un logiciel de suivi, optionnel, peut être installé automatiquement avec Cell-ACDC
YeastMate	David Bunk	10.1093/bioinformatique/btac107	Un logiciel de segmentation, optionnel, peut être installé automatiquement avec Cell-ACDC
OuaZ	Nicola Dietler	10.1038/s41467-020-19557-4	Un logiciel de segmentation et de suivi, optionnel, peut être installé automatiquement avec Cell-ACDC