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Article de méthode

Imagerie calcique in vivo et ex-vivo d’un neurone du circuit olfactif chez la larve de Drosophila melanogaster du troisième stade

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DOI :

10.3791/68956

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31 octobre 2025

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1Department of Biology, University of Nevada, Reno, 2Integrative Neuroscience Program, University of Nevada, Reno, 3Molecular Biosciences Program, University of Nevada, Reno, 4Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Nevada, Reno

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous présentons des protocoles d’imagerie calcique pour un neurone olfactif larvaire de drosophile , en utilisant un adhésif tissulaire topique pour l’immobilisation. Cette méthode améliore la stabilité, facilitant la fiabilité des expériences in vivo et ex-vivo . Les scripts R personnalisés analysent les signaux calciques, fournissant une plate-forme efficace pour des recherches neurophysiologiques détaillées.

Résumé

L’imagerie calcique est cruciale pour l’étude de la dynamique neuronale et du fonctionnement du cerveau. Cependant, les méthodes actuelles d’imagerie du calcium chez les larves de drosophile sont difficiles en raison des artefacts de mouvement et des besoins en équipement spécialisé. Ici, nous présentons une méthode pratique et peu coûteuse pour effectuer une imagerie calcique in vivo et ex vivo chez des larves de drosophile du troisième stade, en utilisant un adhésif tissulaire topique pour immobiliser les échantillons. Nous fournissons également des scripts R personnalisés et un cadre pour l’analyse des données, facilitant les mesures des changements de calcium dans différentes conditions expérimentales. En utilisant cette approche, nous avons réussi à enregistrer des transitoires calciques dans une paire de neurones larvaires du SNC avec des artefacts de mouvement minimaux, démontrant ainsi la reproductibilité entre les préparations. La méthode est compatible avec les systèmes confocaux standard à disque rotatif et peut être adaptée pour des configurations à deux photons DIY ou commerciales, ce qui la rend accessible aux laboratoires disposant de différentes ressources. Cette approche peut accroître l’accessibilité aux études d’imagerie calcique larvaire et peut être adaptée pour examiner les effets des stimuli externes, tels que les odeurs, et des stimuli internes, tels que les neuromodulateurs.

Introduction

Comprendre la dynamique du calcium dans les neurones est crucial pour démêler les mécanismes complexes sous-jacents à la signalisation neuronale et au fonctionnement du cerveau, car les ions calcium jouent un rôle central dans la modulation de l’activité neuronale et les réponses cellulaires aux stimuli. La dynamique neuronale du calcium peut être surveillée grâce à l’imagerie calcique, qui fournit des informations en temps réel sur la signalisation médiée par le calcium dans un large éventail d’organismes, y compris la larve de drosophile. La larve de drosophile est en train de devenir un système modèle puissant pour étudier la fonction de circuit sous-jacente au comportement. C’est l’un des trois seuls organismes pour lesquels un connectome cérébral complet à résolution synaptique a été généré1. La larve se prête à une gamme d’outils sophistiqués qui permettent l’imagerie et la manipulation des neurones à la fois au niveau du cerveau entier et au niveau des neurones uniques 2,3.

La capacité de mesurer la dynamique du calcium dans les neurones larvaires de la drosophile via l’imagerie calcique a été cruciale pour faire progresser la recherche en neurosciences4. Les progrès récents de l’imagerie calcique ont permis de mesurer la dynamique du calcium au niveau des synapses uniques chez la larve5 et des enregistrements multineuronaux chez les larves 6 en mouvementlibre. L’imagerie calcique peut être réalisée in vivo, où les événements calciques sont capturés dans des contextes physiologiques naturels de la larve entière 4,7,8,9, ou ex vivo, où les événements calciques sont enregistrés dans des tissus larvaires disséqués préservés dans des conditions physiologiques simulées10. Dans l’ensemble, les chercheurs ont utilisé diverses itérations de la méthode d’imagerie calcique chez les larves de drosophile pour découvrir les mécanismes fondamentaux des circuits neuronaux, des sensations, de l’apprentissage et de la mémoire, et du comportement 8,11,12,13,14,15,16,17 . Cependant, les études d’imagerie calcique des larves sont limitées en raison de la nécessité d’équipements spécialisés et des problèmes d’interprétation des données dus aux artefacts de mouvement.

Ici, nous présentons une méthodologie rentable et facile à mettre en œuvre pour l’imagerie calcique in vivo et ex vivo chez les larves de Drosophila melanogaster au troisième stade. Nous imaginons la dynamique du calcium dans Keystone-LN, un neurone du circuit olfactifinhibiteur 18,19, dans des préparations larvaires entières pour présenter l’imagerie calcique in vivo, et dans des cerveaux larvaires disséqués pour mettre en valeur l’imagerie calcique ex vivo. Les larves entières et les cerveaux disséqués restent viables et réactifs pendant environ 10 à 15 minutes dans nos conditions d’imagerie, ce qui permet l’acquisition de plusieurs essais de stimulus par échantillon. Pour relever le défi de l’immobilisation de larves entières ou d’échantillons de tissus tout en maintenant la viabilité des tissus et en réduisant la variabilité expérimentale, nous avons optimisé l’utilisation de GLUture, un adhésif topique tissulaire à base de cyanoacrylate biocompatible.

Par rapport aux méthodes traditionnelles d’immobilisation des larves, telles que l’enrobage ou l’épinglage de l’agarose, cette approche à base d’adhésif réduit les artefacts de mouvement tout en préservant la viabilité des tissus20,21 ; Par rapport aux systèmes d’imagerie à deux photons, la configuration à disque rotatif réduit les coûts d’instrumentation et améliore l’accessibilité pour les laboratoires aux ressources limitées. Enfin, nous décrivons des approches d’imagerie simples, associées à des scripts R développés sur mesure pour l’analyse de données. Notre approche peut accroître l’accessibilité aux études d’imagerie calcique larvaire et peut être adaptée pour examiner les effets des stimuli externes, tels que les odeurs, et des stimuli internes, tels que les neuromodulateurs.

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Protocole

1. Préparation des larves de drosophile du troisième stade pour l’imagerie calcique

  1. Maintenir les mouches avec de la nourriture standard (voir le tableau des matériaux) à 25 °C, avec une humidité relative (HR) de 50 à 60 % et un cycle lumière/obscurité de 12 h.
  2. Pour exprimer la protéine fluorescente rouge (RFP) pour l’identification des neurones et GCaMP6f (indicateur de calcium) dans le(s) neurone(s) d’intérêt ('X'), croisez des femelles vierges de la lignée X-Gal4 avec des mâles porteurs de UAS-GCaMP6f et UAS-tdTomato22.
    REMARQUE : Pour cette étude, la lignée Keystone-Gal4 a été utilisée pour stimuler l’expression de tdTomato et GCaMP6f dans une seule paire de neurones locaux inhibiteurs (Keystone-LNs) dans le cerveau larvaire18,19.
  3. Après avoir laissé les mouches mâles et femelles s’accoupler et pondre des œufs pendant 48 h, transférez les adultes dans un flacon frais.
  4. Extraire les larves du troisième stade (environ 120 h après la ponte) en les faisant flotter sur une solution de saccharose à 15 %. À l’aide d’une micropipette P1000, transférez les larves flottantes dans un bécher en verre de 1 000 ml.
  5. Lavez les larves 3 à 4 fois en remplaçant l’eau du bécher par 800 mL d’eau distillée fraîche à chaque fois. Laissez les larves se reposer pendant 10 minutes avant de procéder au reste du protocole.

2. Protocole de famine pour les larves de drosophile du troisième stade (si l’on teste des larves affamées par rapport à des conditions non affamées)

  1. Préparez deux chambres d’alimentation en plaçant un petit carré de lingette de laboratoire dans des boîtes de Pétri de 6 cm. Dans les cas où l’on ne souffre pas de famine, ajouter 350 μL de solution de saccharose 0,2 M ; en cas de famine, ajouter 350 μL d’eau distillée.
  2. Transférez un nombre égal de larves lavées dans chaque chambre d’alimentation. Laisser les larves se nourrir de saccharose (non affamé) ou d’eau distillée (affamée) pendant 2 h à température ambiante.

3. Imagerie calcique in vivo

REMARQUE : Toutes les expériences impliquant l’adhésif tissulaire doivent être menées selon les pratiques de sécurité standard du laboratoire. L’équipement de protection individuelle (EPI), y compris des gants en nitrile, une blouse de laboratoire et des lunettes de sécurité ou un écran facial, est requis ; Les gants en coton doivent être évités en raison des réactions exothermiques avec le cyanoacrylate. Évitez tout contact de l’adhésif avec la peau, les yeux ou les muqueuses. En cas de collage cutané, trempez la zone dans de l’eau chaude savonneuse et séparez-la délicatement ; En cas d’exposition oculaire, rincer à l’eau tiède pendant ≥5 min et consulter immédiatement un médecin. L’adhésif doit être tenu à l’écart des flammes nues et des fortes chaleurs, car l’adhésif durci peut libérer des fumées irritantes s’il est brûlé. Conservez l’adhésif à ≤30 °C, à l’abri de l’humidité et de la lumière directe du soleil, dans un récipient hermétiquement fermé lorsqu’il n’est pas utilisé.

  1. Préparez le tampon d’imagerie calcique avec la composition suivante : NaCl 110 mM, KCl 5,4 mM, CaCl2 1,2 mM, MgCl2 0,8 mM, D-glucose 10 mM et HEPES 10 mM. Conserver à 4 °C lorsqu’il n’est pas utilisé.
    REMARQUE : La solution saline modifiée contenant 110 mM de NaCl est une formulation largement acceptée pour la dissection et l’imagerie du SNC larvaire et se situe dans la plage typique utilisée dans les études d’électrophysiologie et d’imagerie (≈108-128 mM de NaCl)23,24,25,26.
  2. Sur un microscope de 24 x 50 mm (1,5 mm d’épaisseur), créer un puits à l’aide de vaseline distribuée à partir d’une seringue.
  3. Placez une petite goutte d’adhésif tissulaire topique (60 % de cyanoacrylate de 2-octyle et 40 % de cyanoacrylate de n-butyle) au centre du verre de protection. Étalez uniformément l’adhésif en une couche mince et uniforme à l’aide d’une tige de verre.
  4. Transférez soigneusement une seule larve sur l’adhésif à l’aide d’une brosse ou d’un fil fin. Appuyez doucement sur la face ventrale de la larve sur l’adhésif. Laissez sécher l’adhésif, en vous assurant que la larve est complètement immobilisée.
  5. Une fois la larve immobilisée, placez le verre de protection sur la platine du microscope inversé (Figure 1A).

4. Imagerie calcique ex-vivo

  1. Préparez le tampon de dissection larvaire avec la composition suivante : NaCl 110 mM, KCl 5,4 mM, CaCl2 0,3 mM, MgCl2 0,8 mM, D-glucose 10 mM et HEPES 10 mM. Conserver à 4 °C lorsqu’il n’est pas utilisé.
  2. Disséquez les dissections cérébrales telles que décrites par Ishimoto et Sano10. Brièvement, à l’aide d’une brosse ou d’un fil fin, transférez une seule larve dans une boîte de Pétri de 3,5 cm avec un élastomère de silicone superposé au fond.
  3. À l’aide d’un microscope de dissection, positionnez la larve avec sa face ventrale vers le haut et localisez le cerveau. À l’aide de ciseaux de dissection, faites une incision d’environ un tiers de l’extrémité antérieure de la larve. Faites une autre coupe au niveau des crochets de la bouche. Préservez le cerveau tout en retirant les crochets du corps et de la bouche (adapté de Janelia Flylight Protocol27).
  4. Identifiez l’amas de nerfs contenant des motoneurones de la moelle ventrale. À l’aide d’une pince, retirez doucement le cerveau du reste de la larve disséquée. Coupez tout excès de tissu du cerveau.
    REMARQUE : Manipulez doucement - une force excessive peut causer des dommages aux tissus car le cerveau est fragile.
  5. Préparez un verre de protection de microscope avec l’adhésif tissulaire pour l’imagerie calcique comme décrit aux étapes 3.2 à 3.3.
  6. À l’aide d’une micropipette P10, aspirez soigneusement le cerveau disséqué avec 5 μL de solution de dissection de la boîte de Pétri. Expulsez lentement le cerveau sur l’adhésif. Avant que l’adhésif ne sèche, orientez le cerveau en position dorsale vers le haut (avec les deux lobes cérébraux vers le bas et le cordon ventral dorsal vers le haut).
  7. À l’aide d’une micropipette P200, transférez 100 μL du tampon d’imagerie calcique sur le cerveau larvaire immobilisé sur le verre de protection.
  8. Placez la vitre de protection avec le cerveau sur le microscope inversé, relié à un module de scanner confocal à disque rotatif et à une caméra CCD pour l’imagerie calcique (Figure 1B).
    REMARQUE : Pour les préparations ex-vivo, assurez-vous d’orienter correctement le cerveau pendant que la colle est encore humide. Pour une qualité d’image optimale, positionnez le cerveau de manière à ce que le retour d’intérêt soit le plus proche de l’objectif du microscope et évitez d’appliquer un excès de colle près du point d’intérêt.

5. Protocole d’imagerie

  1. Ouvrez le logiciel d’imagerie calcique à l’aide du microscope confocal. Capturez des images à l’aide d’un objectif 10x/1,4 NA avec commutation de filtre entre le laser GFP (excitation 488 nm, intensité 70 %, émission 525 nm/50 m, OD8) et le laser RFP (excitation 561 nm, intensité 50 %, émission 610 nm/75 m, OD8). Réglez l’exposition entre 100 ms et 1 000 ms, le gain à 50 % de la valeur d’exposition correspondante et un facteur de binning de 2 lors de la capture d’image.
  2. Réglez le microscope sur un grossissement de 10x et localisez le cerveau sous un éclairage en fond clair.
  3. Identifiez le neurone d’intérêt en recherchant le signal tdTomato avec le laser RFP (excitation réglée à 561 nm).
    REMARQUE : Sélectionnez la saturation et réduisez le gamma pour régler la valeur d’exposition correcte.
  4. Une fois la région d’intérêt (ROI) identifiée, passez au laser GFP (excitation réglée sur 488 nm) pour capturer les signaux GCaMP6f. Assurez-vous que les signaux tdTomato et GCaMP colocalisent avant de capturer des images de pile des deux canaux.
    REMARQUE : Ajustez les paramètres d’image pour les enregistrements de pile tdTomato et GCaMP6f afin de maximiser la fluorescence.
  5. Capturez simultanément deux enregistrements de séries temporelles distinctes de signaux tdTomato et GCaMP6f à une vitesse de 0,5 image/s (pour un total de 2 min).
    REMARQUE : Le cerveau larvaire disséqué reste viable pendant environ 10 minutes dans ces conditions tampons ; Passé ce délai, les signaux se dégraderont.
  6. Une fois que l’échantillon est prêt à être image, capturez simultanément deux enregistrements de séries temporelles distinctes de signaux tdTomato et GCaMP6f à une vitesse de 0,5 image/s (pour un total de 2 min).
    REMARQUE : Le cerveau larvaire disséqué reste viable pendant environ 10 minutes dans ces conditions tampons ; Passé ce délai, les signaux se dégraderont.
    REMARQUE : Lors de l’analyse quantitative, nous vous recommandons d’augmenter la puissance du laser et d’ajuster le gain d’exposition du détecteur au besoin tout en maintenant une échelle d’intensité linéaire.

6. Traitement et analyse des données

  1. Ouvrez et importez les piles de signaux tdTomato et GCaMP6f dans ImageJ (NIH)28.
  2. Pour identifier la bonne région d’intérêt (ROI), fusionnez les signaux tdTomato et GCaMP6f pour confirmer la colocalisation. Après vérification, séparez les canaux tdTomato et GCaMP6f.
  3. Dans le menu supérieur, sélectionnez Plugins | Nouveau, puis cliquez sur Macros pour lancer une nouvelle macro. Ensuite, importez les macros personnalisées basées sur le retour sur investissement dans ImageJ. Sélectionnez la pile GCaMP6f et appuyez sur Exécuter pour l’analyse du calcium.
  4. Traitez les signaux de fluorescence à l’aide d’une macro ImageJ personnalisée (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging). La macro génère d’abord des projections d’intensité maximale, effectue une correction de mouvement à l’aide du plug-in StackReg (mode d’enregistrement rigide)29 et applique une correction de blanchiment.
  5. Une fenêtre contextuelle « Action requise » s’affichera pour demander une sélection manuelle du retour sur investissement, ce qui permet aux utilisateurs de dessiner manuellement un retour sur investissement large. Cliquez sur OK pour poursuivre l’analyse. Pour effectuer une correction de mouvement, assurez-vous que la boîte rectangulaire couvre l’intégralité de la valeur d’intérêt dans toutes les images pour une correction de mouvement précise tout en conservant l’espace local et la forme de la zone d’intérêt sur toutes les images.
    REMARQUE : Les enregistrements ont été enregistrés dans ImageJ à l’aide de StackReg. Lorsque le mouvement dans le plan était important (déplacement XY cumulé > 1 μM) ou que la dérive axiale en Z entraînait une perte de mise au point, le repérage devenait peu fiable ou l’échantillon était entièrement perdu de la fenêtre d’imagerie. Ainsi, les échantillons présentant une dérive extrême ou une baisse des signaux calciques (>30 %) ont été automatiquement étiquetés et exclus de l’analyse en aval pour garantir des mesures précises de l’activité neuronale. Ces seuils sont conformes aux pratiques de contrôle de la qualité couramment appliquées dans les études d’imagerie calcique 30,31,32,33. L’exclusion a également permis de s’assurer que seuls des enregistrements stables avec des transitoires calciques fiables liés à des stimuli ont été utilisés pour les analyses.
  6. Pour l’analyse, extraire des traces de fluorescence à partir de ROI circulaires définis manuellement, guidés par l’autocorrélation des pixels ; ces zones d’intérêt engloberont l’ensemble du champ des neurones clés.
    1. Extrayez les données brutes d’intensité de fluorescence pour deux fluorophores : GCaMP6f/GFP et tdTomato/RFP, à l’aide de macros personnalisées dans ImageJ (v1.54p) (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging, voir Tableau des matériaux).
    2. Appliquez une fenêtre coulissante avec un retour d’intérêt de 20 x 20 pixels et une taille de pas de 10 pixels dans le champ de vision. Pour chaque retour sur investissement, la macro calculera : (1) l’intensité sur toutes les images, (2) la différence de fluctuation de référence (c’est-à-dire la différence entre les valeurs d’intensité maximale et minimale pendant les 10 premières images) et (3) la variation d’intensité maximale d’une image à l’autre (ΔF). Les retours sur investissement présentant des fluctuations d’intensité inférieures à 10 unités seront éliminés, et seules les valeurs ΔF les plus nettes seront sélectionnées pour une analyse plus approfondie.
    3. Normalisez les traces de fluorescence à l’aide des méthodes suivantes :
      1. Normalisation Fmax et Fmin : Calculez Δ normalisé à l’aide de la formule :
        figure-protocol-1
        Où F est la fluorescence brute à chaque point temporel, Fmin est la fluorescence minimale (ligne de base) et Fmax est la fluorescence maximale pendant l’enregistrement.
      2. Normalisation ΔF/F 0 : De plus, effectuez la normalisation ΔF/Fo, où Fo (ligne de base) est déterminé par les 10 premières images de chaque enregistrement, à l’aide de la formule :
        figure-protocol-2
        Où Ft est la fluorescence à l’instant t, et F0 est la valeur de base calculée à partir des 10 premières images.
  7. Après avoir extrait les signaux GCaMP6f, cliquez avec le bouton gauche de la souris et sélectionnez tout, couper et coller pour transférer toutes les valeurs vers une nouvelle feuille de calcul Excel. Dans la barre de menu supérieure, sélectionnez Données | Texte en colonnes. Une fenêtre contextuelle de l’assistant « Texte en colonne » apparaîtra. À l’étape 1, sélectionnez Délimité, puis cliquez sur Suivant. À l’étape 2, sous Délimiteurs, sélectionnez Onglet et virgule, puis cliquez sur Suivant. À l’étape 3, sélectionnez Terminer.
    FACULTATIF : Pour tracer les signaux calciques normalisés, mettez Fnorm_FminFmax en surbrillance et sélectionnez Nuage de points.
  8. Recherchez un fichier .csv généré contenant : (1) les valeurs de fluorescence brutes F, (2) ΔF/Fo et (3) Fnorm (intensité de fluorescence normalisée). Organisez l’ensemble de données final en quatre colonnes : (1) temps (images), (2) état de l’échantillon (affamé ou alimenté), (3) ID de réplication (échantillon individuel) et (4) intensité normalisée (valeurs Fnorm échelonnées de 0 à 1).
  9. Enfin, effectuez l’analyse et la visualisation des données en R à l’aide de scripts R personnalisés (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging. voir la Table des matériaux).
    1. Importez le script R personnalisé dans un nouveau projet R. Assurez-vous que les packages R requis, y compris ggplot2, dplyr et readr, sont installés et mis à jour avant d’exécuter l’analyse.
    2. À partir de la ligne 1 du script R personnalisé, appuyez sur Exécuter en continu pour effectuer l’analyse du calcium. Assurez-vous également que la sortie comprend des cartes thermiques illustrant l’intensité calcique normalisée pour les 30 premières images, les 60 images et toutes les images de l’enregistrement de la série chronologique, ainsi que des boîtes à moustaches pour montrer la médiane des intensités normalisées.
    3. Évaluer la signification de l’intensité calcique normalisée à l’aide du test U de Mann-Whitney.

7. Élimination et décontamination des déchets

  1. Après les expériences, retirez les débris grossiers des outils et des surfaces sous l’eau courante, puis désinfectez avec de l’éthanol à 70 % ou de l’eau de Javel à 10 % suivi d’eau stérile. Travailler sur une surface désinfectée et se laver les mains après avoir retiré le gant ; Ne mangez pas et ne buvez pas en laboratoire.
  2. Placez les tissus larvaires et les produits jetables contaminés dans des sacs à risques biologiques et un autoclave avant de les éliminer.
  3. Jeter les déchets adhésifs entièrement durcis dans les ordures ménagères ; Les adhésifs non durcis et les produits jetables contaminés doivent être collectés dans un conteneur de déchets chimiques dangereux scellé et étiqueté.
  4. Placez tous les objets tranchants (lames, aiguilles, verre brisé) dans un contenant résistant aux perforations.
  5. Recueillir les solvants inflammables (éthanol, acétone) dans des contenants de déchets inflammables étiquetés.

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Résultats

Pour démontrer notre approche d’imagerie calcique larvaire, nous l’avons appliquée avec succès à des préparations in vivo et ex-vivo de larves de drosophile (Figure 2 et Figure 3, Vidéo 1, Vidéo 2, Vidéo 3 et Vidéo 4). Nous avons mesuré la dynamique calcique chez des larves de drosophile exprimant GCaMP6f et Td-Tomato dans une seule paire de Keystone-LNs dans le cerveau larvai...

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Discussion

Ici, nous décrivons une approche pour l’imagerie calcique in vivo et ex-vivo chez les larves de Drosophila melanogaster au troisième stade. Nous avons imagé la dynamique calcique chez Keystone-LN, un neurone local inhibiteur chez la larve de drosophile . Nous avons mesuré la dynamique calcique de Keystone-LN dans des préparations larvaires entières (in vivo) et dans des préparations disséquées du cerveau larvaire (ex vivo) (

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Nous sommes reconnaissants envers le Dr Jeffrey Harper, qui a mis à notre disposition le microscope confocal à disque rotatif de son laboratoire pour ces expériences. Nous sommes reconnaissants pour le cadeau de la ligne de mouche : w ; UAS-GCaMP6f/CyO, pleurer ; UAS-tdTomato du Dr Jung Hwan Kim. Ce travail a été soutenu par des fonds de la National Science Foundation sous les numéros de prix 2341202 et 2129234. La figure 1 a été créée à l’aide de Biorender.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Actions de mouches & Entretien
Nourriture pour mouches NutriflyGenesee Scientific66-112
UAS-GCaMP6f, tdTomatoDon du Dr JH Kim & nbsp ;
w;; Keystone-Gal4 (GMR27F08-GAL4)BDSC49232
Protocole de réactifs pour la famine
Boîte de Petri de 6 cmGenesee Scientific32-106G
SaccharoseMillipore SigmaS0389-500G
Réactifs pour tampon d’imagerie et de dissection
Chlorure de calciumJ.T. Baker, Avantor SciencesJT1311-1CAS : 1311-01, 500g
D-(+)-glucoseThermo Fisher ScientificA16828.36CAS : 50-99-7, 500g
HEPES-2-[4-(2-Hydroxyéthyle)-1-piperazinyl]-acide éthanosulfoniqueJ.T. Baker, Avantor SciencesJT4018-1CAS : 4018-01, 100g
Chlorure de magnésiumVWR97064-150CAS : 7786-30-3, 100g
Chlorure de potassiumThermo Fisher ScientificJ64189.36CAS : 7447-40-7, 500g
Chlorure de sodiumEMD Milipore SigmaEMD-SX0420-1CAS : 7647-14-5, 500g
Outils et réactifs pour la dissection
Tampon de dissectionComposition fournie dans le texte
Plaques de Petri Olympus, 60 x 15 mm ventiléesGenesee Scientific32-105
Base en élastomère Sylgard 184Sciences de la microscopie électronique24236-10A
Agent de durcissement à base d’élastomère Sylgard 184Sciences de la microscopie électronique24236-10B
Pince à épiler Style 5, EMSSciences de la microscopie électronique78320-5
Ciseaux à ressort Vannas - Tranchant de 3 mmOutils scientifiques finement15000-00
Imagerie et montage des équipements/réactifs
Module de scanner confocalYokogawaCSU-W1Connecté au microscope
Tampon d’imagerieComposition fournie dans le texte
Microscope inverséLeica MicrosystemsDMi8  ;Connecté à un module de scanner confocal à disque tournant et à une caméra CCD
Verre de couverture microscopique, 24 mm x 50 mm, épaisseur # 1,5Globe Scientific Inc.1415-15
Adhésif topique MWI Veterinary GLUTUREFisher ScientificNC0632797
Vaselée pureWalgreens912556
Liens vers des ressources publiques
BioRenderhttps://www.biorender.com/
ImageJNIH912556https://imagej.net/ij/
Vidéo du protocole Janelia Flylighthttps://www.janelia.org/https://www.youtube.com/watch?v=UVCPmuu2b6o
Mathew Lab Githubhttps://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging

Références

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  11. Maier, G. L., Komarov, N., Meyenhofer, F., Kwon, J. Y., Sprecher, S. G. Taste sensing and sugar detection mechanisms in Drosophila larval primary taste center. Elife. 10, (2021).
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