Les lignées cellulaires résistantes aux médicaments permettent de comprendre les mécanismes de résistance aux traitements et d’évaluer non cliniquement de nouveaux composés, de médicaments repositionnés et de thérapies combinées. Cet article présente un protocole pour créer des lignées cellulaires résistantes en exposant les lignées cellulaires parentales à des augmentations progressives de la concentration du médicament cible.
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Article de méthode
Développement de lignées cellulaires résistantes aux médicaments pour des procédures expérimentales
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le développement de lignées cellulaires résistantes aux médicaments est essentiel pour comprendre les mécanismes de résistance aux médicaments et identifier des stratégies pour surmonter l’échec du traitement du cancer. Les modèles de résistance permettent l’évaluation préclinique de nouveaux composés, de médicaments repositionnés et de thérapies combinées. Pour générer des cellules résistantes, les lignées cellulaires cancéreuses parentales sont exposées à plusieurs reprises à des concentrations croissantes du médicament cible pendant plusieurs semaines. Les cellules qui survivent et prolifèrent à chaque étape sont sélectionnées, développées et exposées à des doses de médicament plus élevées. Le développement de la résistance est confirmé par la quantification et la comparaison des valeurs de concentration inhibitrice demi-maximale (CI50) entre les cellules parentales et résistantes à l’aide de tests de viabilité cellulaire et d’analyses de régression non linéaires. Une augmentation significative des valeurs CI50 indique une adaptation réussie à la pression médicamenteuse et le développement d’une résistance. Ces lignées cellulaires résistantes aux médicaments sont disponibles pour des analyses complètes, telles que le séquençage de microréseaux et de cellules uniques, ainsi que pour diverses expériences in vitro ou in vivo . Ces modèles fournissent des outils précieux pour étudier des stratégies thérapeutiques potentielles visant à surmonter la résistance aux médicaments.
Introduction
La chimiothérapie est l’option de traitement la plus fréquemment utilisée pour les cancers locaux qui ne se prêtent pas à la chirurgie ou à la radiothérapie ou les cancers métastatiques. Les médicaments moléculaires ciblés et la chimiothérapie sont utilisés comme traitements de première intention pour de nombreuses tumeurs malignes, et leur efficacité est largement reconnue. Certains cancers présentent une résistance à certains médicaments dès le début du traitement, ce qui rend le traitement inefficace. Cependant, dans des cas plus fréquents, le traitement qui était initialement efficace devient inefficace en raison du développement d’une résistance aux médicaments, entraînant la progression du cancer.
La résistance aux médicaments est causée à la fois par des mutations génétiques ou une réponse épigénétique dans les cellules cancéreuses qui induisent l’expression de produits géniques qui échappent aux médicaments ou favorisent la croissance cellulaire 1,2. De plus, dans de nombreux cas, cette résistance évolue vers une multirésistance aux médicaments, où la cellule cancéreuse devient résistante à plusieurs médicaments 3,4. Par conséquent, l’identification des mécanismes de résistance aux médicaments et l’élaboration de stratégies pour la surmonter sont extrêmement importantes pour l’avancement du traitement du cancer.
Les lignées cellulaires résistantes aux médicaments sont des modèles fréquemment utilisés pour étudier les mécanismes de résistance thérapeutique et jouent un rôle important dans les expériences in vitro et in vivo 5. Ces modèles sont des outils essentiels pour mieux comprendre les voies d’action des médicaments, identifier les biomarqueurs qui influencent l’efficacité thérapeutique et trouver des stratégies thérapeutiques pour inhiber la formation de résistance aux médicaments. Le processus de base de la création d’une lignée cellulaire résistante aux médicaments consiste à induire une résistance en exposant une lignée cellulaire à des niveaux croissants du médicament cible 3,6.
La concentration utilisée et la durée de l’exposition au médicament sont des éléments essentiels de ce processus. À chaque niveau de concentration, le sous-ensemble de cellules qui survivent est amplifié, puis exposé à la concentration suivante de médicament de manière répétitive. En fin de compte, on obtient une lignée cellulaire résistante aux médicaments qui présente une concentration inhibitrice demi-maximale (CI50) accrue pour le médicament par rapport à la lignée cellulaire parentale. Ce rapport décrit en détail la procédure de génération d’une lignée cellulaire résistante au paclitaxel (DU145-TxR) à partir de la lignée cellulaire du cancer de la prostate humaine DU145, en utilisant une méthode par étapes avec des expositions intermittentes à des médicaments.
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Protocole
1. Culture cellulaire et tests de viabilité cellulaire
REMARQUE : Le paclitaxel est un médicament anticancéreux et est cytotoxique. Lorsque vous le manipulez, portez une blouse, des lunettes de protection et des gants, et travaillez à l’intérieur d’une armoire de sécurité pour éviter l’inhalation dans le corps. Le DMSO n’est pas hautement cytotoxique, mais lorsqu’il entre en contact avec la peau ou les muqueuses, la perméabilité des médicaments dissous augmente, alors portez une blouse, des lunettes et des gants lorsque vous le manipulez.
- Cultiver des cellules DU-145 dans une boîte de culture cellulaire de 10 cm à l’aide d’un milieu complet (RPMI-1640 + 1 % de pénicilline-streptomycine [pen-streptomycine] + 10 % de sérum de veau fœtal [FBS]) dans un incubateur à 37 °C à 5 % de CO2 jusqu’à 80 % de confluent.
- Aspirez le milieu de culture, lavez-le avec du DPBS, ajoutez 0,05 % de trypsine et laissez-le dans l’incubateur pendant 5 min.
- Après avoir tapoté et confirmé par microscopie que les cellules sont détachées de la plaque et flottent, ajoutez 1 mL de milieu complet pour arrêter l’action de la trypsine.
- Comptez le nombre de cellules et ensemencez-les à une densité de 1,0 × 104/99 μL par puits en milieu complet dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Incuber pendant 2 h pour permettre aux cellules d’adhérer au fond de la plaque. Les cellules doivent être plaquées en trois ou en quatre exemplaires pour chaque groupe d’essai.
- Ajustez le paclitaxel et le DMSO à ajouter dans chaque puits. Assurez-vous que la quantité de DMSO ajoutée à chaque puits est la même et que la concentration finale de DMSO ne dépasse pas 1 %.
- Pour ce faire et en suivant notre protocole, commencez avec 10 mM de paclitaxel dans du DMSO et ajoutez 87,2 μL de DMSO à 12,8 μL de ce médicament dans un tube pour obtenir 100 μL de paclitaxel à 1 280 μM.
- Transférez 50 μL de cette solution dans un autre tube et diluez-la à mi-concentration avec 50 μL de DMSO (640 μM).
- Répéter cette procédure pour effectuer une dilution en série et préparer des solutions de paclitaxel à des concentrations de 0 (DMSO seulement), 0,1, 0,5, 1, 2, 4, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 620 et 1 280 μM.
REMARQUE : Le paclitaxel dilué avec du DMSO doit être conservé congelé pour être réutilisé dans des expériences ultérieures (pour minimiser les cycles de gel-dégel, le conserver dans des aliquotes).
- Diluez 1 μL de la solution de paclitaxel préparée précédemment avec 9 μL de milieu complet dans un tube séparé, et ajoutez-en 1 μL dans chaque puits 2 h après l’ensemencement des cellules. Les concentrations de paclitaxel dans chaque puits seront de 0, 0,1, 0,5, 1, 2, 4, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 620 et 1 280 nM, chaque puits contenant 100 μL de milieu.
REMARQUE : Lors de la définition de la concentration des médicaments utilisés dans les essais de viabilité cellulaire, vérifiez les valeurs IC50 publiées dans des articles précédents et assurez-vous que la concentration se situe dans la plage3. La concentration de DMSO dans chaque puits était de 0,1 % (moins de 1 % est souhaitable). - Incubation pendant 48 h. Ajouter 10 μL de réactif de prolifération cellulaire WST-1 dans chaque puits (100 μL de milieu de culture) et incuber pendant 0,5 à 4,0 h supplémentaires.
REMARQUE : Le temps d’incubation optimal dépend de la lignée cellulaire et de la densité cellulaire. Dans cette étude, nous avons cultivé des cellules pendant environ 1,5 h. Si le temps d’incubation est trop court ou trop long, l’absorbance de chaque puits sera trop faible ou trop élevée à l’étape suivante. Par conséquent, il ne sera pas possible de confirmer la différence de viabilité cellulaire. Ainsi, pour les tests initiaux, il faut tester plusieurs temps d’incubation pour confirmer le temps d’incubation approprié. - Mesurez l’absorbance de WST-1 à l’aide d’un lecteur de microplaques.
REMARQUE : L’absorbance cible est de 450 nm (420-480 nm est recommandé) et l’absorbance de fond est de 650 nm (600 nm ou plus est recommandé).
2. Calcul de la viabilité cellulaire et de la concentration inhibitrice demi-maximale (CI50)
- Calculez la viabilité cellulaire à partir de l’absorbance. L’absorbance est de (A450nm-A650nm).
Viabilité cellulaire ( %) = [(As-Ab)/(Ac-Ab)] × 100
En tant que : absorbance d’échantillon (cellules traitées par médicament)
Ab : absorbance à blanc (moyenne seulement, pas de cellules)
Ac : contrôle de l’absorbance (cellules non traitées par médicament) - Résumez la viabilité cellulaire calculée dans la section précédente dans un tableur.
- Calculez et enregistrez l’IC50 pour les cellules parentales par analyse de régression non linéaire.
REMARQUE : Le modèle logistique à quatre paramètres (4PL) est souvent une méthode de calcul appropriée. Des outils de calcul IC50 en ligne sont disponibles7. Cependant, le modèle 4PL ne doit pas être utilisé lorsque l’efficacité du composé est en dehors de la plage de concentration et que les données ne peuvent pas représenter entièrement les asymptotes inférieure et supérieure de la courbe sigmoïde.- Pour éviter une telle augmentation, mesurez la viabilité cellulaire à autant de points de concentration que possible. S’il n’est pas possible d’obtenir une courbe sigmoïde, utilisez un mode à deux ou trois paramètres avec des valeurs minimales et maximales fixesde 7.
- Si vous n’utilisez pas de logiciel de calcul ou de logiciel statistique, y compris ceux disponibles sur le Web, utilisez la formule suivante :
IC50=((50-C)(B-A) + A(D-C))/(D-C)
R : La valeur la plus basse parmi les concentrations de médicament mesurées avec une viabilité cellulaire de ≤50 %
B : La valeur la plus élevée parmi les concentrations de médicament mesurées avec une viabilité cellulaire de >50 %
C : Viabilité cellulaire à B
D : Viabilité cellulaire à A
REMARQUE : Cette formule suppose que le graphique entre les deux points prenant en sandwich la valeur IC50 est une ligne droite.
3. Exposition aux drogues
REMARQUE : La figure 1 donne un aperçu des procédures décrites dans cette section.
- Grainer des cellules parentales sur des plaques de culture cellulaire (2,0 × 106 cellules/boîte pour des boîtes de 100 mm).
- Ajouter le paclitaxel à une concentration inhibitrice de la viabilité cellulaire de ~10-20 % (IC10-20, ~0,5 nM dans ce cas) au milieu et cultiver dans un incubateur pendant 2 jours.
- Remplacer par un milieu sans paclitaxel et incuber pendant plusieurs jours.
- Une fois que les cellules ont grandi et sont devenues confluentes à 80 %, passez-les dans une nouvelle plaque de culture cellulaire. Cryoconservez les cellules restantes.
- Ajouter le paclitaxel dans les cellules passées à une concentration de ~1,5-2,0 fois la concentration de départ (0,75-1 nM). Incuber en incubateur pendant 2 jours.
- Remplacer par un milieu sans paclitaxel et incuber pendant plusieurs jours.
- Si les cellules se développent de la même manière, répétez les étapes 3.4-3.6, en augmentant progressivement la concentration d’exposition au paclitaxel.
REMARQUE : L’augmentation de la concentration du médicament (1,5-2,0 fois) peut être librement réglée par l’expérimentateur, et l’expérience doit être répétée à cette concentration. Nous recommandons de congeler et de stocker les cellules chaque fois que la concentration du médicament est augmentée. Si la concentration de paclitaxel continue d’augmenter, la prolifération cellulaire peut ne pas se rétablir et les cellules peuvent mourir. Dans de tels cas, décongelez les cellules qui ont proliféré à la concentration avant la mort, réduisez l’augmentation du paclitaxel à 1,1-1,5 fois (1,2 fois est recommandé) et répétez la culture. - Augmentez progressivement la résistance de la lignée cellulaire au médicament, puis calculez et enregistrez la CI50 à l’aide de WST-1 et du logiciel comme décrit dans la section 2.
REMARQUE : Si une augmentation de l’IC50 d’au moins 3 à 5 fois est observée, il peut être déterminé que la souche est une lignée cellulaire résistante aux médicaments.
4. Maintien de la résistance aux médicaments
- Pour maintenir le phénotype résistant de la lignée cellulaire résistante aux médicaments, incuber avec une concentration de médicament deIC 10-20.
REMARQUE : Il est recommandé de mesurer périodiquement la CI50 dans un test de survie cellulaire, car la résistance aux médicaments peut changer.
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Résultats
En utilisant cette méthode, nous avons précédemment passé 9 mois à établir avec succès des cellules DU145 résistantes au paclitaxel (DU145-TxR). Les résultats de l’essai de viabilité cellulaire ont montré que la valeur IC50 du paclitaxel pour la lignée cellulaire parentale DU145 était de 1,1 nM, tandis que la valeur IC50 pour DU145-TxR était 149,6 fois plus élevée que celle de la lignée cellulaire parentale (CI50 : 164,6 nM) (tableau 1 et figure 2
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Discussion
Le développement de lignées cellulaires cancéreuses résistantes aux médicaments est une méthode établie pour étudier la toxicité des médicaments et les mécanismes de résistance, mais le premier défi auquel les chercheurs sont confrontés est de choisir un modèle approprié pour exprimer la résistance. Une méthode courante pour créer des lignées cellulaires résistantes aux médicaments in vitro consiste à exposer la lignée cellulaire au médicament cible, mais il est nécessaire de déterminer ...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas de conflits d’intérêts potentiels.
Remerciements
Ce travail a été soutenu en partie par la subvention P01 CA093900 des National Institutes of Health.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,05 % Trypsine-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 10 mL Pipette sérologique jetable | Fisher scientific | 13-678-11E | |
| Boîte de 100 mm | Corning | 353003 | |
| Tube conique de 15 mL | Corning | 352097 | |
| 2,0 mL Flacons cryogéniques | Corning | 431386 | |
| 96 puits Plaque | de culture cellulaireCorning | 353072 | |
| Lame de chambre de comptage cellulaire | Invitrogen | C10228 | |
| Réactif de prolifération cellulaire WST-1 | Sigma | 5015944001 | |
| Centrifuge 5702 R | eppendorf | ||
| innombrables II | Invitrogen | Compteur de cellules | |
| Diméthyl sulfoxyde | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | D4W2J | |
| DU145 | ATCC | HTB-81 | Lignée cellulaire du cancer de la prostate |
| EVOS FLc | Thermo Fisher Scientific | Microscope numérique inversé | |
| FBS | Gibco | Gibco A5670701 | |
| Paclitaxel | Selleck | S1150 | |
| Pénicilline&ndash ; streptomycine | Invitrogen | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Synergy H1 | BioTek | Lecteur de microplaques | |
| Trypan Blue solution 0,4 % | Invitrogen | 15250061 |
Références
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- Emran, T. B., et al. Multidrug resistance in cancer: understanding molecular mechanisms, immunoprevention and therapeutic approaches. Fron Oncol. 12, 891652(2022).
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- Abelman, R. O., et al. TOP1 mutations and cross-resistance to antibody-drug conjugates in patients with metastatic breast cancer. Cli Cancer Res. 31 (10), 1966-1974 (2025).
- McDermott, M. In vitro development of chemotherapy and targeted therapy drug-resistant cancer cell lines: a practical guide with case studies. Fron Oncol. 4, 40(2014).
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- Sakai, W. Functional restoration of BRCA2 protein by secondary BRCA2 mutations in BRCA2-mutated ovarian carcinoma. Cance Res. 69 (16), 6381-6386 (2009).
- Schnepp, P. M., et al. Single-cell transcriptomics analysis identifies nuclear protein 1 as a regulator of docetaxel resistance in prostate cancer cells. Mo Cancer Res. 18 (9), 1290-1301 (2020).
- Grigoreva, T., Sagaidak, A., Novikova, D., Tribulovich, V. New insights into chemoresistance mediated by Mdm2 inhibitors: the benefits of targeted therapy over common cytostatics. Biomedicines. 12 (3), 547(2024).
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Réimpressions et autorisations
