Réalisation d’une collecte de données tomographiques de haute qualité à l’aide du microscope électronique à transmission 200 kV avec système de lentilles à double condenseur

Summary

La tomographie électronique permet l’imagerie au niveau quasi atomique des organites, des cellules et des macromolécules dans les tissus d’échantillons cryo-biologiques. Atteindre une telle résolution nécessite des conditions d’imagerie strictement contrôlées. Ici, en utilisant un microscope électronique à transmission de 200 kV avec un système de lentille à condensateur à deux étages comme exemple, nous décrivons comment effectuer une collecte de données de tomographie électronique de haute qualité.

Abstract

La cryotomographie électronique (cryo-ET) s’est imposée comme une technique puissante pour élucider les structures des organites cellulaires et des grands complexes protéiques dans leur environnement naturel. Contrairement à la microscopie électronique conventionnelle à température ambiante, la cryo-ET minimise les dommages aux structures internes induits par les radiations et la préparation. De plus, contrairement à l’analyse à particule unique (SPA), la cryo-ET réduit le besoin de purification répétée, préservant ainsi les informations structurelles les plus authentiques des échantillons. Pour obtenir une imagerie haute résolution, la cryo-ET impose également des exigences strictes sur les conditions d’imagerie du TEM. Malgré l’amélioration continue de l’efficacité de l’acquisition de données cryo-ET et l’émergence de nombreuses plateformes logicielles, la plupart des solutions sont propriétaires, spécifiques au fournisseur et étroitement couplées à certains modèles de microscopes électroniques, entraînant des coûts de mise en œuvre élevés. Dans cette étude, nous avons installé le logiciel open source SerialEM sur un microscope électronique 200 kV (cryo-TEM Glacios 2) avec un système de lentilles à double condensateur et réalisé des calibrations complètes permettant une acquisition de données tomographiques de haute qualité. En utilisant l’apoferritine comme échantillon modèle, nous décrivons l’ensemble du flux de travail : de la préparation de l’échantillon cryogénique à la collecte automatisée des données de cryo-ET, suivies de la reconstruction par tomographie et de l’analyse par sous-tomographie. Cette méthode offre une solution économique et accessible pour la collecte de données cryo-ET, en particulier pour les laboratoires utilisant des microscopes Glacios sans accès à un logiciel propriétaire.

Introduction

La cryotomographie électronique (cryo-ET) s’est imposée comme une technique puissante pour étudier les structures natives des complexes macromoléculaires et des organites cellulaires in situ. Un avantage majeur de la cryo-ET par rapport à l’analyse à particule unique (SPA) est sa capacité à éviter les étapes de purification excessives, préservant ainsi l’état natif des biomolécules cibles dans leur contexte biologique. Actuellement, un large éventail d’échantillons — incluant les organites^purifiés 1,2,3,4, les feuilles de membrane cellulaire, les complexes^{macromoléculaires 5},^{les virus 6}, les lamelles^{cellulaires 7} et les sections tissulaires ^8,9,10 -- peuvent être étudiés par cryo-ET. Compte tenu de la diversité des types d’échantillons et des objectifs expérimentaux, les stratégies de collecte de données varient considérablement et doivent être soigneusement adaptées à la fois à l’échantillon et à la configuration spécifique de l’instrument.

La collecte de données est une étape cruciale dans le flux de travail cryo-ET, car la qualité des données et l’efficacité de l’acquisition impactent directement le traitement en aval et le succès global de l’expérience. Pour répondre aux besoins expérimentaux évolutifs, plusieurs plateformes de collecte de données ont été développées. Parmi les plus utilisés figurent la tomographie commerciale et le logiciel open source^{SerialEM 11, 12, 13}. La tomographie offre une interface très intégrée et conviviale avec une courbe d’apprentissage faible, mais elle est moins flexible et nécessite une licence commerciale. En revanche, SerialEM est un logiciel libre et open source, prenant en charge à la fois les flux de travail basés sur interfaces graphiques (GUI) et basés sur des scripts, offrant une plus grande flexibilité et extensibilité.

La collecte de données tomographiques à partir de cryo-lamelles pose des défis uniques. Les lamelles de haute qualité sont difficiles à préparer, et leur instabilité mécanique ainsi que leur grande sensibilité à l’irradiation électronique compliquent encore la collecte des données. Pour relever ces défis, Fabian Eisenstein a développé le flux de travail^{PACEtomo 14}, une amélioration de SerialEM qui introduit un décalage d’image faisceau pour acquérir plusieurs tomogrammes par série d’inclinaison, réduisant ainsi la fréquence des ajustements de mise au point et de suivi. Cette stratégie maximise la quantité de données utilisables de chaque section tout en minimisant l’exposition inutile aux électrons. Des fonctionnalités similaires sont également disponibles dans le logiciel commercial Tomography5.

En revanche, la collecte de données à partir d’organites cryofixés ou de feuilles membranaires est généralement plus simple, car ces échantillons sont généralement préparés sur des grilles de carbone trouées, offrant une ampleur d’espace pour la focalisation et le suivi^15,16. Dans de tels cas, les flux de travail d’acquisition cryo-ET intégrés de SerialEM — accessibles directement via son interface graphique — offrent une option pratique sans scripting, particulièrement adaptée aux débutants ou aux petits laboratoires. Néanmoins, du point de vue de l’efficacité, nous recommandons toujours des stratégies basées sur le décalage d’image du faisceau dès que possible.

Compte tenu du coût élevé des cryo-microscopes électroniques, il est essentiel d’optimiser les stratégies de collecte de données pour maximiser l’utilisation des instruments. Un MET de 200 kV équipé d’un système de lentille à condensateur à deux étages offre une pénétration d’électrons légèrement inférieure pour des échantillons épais qu’un instrument de 300 kV, mais il reste pleinement viable pour la cryo-ET lorsqu’il est correctement calibré. Cependant, sa plage relativement étroite de conditions de faisceau parallèle et sa taille de point fixe à travers les grossissements le rendent généralement moins adapté à la cryo-ET haute résolution, sauf si le système est précisément optimisé.

Notre système de microscopie électronique est équipé d’une caméra Falcon 4i à détection directe d’électrons, qui offre des avantages substantiels en capacité de comptage d’électrons simples et en imagerie continue à haute vitesse. Pour exploiter pleinement les performances de ce détecteur, le MET doit être utilisé dans des conditions d’imagerie bien optimisées. Pour les TEM utilisant un système de condensateur à deux étages, un étalonnage précis des conditions d’éclairage pour la lumière parallèle est un facteur important pour améliorer la qualité d’image^. Dans les systèmes modernes de condensateur à deux étages, le point focal de la lentille condensatrice de deuxième étage doit coïncider avec le plan focal avant de la lentille objective supérieure afin de garantir que le chemin optique croisant le plan de l’échantillon soit parallèle. Des conditions de lumière parallèles précisément établies sont cruciales pour garantir que les valeurs de sous-focus et le grossissement restent constants aux positions locales dans les images collectées.

Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur l’établissement d’un flux de travail cryo-ET de haute qualité en utilisant l’apoferritine comme échantillon modèle. Comme le système de microscope électronique à transmission 200 kV n’est pas licencié pour le logiciel de tomographie commercial, nous avons installé et calibré la plateforme open source SerialEM à la place. En optimisant soigneusement les paramètres du faisceau parallèle pour le système de lentille condensatrice à deux étages du microscope, nous avons obtenu la collecte automatisée des données tomographiques via l’interface graphique SerialEM — sans avoir besoin de scripts Python ni de configurations complexes. Cette approche offre une solution conviviale et économique pour l’acquisition efficace de données cryo-ET sur des instruments 200 kV tels que Glacios.

Protocol

1. Préparation et chargement des échantillons cryogéniques

1. Pour préparer le Vitrobot, allumez-le et réglez la température à 10 °C. Réglez l’humidité à 100 %. Remplacez le papier filtre.
2. Placez une grille de pellicule carbone R1.2/1,3 de 300 mailles à trous dans le système de décharge phosphorescente. Régler les conditions de décharge de glow à 15 mA pendant 60 s avec une pression sous vide de 0,39 mBar, charge négative. Effectuez la décharge lumineuse pour hydrophiliser la surface de la grille.
3. Réglez les paramètres de Vitrobot comme suit : temps de tache : 3 s, temps d’attente : 0 s, force de blot : 2, température : 8 °C, humidité : 90 %.
4. Préparez de l’éthane liquide dans un gobelet d’éthane enveloppé dans de l’azote liquide en refroidissant avec de l’azote liquide.
5. Appliquez 3 μL d’échantillon d’apoferritine sur la grille à décharge luminescente. Vitrifierez immédiatement l’échantillon dans de l’éthane liquide
6. Transférez l’échantillon de l’éthane vers une boîte de stockage pré-refroidie dans de l’azote liquide. La préparation de l’échantillon cryogénique est maintenant terminée.
   ATTENTION : Les protocoles de sécurité suivants doivent être strictement respectés lors de la manipulation d’azote et d’éthane liquides : Un équipement de protection individuelle (par exemple, gants cryogéniques et lunettes de sécurité) est nécessaire pour prévenir les engelures pendant les opérations ; Avant la condensation de l’éthane, assurez-vous que la coupe réceptrice est exempte d’azote liquide afin d’éviter les éclaboussures causées par l’ébullition rapide ; Après utilisation, fermez solidement les vannes principales et de régulation de pression du système de gaz à éthane pour éviter les fuites ; L’éthane résiduel et l’azote liquide doivent être éliminés dans un équipement de ventilation désigné dans la salle de préparation après la préparation de l’échantillon.

2. Détermination des conditions de lumière parallèle pour la microscopie électronique

1. Avant d’effectuer l’alignement parallèle du faisceau, ajustez d’abord les paramètres suivants de la lunette : étage à hauteur eucentrique, objectif au point de mise au point, inclinaison du faisceau nP ppX/ppY, point de pivot sans coma X/Y, coma et stigmate.
2. À l’aide d’une grille de réseau transversal, confirmez que l’échantillon est à hauteur eucentrique et au point approprié à un grossissement SA de 73 000× (sans filtre d’énergie) en mode nano-sonde.
3. Passez en mode diffraction (longueur de la caméra : D750 mm) et insérez l’ouverture objective de 100 μm (Figure 1A, 1B).
4. Cliquez sur l’onglet Ajuster pour l’ouverture de l’objectif et utilisez les boutons multifonctions X et Y pour déplacer l’ouverture de l’objectif vers le centre afin que le bord de l’ouverture chevauche les anneaux de diffraction dorés et occulte partiellement le point central (Figure 1C).
5. Mettez le plan focal arrière de l’objectif en ajustant la mise au point de diffraction à l’aide du bouton de mise au point jusqu’à ce que le bord de l’ouverture de l’objectif soit aussi net que possible (Figure 1D).
6. Ajustez l’intensité du faisceau (force C2) jusqu’à ce que la largeur des anneaux de diffraction en or soit minimisée.
7. Centrez l’ouverture de l’objectif. Augmentez la longueur de la caméra de diffraction jusqu’à ce que seul le point central soit visible (Figure 1E).
8. Cliquez sur l’onglet Diffraction dans le panneau Stigmator et utilisez les boutons multifonctions X et Y pour ajuster la forme du point central tout en alternant au-dessus et en dessous du point de croisement pour rendre le faisceau circulaire (Figure 1F).
9. Ajustez l’intensité du faisceau jusqu’à ce que le point central soit minimisé. Cela établira des conditions d’éclairage parallèles. Puisque les conditions d’éclairage parallèle peuvent varier selon la taille des taches, documentez les réglages C2 correspondants pour chaque taille de tache couramment utilisée afin de faciliter une configuration rapide lors de futures expériences.
   REMARQUE : La taille spécifique du point utilisée lors de l’acquisition des données dépend du grossissement et du réglage d’ouverture C2 ; Nous devons nous assurer que l’imagerie est réalisée au taux de dose optimal pour la caméra.

3. Collecte de données de haute qualité par tomographie électronique pour des échantillons d’apoferritine

REMARQUE : Cette section présente une procédure standardisée pour l’acquisition de données tomographiques à haut débit, adaptée aussi bien aux utilisateurs expérimentés qu’aux nouveaux chercheurs.

1. Pour clipser la grille et charger l’échantillon cryogénique préparé dans le microscope électronique, placez le joint torique dans l’outil d’alignement, la grille préparée étant placée au centre du joint torique. Utilisez le stylo à ressort pour clipser l’anneau C sur le joint torique, en fixant l’échantillon entre eux.
2. Insérez l’Autogrid verticalement dans la fente de la cassette, transférez-la à la nanocup via la station de travail, puis chargez-la dans le microscope électronique.
3. Pour capturer un montage complet de toute la grille avec SerialEM, lancez le logiciel SerialEM. Activez le mode Faible dose. Définissez le mode recherche à un grossissement de 115×.
   REMARQUE : Le grossissement de recherche est généralement utilisé pour acquérir des cartes de grande surface. Ce grossissement est réglé aussi bas que possible pour accélérer le processus de cartographie, tout en assurant la précision du stitching de l’image.
4. Ouvre le fichier Navigator. Allez sur Navigator > Montage & Grilles > montage complet. Dans la boîte de dialogue, activez Utiliser le mode recherche ; Sauvegardez les images au format Bin4. Cliquez sur Démarrer sous Contrôles de Montage.
5. Pour calibrer les champs de recherche et de vue, en mode recherche, localisez un repère très reconnaissable (Figure 2A). Cliquez sur Ajouter un marqueur dans le navigateur. Cliquez sur Aller au marqueur pour aller à l’emplacement du marqueur.
6. Passez en mode Vue (2600×) et localisez le même point de repère. Cliquez sur le point de repère. Allez dans le Navigateur, cliquez sur Majuscule vers le marqueur pour aligner les champs (Figure 2B). En suivant les indications dans la boîte de dialogue, les décalages de faisceau des deux grossissements sont attribués à tous les marqueurs de la carte de recherche, et les valeurs de décalage sont enregistrées (Figure 2C).
   REMARQUE : Le grossissement de vue est généralement réglé sur le plus bas grossissement de la zone sélectionnée (SA) afin de garantir que la vue et l’enregistrement sont au même mode, facilitant ainsi le centrage lors du changement de grossissement.
7. Pour calibrer les champs de vue et d’enregistrement (Figure 3). En mode Vue, localisez un point de repère très reconnaissable. Passez en mode Enregistrement (120k×). Utilisez la souris pour centrer le repère en mode Enregistrement.
   REMARQUE : Le réglage du grossissement de Record dépend de la résolution estimée de la cible (où la résolution cible est deux fois la taille du pixel) et de la taille de l’échantillon.
8. Revenez en mode Vue et prenez une photo. Faites glisser l’objet cible sous la loupe de vue jusqu’au réticule représentant le centre du champ de vision à l’aide du bouton droit de la souris.
9. Cliquez sur Définir à côté de Maj dans la section Défocaliser pour aligner les champs.
10. Pour sélectionner la case cible et capturer une carte à agrandissement moyen, 5.1 dans le montage complet, cliquez sur Ajouter polygone pour délimiter la zone à capturer. Après avoir défini une zone, cliquez sur Arrêter d’ajouter pour finaliser la sélection.
11. Répétez l’étape 3.10 pour toutes les zones souhaitées. Pour chaque polygone dans le Navigateur, cochez les options Acquérir (A) et Nouveau Fichier dans Item.
12. Dans la boîte de dialogue qui apparaît après avoir coché Nouveau fichier à l’Article, sélectionnez les éléments suivants : Images montées ; Ajuster le montage au polygone ; Fermez le fichier lorsque le prochain nouveau fichier doit être ouvert. Cliquez sur OK.
13. Dans la nouvelle boîte de dialogue, sélectionnez la fonction suivante : Déplacer la scène au lieu de déplacer l’image ; Utilisez les paramètres de vue en mode faible dose. Enregistrez l’image à l’emplacement spécifié.
14. Pour capturer la carte à agrandissement moyen, dans le menu Navigateur, cliquez sur Acquérir dans les Objets. Vérifiez les options suivantes : Acquérir et enregistrer une image ou un montage ; Faire une carte Navigator.
15. Dans la section Action Principale, vérifiez le mode Utiliser la Vue pour capturer des images. Dans la section Tâches avant ou après la primaire, vérifiez Eucentricité approximative. Cliquez sur GO pour commencer à capturer la carte à moyen grossissement.
16. Pour sélectionner des points sur la carte à grossissement moyen. Ouvre la carte à moyen grossissement dans l’interface du Navigator. Cliquez sur Ajouter un point et faites un clic gauche sur les objets cibles dans la carte.
17. Répétez pour tous les points souhaités. Après avoir sélectionné tous les points, cliquez sur Arrêter Ajouter pour finaliser la sélection.
18. Pour l’alignement de l’ouverture, utilisez des alignements directs dans l’interface du microscope pour ajuster l’inclinaison du faisceau nP ppX/ppY et le point de pivot sans coma X/Y, minimisant ainsi le balancement des points de faisceau dans le champ de vision.
19. Effectuez l’ambiance d’accordage à l’aide d’un script issu de la bibliothèque de scripts SerialEM (https://serialemscripts.nexperion.net/script/47).
20. Pour lancer la collecte de données de tomographie, dans l’interface Navigator, localisez le ROI et vérifiez la série d’inclinaison. Dans la boîte de dialogue, sélectionnez Images des images par images ; Choisissez l’emplacement de stockage des données.
21. Dans la boîte de dialogue des paramètres, définissez une plage de degrés de -50° à 50°. Réglez l’incrément de base à 2,5°, l’angle de départ à 0°, et activez le schéma dose-symétrique.
    REMARQUE : Les réglages de la dose par inclinaison, de la plage d’angle d’inclinaison et de l’étape d’inclinaison suivent généralement les principes décrits ci-dessous : La dose totale est maintenue à environ 100 e⁻/Ų. La plage d’inclinaison est sélectionnée pour garantir que, même à l’angle d’inclinaison le plus élevé, l’échantillon reste largement dégagé et permet une transmission et une imagerie électroniques suffisantes. Si la plage d’inclinaison est relativement grande (par exemple, au-delà de ±60°), le pas d’inclinaison peut être réglé à 3°. Pour une plage d’inclinaison plus petite (par exemple, autour de ±50°), le pas d’inclinaison peut être réduit à 2,5° ou 2° afin de garantir que la dose totale reste autour de 100 e⁻/Ų. Cela est particulièrement important pour les microscopes 200 kV, où les dommages causés par les radiations sont plus prononcés que ceux à 300 kV, ce qui rend essentiel d’éviter une dose totale excessive.
22. Dans la section Intensité du faisceau ou Contrôle d’exposition, vérifiez Maintenir l’intensité du faisceau. Réglez la cible de défocalisation à -3 μm et réglez la fréquence de mise au point automatique à une fois par inclinaison.
23. Vérifiez Stop si l’Autoalign dépasse plus de 60 % de la taille de l’image, puis réglez Suivre avant et après.
24. Pour commencer la collecte de données, dans le Navigateur, cliquez sur Acquérir aux Objets. En action principale, vérifie Cycle défocalisé cible en autofocus, Drift wait et TS.
25. Réglez la plage de mise au point de -3,5 à -4,5 μm, en 4 étapes. Sous Général, activez Fermer les vannes de colonne à l’extrémité. Dans la section Tâches avant ou après Primaire, activez Réaligner vers l’objet et Affiner Eucentrique avant Primaire.

4. Moyenne subtomographique de l’apoferritine

1. Effectuez la correction de mouvement et l’estimation CTF en utilisant la^{distorsion 19}. Effectuez un alignement tomographique en série d’inclinaison avec AreTomo3²⁰.
2. Exécutez la reconstruction et la déconvolution tomographiques en utilisant la distorsion. Effectuez le picking de particules basé sur des modèles à l’aide de PyTom²¹.
3. Effectuez le raffinement initial avec RELION^{5 22}. Effectuer un raffinement haute résolution avec M²³.
4. Déterminez la structure finale en traitant huit séries d’inclinaison, suivies de la sélection de 5 939 particules et d’un raffinement itératif, atteignant une résolution finale de 2,8 Å (Figure 4).

Results

Après un alignement précis du faisceau parallèle, nous avons réalisé la collecte de données de tomographie pour l’apoferritine en utilisant la fonction d’interface graphique de SerialEM. Le traitement ultérieur avec Warp, AreTomo, PyTom, RELION et d’autres logiciels pertinents a donné une structure finale à une résolution de 2,8 Å. Cette résolution démontre suffisamment la haute qualité de nos données, atteignant un niveau actuellement atteignable par une moyenne par sous-tomogramme à une résolution relativement élevée. Comme montré à la Figure 4, les résultats alignés et reconstruits (Figure 4A) démontrent clairement l’architecture globale et la répartition spatiale de l’apoferritine. La moyenne par subtomogramme a été réalisée sur des particules extraites de huit séries d’inclinaison alignées et reconstruites, donnant une structure à une résolution de 2,8 Å (Figure 4B). La courbe de corrélation de la coquille de Fourier (FSC) correspondante est présentée à la Figure 4C.

Figure 1 : Détermination de la condition d’éclairage parallèle à l’aide du second système de lentille condenseur. (A) Motif de diffraction en mode diffraction sans ouverture. (B) Diagramme de diffraction après insertion d’une ouverture objective de 100 μm. (C) Décalage d’ouverture par rapport au centre de diffraction pour mieux visualiser la netteté des bords. (D) Bord d’ouverture focalisé et bagues de diffraction optimisées en ajustant les courants de l’objectif et de l’objectif C2. (E) Spot de diffraction central elliptique nécessitant une correction via le panneau Stigmator. (F) Point de diffraction central circulaire et minimisé, indiquant une illumination parallèle optimisée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Processus d’alignement de grossissement élevé vers faible de la recherche (115×) à la vue (2600×). (A) Image en mode recherche avec le marqueur (flèche rouge) positionné au bord du trou. (B) Image en mode vue avec le marqueur (flèche rouge) positionné au même emplacement de l’objet que dans (A). L’option Shift vers Marker est cliquée dans le navigateur. (C) Dans la fenêtre pop-up, les décalages de faisceau des deux grossissements sont attribués à tous les marqueurs de la carte de recherche, et les valeurs de décalage sont sauvegardées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Processus d’alignement de grossissement élevé vers faible de la vue (2600×) à la version record (120k×). (A) En mode Enregistrement, l’objet cible est positionné au centre du champ de vision (un cercle rouge pointillé met en valeur l’objet ciblé). (B) Image capturée en mode Vue, où l’objet cible ne s’aligne pas avec le réticule rouge (le cercle en pointillés rouge met en évidence l’objet cible et le réticule rouge). (C) L’objet cible est traîné au centre du réticule rouge en le déplaçant avec un clic droit, puis en appuyant sur le bouton Set situé à côté du bouton Shift (la case rouge pointillée met en évidence le bouton). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4 : Détermination de la structure de l’apoferritine. (A) Imagerie structurelle. Carte de résolution locale de la moyenne finale du subtomogramme. La texture paraît uniforme, avec des caractéristiques nanométriques très bien disposées et répétitives sur l’ensemble du champ de vision. (B) Cartographie quantitative spatialement résolue. Une carte circulaire fausse couleur de la même région nanostructurée ou d’une région connexe. Les couleurs vont du bleu/vert au jaune/rouge, correspondant aux valeurs numériques indiquées sur l’échelle de couleurs ci-dessous (environ 2,5 à 3,5 en unités arbitraires). La distribution hétérogène des couleurs indique une variation spatiale d’une propriété mesurée (par exemple, hauteur, épaisseur, indice de réfraction ou réponse mécanique/optique) à travers l’échantillon. (C) Caractérisation spectrale ou fonctionnelle globale. La courbe de corrélation de la coquille de Fourier (FSC) est utilisée pour l’estimation de la résolution. La résolution finale de 2,8 Å est indiquée par la ligne pointillée à FSC = 0,143. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Discussion

Les procédures de préparation des échantillons cryogéniques et de collecte des données par tomographie électronique doivent être adaptées au type spécifique d’échantillon. La stratégie expérimentale décrite ici convient bien aux macromolécules biologiques, aux complexes protéiques et aux petits organites. Ces échantillons peuvent être vitrifiés directement sur des grilles électromagnétiques, et leur épaisseur relativement faible assure une transmission efficace des électrons et l’acquisition d’images à fort contraste. Idéalement, l’épaisseur de l’échantillon ne devrait pas dépasser 200 nm.

Pour les échantillons gelés en plongée, une dimension latérale inférieure à 10 μm est généralement préférée afin de minimiser la formation de glace cristalline, ce qui peut compromettre l’intégrité structurelle. Pour les échantillons plus volumineux, la congélation à haute pression ou l’inclusion de cryoprotecteurs, tels que le glycérol, dans le tampon peut retarder la nucléation^{de la glace 23}. Cependant, pour satisfaire aux exigences d’épaisseur du TEM, un amincissement supplémentaire est souvent nécessaire. Parmi les approches d’amincissement disponibles, le fraisage à faisceau ionique^{focalisé (FIB) 24}est le plus adopté en raison de sa précision et de ses dommages minimes, produisant des lamelles adaptées à la cryo-ET haute résolution.

Lors de la collecte des données des lamelles, il est crucial de maximiser l’utilisation des lamelles. La mise en œuvre de l’acquisition par décalage d’image faisceau peut réduire le besoin d’étapes répétitives de mise au point et de suivi, augmentant ainsi le débit de collecte de données. Bien que non décrite en détail ici, cette technique a été largement décrite dans la méthodologie PACEtomo.

Actuellement, les options logicielles populaires pour la collecte de données tomographiques incluent la tomographie (Thermo Fisher Scientific) et SerialEM. La tomographie est une solution commerciale avec une flexibilité limitée pour la personnalisation, tandis que SerialEM, développé par David Mastronarde à l’Université du Colorado à Boulder, est un logiciel open source qui prend en charge l’automatisation basée sur des scripts. Cependant, exploiter pleinement les capacités de SerialEM nécessite une courbe d’apprentissage importante. Dans cette étude, nous présentons un flux de travail simplifié qui exploite l’interface graphique de SerialEM, éliminant le besoin de scripts ou de configurations basées sur Python tout en permettant une acquisition de données nocturne sans surveillance.

Un défi fréquent rencontré lors de l’acquisition de données tomographiques avec cette méthode est le suivi imprécis, qui peut entraîner des séries d’inclinaison incomplètes avec des angles manquants ou compliquer l’alignement ultérieur. Pour atténuer ces problèmes, les paramètres de suivi doivent être optimisés en fonction du contraste de l’échantillon et de la stabilité du stade d’inclinaison. Les stratégies efficaces incluent l’ajustement du temps d’exposition aux positions de suivi pour garantir la clarté de l’image, la séparation physique des positions de suivi et de mise au point pour réduire les dommages cumulatifs aux radiations, et la réduction du grossissement de suivi lorsque la stabilité de l’étage est faible pour faciliter une correspondance de motifs fiable. Collectivement, ces ajustements sont essentiels pour atteindre une performance de suivi robuste à travers diverses conditions expérimentales. Dans ce travail, nous utilisons l’apoferritine comme spécimen modèle. Dans le but de tester et de corriger la lumière parallèle, nous utilisons les fonctions intégrées de SerialEM pour collecter des données de haute qualité pour la cryo-ET et effectuer des calculs subtomogrammes sur les échantillons de ferritine, obtenant finalement la structure finale à 2,8 Å.

Cette méthode a été développée pour étendre l’applicabilité des microscopes électroniques 200 kV pour la cryo-ET haute résolution. Atteindre une telle résolution dépend fondamentalement de l’obtention de données d’imagerie de haute qualité, ce qui nécessite à son tour des conditions d’éclairage précises. À cette fin, nous avons réalisé un alignement précis de l’illumination parallèle comme étape préparatoire essentielle. La procédure d’alignement décrite ici est spécifiquement conçue pour les TEM équipés d’un système de lentilles à deux condenseurs, tels que les Thermo Fisher Scientific Talos Arctic et Glacios. Contrairement aux instruments équipés d’une troisième lentille condensatrice (C3), ces systèmes restreignent la condition d’un éclairage parallèle à une seule valeur d’excitation spécifique de la lentille C2. Cette contrainte inhérente nécessite un alignement exceptionnellement précis du faisceau d’électrons pour positionner l’image source sur le plan focal avant de l’objectif supérieur — une condition préalable à une performance d’imagerie optimale. Nos résultats ultérieurs de traitement des données démontrent qu’après cet alignement, la qualité d’acquisition des données obtenue avec ce microscope 200 kV pour les échantillons testés est presque comparable à celle généralement attendue d’un instrument 300 kV.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Grille ANTCryoTM niti	Najingdingxin  ;	M04240922A	Utilisé pour la préparation des échantillons cryogéniques
Apoferritine	Biortus	BP17854-00A	Utilisé pour la préparation des échantillons cryogéniques
Grille à réseau transversal	Agar Scientific	AGS106	Utilisé pour déterminer les conditions de lumière parallèle
Glacios2	Thermo Fisher	9959084	Utilisé pour la collecte de données Tomo
Papier filtre numéro 2, 55 mm	Whatman	10311807	Papier buvard
PELCO eeasyGLOW	TED PELLA	91000-01020	Utilisé pour la décharge lumineuse
Grille Quantifoil Cu	quantifoil	N1-C14nCu30-01	Utilisé pour la préparation des échantillons cryogéniques
Vitrobot Mark IV & nbsp ;	Thermo Fisher	230101164	Utilisé pour la préparation des échantillons cryogéniques