Procédure flexible pour réaliser des FISH de télomères et une immunofluorescence dans des cellules exprimant des protéines fluorescentes

Résumé

Ce protocole décrit une méthode de combinaison de FISH de télomères (natifs ou dénaturants) avec l’immunofluorescence et/ou la visualisation d’une protéine fluorescente.

Résumé

La visualisation des télomères à l’aide de l’hybridation in situ en fluorescence (TelFISH) est depuis longtemps un outil essentiel dans les expériences de biologie des télomères. La combinaison de TelFISH avec l’immunofluorescence (IF) est également une méthode bien établie (IF-TelFISH), par exemple, pour identifier les foyers induits par le dysfonctionnement des télomères, où les télomères co-localisent avec 53BP1. Plus récemment, le FISH de télomères natifs (nTelFISH) est devenu un outil important pour le dosage de l’allongement alternatif des télomères, un mécanisme de maintien des télomères utilisé dans certaines cellules tumorales. L’expression de protéines fluorescentes est également un outil essentiel en biologie cellulaire, permettant de visualiser des protéines et des structures qui peuvent rester indétectables par d’autres méthodes. Étant donné que les tampons FISH dénaturent les protéines, la réalisation du test dans des cellules avec une protéine fluorescente (FP) exprimée entraîne une perte du signal FP. Une méthode d’intégration de IF et de FISH de télomères dans des cellules avec une protéine fluorescente exprimée qui préserve le signal FP même après FISH est décrite ici. Des alternatives sont fournies pour les FISH dénaturants et les télomères natifs en combinaison avec plusieurs scénarios IF et FP. Dans l’ensemble, ce protocole offre un cadre flexible pour explorer la biologie des télomères dans les cellules normales et tumorales.

Introduction

Les organismes dotés de chromosomes linéaires doivent faire face à deux problèmes. Tout d’abord, en raison du problème de réplication finale, les extrémités des chromosomes s’érodent légèrement à chaque fois que l’ADN est répliqué. Deuxièmement, les cellules doivent être capables de distinguer les extrémités naturelles de l’ADN des cassures de l’ADN. Les télomères ont évolué comme une solution à ces problèmes. Grâce à l’action de la ribonucléoprotéine télomérase, les chromosomes sont allongés par l’ajout de courtes répétitions en tandem-TTAGGG chez l’homme. Ces répétitions sont liées par le complexe de la shelterine, qui dissimule l’extrémité chromosomique de la machinerie de réparation des dommages à l’ADN cellulaire¹. Les télomères courts ou dysfonctionnels entraînent une sénescence cellulaire et des phénotypes^{de vieillissement 2}, tandis que l’évasion de la crise des télomères est une étape majeure dans la tumorigenèse³. Pour ces raisons, la biologie des télomères présente un intérêt particulier pour comprendre la santé et la maladie humaines.

L’hybridation in situ par fluorescence de télomères (FISH) est depuis longtemps une méthode importante pour visualiser les télomères dans les cellules interphasiques ou les étalements de métaphase⁴. Pendant des décennies, la FISH des télomères a été couplée à la coloration par immunofluorescence (FI) 53BP1 pour identifier les foyers induits par le dysfonctionnement des télomères (TIF), un marqueur des télomères dysfonctionnels^et non coiffés ^5,6. De même, l’une des caractéristiques des tumeurs qui utilisent l’allongement alternatif des télomères (ALT) pour la maintenance des télomères est l’association des télomères avec des corps PML nucléaires pour former des corps PML associés à l’ALT ou APBs⁷. Les APB peuvent être dosés en appariant les télomères FISH avec la coloration PML IF. Ainsi, IF-FISH est un outil bien établi en biologie des télomères.

Ici, l’utilisation d’IF-FISH a été étendue de deux manières. Tout d’abord, IF-FISH est réalisé sur des cellules avec des protéines fluorescentes (PF) exprimées. L’expression de protéines marquées par fluorescence est devenue un outil omniprésent en biologie cellulaire. L’expression d’une protéine marquée peut être la seule option pour visualiser une protéine pour laquelle il n’existe pas de bons anticorps. Par exemple, le chromobody d’actine nucléaire exprimé marqué à la GFP (nAC-GFP) révèle la dynamique de l’actine nucléaire⁸. Ce réactif a ouvert de nouvelles opportunités dans l’exploration de la f-actine nucléaire, qui était autrefois considérée comme un sujet controversé. Alors que les PF comme GFP et mCherry maintiennent généralement une activité de fluorescence après la fixation, le formamide dans les tampons d’hybridation FISH les rendra sombres⁹. Pour contourner ce problème, ce protocole propose l’innovation d’un « booster » anti-FP marqué au fluorophore dans l’étape secondaire de la coloration FI. La luminosité du fluorophore n’est pas affectée par le formamide, ce qui permet à IF-FP-FISH.

Deuxièmement, l’IF est réalisée en conjonction avec le télomère natif FISH (nTelFISH), un diagnostic important de l’état ALT. Lors de la dénaturation des POISSONS, il faut utiliser une méthode pour faire fondre les brins d’ADN¹⁰ (par exemple, chaleur ou alcali), permettant à la sonde d’accéder à l’ADN qui est normalement double brin. En revanche, les FISH indigènes n’incluent pas d’étape de dénaturation, de sorte que la sonde ne peut accéder qu’à l’ADN déjà monocaténaire. Le télomère natif FISH détecte spécifiquement les répétitions de télomères simple brin C, une autre caractéristique de l’ALT dans les cellules tumorales^11,12. Le couplage de ce test avec la coloration IF-FP nous permet d’aborder de nouvelles questions dans la compréhension du mécanisme de l’ALT, qui est maintenant considéré comme un candidat solide pour les thérapies tumorales ciblées.

Le protocole décrit ici peut être utilisé dans le style « choisissez votre propre aventure » pour colorer n’importe quelle combinaison de FI, de PF et de FISH télomères natifs ou dénaturants. Étant donné que le protocole est hautement configurable, le calendrier peut varier considérablement. D’une manière générale, le temps pratique est nécessaire sur quatre jours, mais ces jours peuvent ne pas être séquentiels. La figure 1 donne des estimations du temps nécessaire à la réalisation d’un flux de travail FISH dénaturant typique. Il n’est pas nécessaire d’hybrider les poissons indigènes pendant la nuit, de sorte qu’il est possible d’éliminer une étape de nuit (combinant le jour 2 et le jour 3) si une longue journée au banc est possible.

Un microscope confocal typique permet d’imager quatre canaux de couleur : en gros, bleu, vert, rouge et rouge lointain. Quatre exemples de combinaisons potentielles de quatre couleurs sont démontrés, mais les permutations potentielles sont infinies. Il est possible d’utiliser deux anticorps IF ou deux PF exprimés avec le même succès. Le protocole est simple et robuste. Tout anticorps qui produit de bons résultats de FI par lui-même convient. Bien que seules les sondes de télomères pour FISH soient incluses ici, la dénaturation de FISH avec une sonde centromère donne également de bons résultats. Ainsi, ce protocole offre un large degré de flexibilité pour répondre à des questions importantes en biologie nucléaire.

Protocole

Avant de commencer, considérez le microscope, la lignée cellulaire exprimant la FP et les sondes et anticorps disponibles. Le bleu est généralement utilisé pour une coloration d’ADN telle que le DAPI, car les fluorophores bleus ne sont généralement pas brillants. Des anticorps secondaires bleus peuvent être utilisés si nécessaire. Si les cellules expriment la GFP, une sonde FISH marquée d’un fluorophore rouge peut être utilisée avec un anticorps secondaire pour l’IF marqué avec AF-647. Alternativement, pour l’imagerie des cellules exprimant mCherry, un anticorps secondaire IF marqué avec AF-488 et une sonde FISH marquée avec AF-647 peuvent être sélectionnés. Des exemples de quatre combinaisons possibles IF-FP-FISH sont présentés à la figure 2 et servent de guide pour encourager la flexibilité de la conception expérimentale. Il est important de choisir des POISSONS indigènes ou dénaturants, car ces méthodes ne peuvent pas être combinées. Une méthode fiable pour le lavage à l’acide des lamelles de recouvrement afin de permettre l’adhérence des cellules est incluse ici. Cela peut être fait à tout moment avant l’utilisation, et les lamelles stériles peuvent être stockées indéfiniment. Les réactifs et l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Lavage à l’acide des lamelles

REMARQUE : Les lamelles en verre doivent être nettoyées et lavées à l’acide pour permettre aux cellules cultivées d’adhérer. Pour la croissance en plaques à 12 puits, des lamelles rondes de 18 mm sont idéales. Consulter la plateforme de microscopie pour déterminer si les lamelles #1 ou #1.5 sont préférées. Les temps indiqués pour le nettoyage des lamelles ne sont pas critiques, mais ne lésinez pas sur le lavage à l’acide.

1. À l’aide d’une pince à lamelles (Figure 3A), placez les lamelles dans les grilles de manière à ce que leurs surfaces ne se touchent pas. Placez les lamelles de recouvrement supplémentaires en diagonale pour augmenter la capacité si nécessaire (Figure 3B). Insérez confortablement plusieurs grilles dans le plat de coloration (Figure 3C).
2. Remplissez le plat de coloration avec de l’eau et une petite quantité de détergent. Abaissez doucement les grilles avec les lamelles dans le plat.
3. Agitez les lamelles dans l’eau savonneuse pendant 30 min à l’aide d’une bascule ou d’un nutator.
4. Soulevez les grilles de lamelles du plat de coloration. Jetez l’eau savonneuse.
5. Rincez le plat de coloration et remplissez-le d’eau déminéralisée. Remettez les grilles de lamelles dans l’eau propre et placez-les sur une bascule pour agiter doucement pendant 5 min.
6. Répétez le rinçage avec deux changements supplémentaires d’eau déminéralisée propre, pour un total de trois rinçages.
7. Soulevez les grilles de lamelles du plat de coloration. Ajouter 1 N HCl dans le plat.
   ATTENTION : Le HCl est caustique. Manipulez-le dans une hotte et utilisez un équipement de protection individuelle. Abaissez avec précaution les lamelles en rack dans la solution acide. Assurez-vous que le HCl 1 N recouvre entièrement les lamelles. Placez le couvercle sur le plat de coloration.
8. Placez le plat de coloration contenant les lamelles et la solution acide dans le réservoir d’un sonicateur de bain. Sonicate pendant 15 min à 55 °C.
9. Laissez les lamelles dans le bain d’acide pendant la nuit.
10. Retirez soigneusement les grilles de recouvrement du plat à tacher le lendemain. Éliminer le chlorhydrate 1 N conformément aux protocoles de sécurité de l’établissement.
11. Rincez le plat de teinture et remplissez-le d’eau déminéralisée. Remettez les grilles de lamelles dans l’eau propre et placez-les sur une bascule pour agiter doucement pendant 5 min.
12. Répétez le rinçage avec deux autres changements d’eau propre déminéralisée, pour un total de trois rinçages.
13. Soulevez les grilles de lamelles du plat de coloration. Videz le plat et remplissez-le d’éthanol à 70 %. Remettez les grilles de lamelles dans le plat et agitez doucement pendant 5 min.
14. Soulevez les grilles de lamelles du plat de coloration. Videz le plat et remplissez-le d’éthanol à 100 %. Remettez les grilles de lamelles dans le plat et agitez doucement pendant 5 min.
15. Apportez le plat avec de l’éthanol à 100 % et les lamelles dans une hotte de culture tissulaire. Dans la hotte, retirez les grilles de lamelles du plat et laissez-les sécher à l’air.
16. Videz le plat et remettez-y les grilles de lamelles. Conserver avec le couvercle fermé pour maintenir la stérilité. Le plat de coloration n’est pas hermétique ; Si les lamelles sont laissées dans de l’éthanol, celui-ci finira par s’évaporer. Les lamelles resteront utilisables.

2. Cellules de placage sur lamelles

REMARQUE : La manipulation des lamelles nécessite de la pratique. Il est plus facile de commencer avec une plaque à 6 puits jusqu’à ce qu’il soit confiant. Lorsque vous utilisez une plaque à 6 puits, doublez les volumes de lavage donnés pour les plaques à 12 puits.

1. Cultivez des cellules saines en croissance exprimant la protéine d’intérêt marquée avec GFP ou mCherry (plusieurs FP rouges ou vertes conviennent ; voir les notes dans la table des matériaux). Les cellules d’ostéosarcome U2OS, qui utilisent l’ALT pour l’entretien des télomères, sont utilisées dans les exemples présentés.
   1. Utilisez des cellules transfectées transitoirement ou des lignées cellulaires avec une expression stable de la FP. Si l’expérience nécessite un traitement médicamenteux ou une transfection, tenez compte de la confluence souhaitée à la fixation (généralement de 70 % à 80 %), de la durée du traitement et du taux de croissance cellulaire pour calculer le nombre approprié de cellules à plaquer par lamelle.
2. Préparez les lamelles dans le capot de culture tissulaire pour maintenir la stérilité. Dans chaque puits d’une plaque à 12 puits, ajouter 1 mL de PBS stérile. À l’aide d’une pince à lamelle, placez une lamelle propre et lavée à l’acide dans chaque puits. Agitez doucement à la main pendant quelques secondes.
3. Aspirer PBS. Ajouter 1 mL de PBS frais et stérile par puits. Mettez l’assiette de côté.
4. (Facultatif) Enduisez les lamelles de fibronectine pour améliorer l’adhésion cellulaire. De nombreuses lignées cellulaires adhérentes adhèrent bien aux lamelles lavées à l’acide lorsqu’elles sont plaquées pendant au moins 18 h avant la fixation. Si les cellules n’adhèrent pas bien ou nécessitent une fixation peu de temps après le placage, enrobez des lamelles pour favoriser l’adhérence.
   1. Préparez une solution de 5 μg/mL de fibronectine dans du PBS stérile.
   2. Aspirer PBS des lamelles. Appliquez doucement environ 300 μL de solution de fibronectine sur chaque lamelle, formant une gouttelette maintenue par la tension superficielle.
   3. Incuber pendant plusieurs heures à 37 °C ou toute la nuit à 4 °C.
   4. Rincer plusieurs fois avec du PBS, en tenant les lamelles dans un dernier changement de PBS. Mettez l’assiette de côté pendant la préparation des cellules.
   5. Si la fibronectine ne convient pas, envisagez la poly-L-lysine, le collagène ou la gélatine comme alternatives.
5. Trypsiniser les cellules et en diluer un nombre approprié dans 12 mL de milieu de culture en fonction du plan expérimental et de la densité cellulaire souhaitée à la fixation.
6. Aspirer le PBS des lamelles et ajouter 1 mL de suspension cellulaire par puits.
7. Placez les cellules dans l’incubateur.
8. Traitez les cellules au besoin avec des médicaments, des siRNA ou d’autres réactifs selon le plan expérimental. Cultivez jusqu’à la confluence souhaitée.

3. Coloration IF-FP

REMARQUE : Tout au long du protocole, ne laissez pas les lamelles se dessécher. Il est conseillé de pipeter d’une main et d’aspirer les solutions de l’autre afin que les lamelles soient hors de la solution le moins longtemps possible. Les solutions de pipette se plaquent doucement contre la paroi du puits, et non directement sur la lamelle. Manipulez les lamelles fermement mais doucement à l’aide d’une pince. Il est facile de casser une lamelle en la saisissant avec trop de force. Au début, prévoyez des lamelles en double en cas de bris. Avec l’expérience, les lamelles cassées deviennent rares. Les lamelles ne peuvent pas être ramassées dans un puits sec. Les lamelles doivent être recouvertes d’un tampon pour être ramassées.

1. Retirez le support et fixez les cellules à l’aide du fixateur de votre choix. Il n’est pas nécessaire de rincer les cellules avant la fixation. Utilisez 1 mL par puits dans une plaque à 12 puits ou 2 mL par puits dans une plaque à 6 puits.
   1. Option 1 : Utiliser du formaldéhyde à 4 % dans le PBS.
      ATTENTION : Le formaldéhyde est toxique. Manipulez-le avec des gants et jetez-le correctement. Préparez des produits frais en utilisant 16 % de formaldéhyde sans méthanol et 10 fois le bouillon PBS. Laisser reposer 15 min à température ambiante.
   2. Option 2 : Utiliser du formaldéhyde à 4 % dans un tampon de cytosquelette avec du saccharose (CBS).
      REMARQUE : Ce tampon est préférable pour préserver la structure du cytosquelette¹³. La concentration finale de CBS est de 10 mM MES pH 6,1, 138 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 2 mM EGTA et 0,32 M de saccharose. Pour préparer un fixateur, préparez un stock 2x CBS avec 20 mM MES pH 6,1, 276 mM KCl, 6 mM MgCl₂, 4 mM EGTA. Préparez un stock séparé de 1,28 M de saccharose. Conservez les deux bouillons à 4 °C. Pour un fixateur frais et efficace, mélangez 1 volume de formaldéhyde sans méthanol à 16 %, 1 volume de stock de saccharose et 2 volumes de stock 2x CBS. Laisser reposer 15 min à température ambiante.
   3. Option 3 : Fixer avec du méthanol à -20 °C. Recommandé pour les cibles d’anticorps d’acide nucléique (par exemple, l’ADNss, les G-quadruplexes, les hybrides ARN-ADN). Fixer pendant 5 min à -20 °C.
2. Aspirer le fixateur et l’éliminer conformément aux politiques de l’établissement.
3. Rincez les lamelles plusieurs fois avec du PBS.
   1. POINT D’ARRÊT : Les lamelles fixes peuvent être stockées dans PBS à 4 °C pendant plusieurs jours avec une perte de signal minimale. Pour un stockage plus long, déshydratez à 100 % d’éthanol (2 min dans de l’éthanol à 70 %, 2 min dans de l’éthanol à 90 %, stockez dans de l’éthanol à 100 %), fermez la plaque avec un film de laboratoire et conservez à -20 °C. Les lamelles peuvent être stockées de cette façon pendant des semaines ou des mois. Lorsque vous êtes prêt à teindre, réhydratez les lamelles (2 min dans de l’éthanol à 90 %, 2 min dans de l’éthanol à 70 %, 15 min dans du PBS) et passez à l’étape suivante.
4. Perméabiliser les lamelles dans 0,5 % de Triton X-100 dans du PBS pendant 5 min à 4 °C. Effectuez cette étape dans la plaque.
5. Rincez les lamelles plusieurs fois avec du PBS.
6. Préparez la chambre humidifiée (Figure 3D). Placez des serviettes en papier humides au fond de la chambre. Pour créer un support de coloration, étiquetez le haut d’un couvercle à partir d’une plaque à 12 puits pour correspondre aux lamelles.
   1. Couvrez le couvercle avec un film de laboratoire pour que les étiquettes restent visibles. Assurez-vous que la chambre est étanche à la lumière avec un couvercle bien ajusté. Couvrir de papier d’aluminium si nécessaire (figure 3E).
7. Pipeter des gouttes de 75 μL de 100 μg/mL de RNase A dans du PBS sur le support étiqueté. Prenez délicatement chaque lamelle et tamponnez le bord sur le tissu de laboratoire pour éliminer l’excès de tampon. Inversez les lamelles sur les gouttes de RNase A (côté cellulaire vers le bas). Placez le support dans la chambre humidifiée et fermez le couvercle. Incuber pendant 45 min à 37 °C.
8. Ajouter du PBS frais dans l’assiette à 12 puits. Remettez les lamelles sur la plaque, côté cellule vers le haut. Rincer plusieurs fois avec du PBS.
9. Bloquer pendant 30 minutes ou plus à température ambiante. Essuyez la solution RNase du support recouvert de film. Pipette de 75 μL de gouttes de sérum d’ânesse à 20 % dans du PBS sur le film. Inversez les lamelles sur le tampon de blocage (côté cellule vers le bas).
10. Préparez l’anticorps primaire.
    1. Utiliser 75 μL par lamelle. Préparez 10 % de plus pour éviter les erreurs de pipetage.
    2. Diluez l’anticorps dans du sérum d’âne à 5 %. Déterminer les dilutions des anticorps de manière empirique. Une dilution de 1:100 est un point de départ raisonnable.
    3. Pendant le blocage, préparez un deuxième support marqué pour l’incubation primaire des anticorps. Couvrez le couvercle d’un film et appliquez des gouttes de 75 μL de l’anticorps dilué aux endroits désignés.
11. À la fin de l’étape de blocage, transférez les lamelles dans les gouttelettes d’anticorps (côté cellulaire vers le bas). Placez le support dans la chambre humidifiée, fermez le couvercle et incubez pendant au moins 2 h à température ambiante ou toute une nuit à 4 °C.
12. Ajouter du PBS frais dans l’assiette à 12 puits. Remettez les lamelles sur la plaque, côté cellule vers le haut. Laver au PBS trois fois pendant 5 minutes chacune à température ambiante avec bascule.
13. Lors du lavage final, préparez des anticorps secondaires.
    1. Utiliser 75 μL par lamelle. Préparez 10 % de plus pour éviter les erreurs de pipetage.
    2. Une dilution de 1:400 est recommandée pour les anticorps secondaires fluorescents et les anticorps de rappel GFP/RFP. Ajustez au besoin en fonction de l’expérience avec la cible.
    3. Diluer les anticorps secondaires dans du sérum d’âne à 5 %. Appliquez des gouttes de 75 μL aux endroits appropriés sur le support étiqueté.
14. Après le lavage, transférez les lamelles dans les gouttelettes d’anticorps secondaires (côté cellulaire vers le bas). Incuber pendant au moins 30 minutes à température ambiante dans la chambre humidifiée scellée.
15. Ajouter du PBS frais dans l’assiette à 12 puits. Remettez les lamelles sur la plaque, côté cellule vers le haut. Laver au PBS trois fois pendant 5 minutes chacune à température ambiante avec bascule.

4. Fixation et déshydratation

1. Préparez du formaldéhyde à 4 % dans du PBS à température ambiante pour la refixation. Utilisez du formaldéhyde pour cette étape, même si du méthanol a été utilisé pour la fixation initiale. Retirez le dernier lavage PBS et refixez les cellules pendant 15 minutes avec un balancement doux.
2. Aspirez le fixateur et jetez-le conformément aux politiques institutionnelles.
3. Rincez les lamelles plusieurs fois avec du PBS.
4. Déshydratez les lamelles et faites-les sécher à l’air libre pour les préparer à l’hybridation :
   1. Incuber dans de l’éthanol à 70 % pendant 2 min.
   2. Incuber dans de l’éthanol à 90 % pendant 2 min.
   3. Incuber dans de l’éthanol à 100 % pendant 2 min.
   4. Après avoir consommé de l’éthanol à 100 %, placez les lamelles côté cellule vers le haut sur du papier filtre étiqueté pour maintenir l’orientation. Laissez-les sécher complètement à l’air libre pendant la préparation de la sonde FISH.

5. POISSON (OPTION 1) : POISSON dénaturant

1. Préparez deux supports de feuille (voir Figure 3F).
   1. Pliez un morceau de papier d’aluminium en quatre pour créer quatre couches. Assurez-vous que le côté émoussé est tourné vers l’extérieur.
   2. Coupez le papier d’aluminium plié pour qu’il s’adapte à l’intérieur du couvercle d’une plaque à 12 puits. À l’aide d’une lingette de laboratoire, frottez le papier d’aluminium contre l’intérieur du couvercle de manière à ce que les arêtes du couvercle impriment un motif sur le papier d’aluminium. Cela créera des crêtes qui empêcheront les lamelles de glisser les unes dans les autres lors des étapes suivantes.
   3. Préparez deux supports de ce type. Ils peuvent être essuyés et réutilisés dans des expériences ultérieures.
2. Diluer la sonde 10 μM 1:50 dans un tampon d’hybridation (70 % de formamide désionisé, 10 mM de Tris, pH 7,4, 0,5 % de solution bloquante 10× Roche). Utilisez 75 μL de cette sonde diluée par lamelle et préparez 10 % supplémentaires pour compenser la perte de pipetage. La concentration finale de la sonde doit être de 200 nM.
3. Préchauffez un bloc chauffant à 90 °C et un thermocycleur à 85 °C.
4. Dénaturez les lamelles : Placez les lamelles séchées à l’air côté cellule vers le haut sur l’un des supports en aluminium préparés. Placez délicatement le film sur le bloc du thermocycleur et fermez le couvercle. Incuber pendant 5 min pour dénaturer.
5. Simultanément, chauffez la sonde diluée dans le bloc chauffant à 90 °C pendant 5 min.
6. Pipeter des gouttes de 75 μL de la sonde dénaturée sur le deuxième support de feuille préparé. Assurez-vous que le côté émoussé de la feuille est orienté vers le haut pour permettre aux gouttelettes bien formées. Si le côté brillant est vers le haut, la sonde s’étalera et perdra sa tension superficielle.
7. Retournez les lamelles dénaturées sur les gouttes de sonde, en les plaçant côté cellule vers le bas.
8. Transférez le support de film avec la sonde et les lamelles sur le bloc thermocycleur réglé à 85 °C et incubez pendant 5 min. Utilisez une spatule pour aider au transfert. Déplacez-vous avec prudence pour éviter de heurter ou de déplacer les lamelles.
9. Déplacez la feuille avec les lamelles et la sonde dans une chambre humidifiée. Couvrir avec le couvercle et incuber toute la nuit à température ambiante.

6. POISSON (OPTION 2) : POISSON indigène

1. Diluer la sonde 10 μM 1:200 dans un tampon d’hybridation (70 % de formamide désionisé, 10 mM de Tris, pH 7,4, 0,5 % de 10× solution bloquante Roche). La concentration finale de la sonde est de 50 nM. Utilisez 75 μL par lamelle et préparez 10 % supplémentaires pour éviter les erreurs de pipetage.
2. Appliquez des gouttes de 75 μL de sonde diluée aux endroits désignés sur le support recouvert de film.
3. Retournez les lamelles dénaturées sur les gouttes de 75 μL de la sonde, en les plaçant côté cellule vers le bas.
4. Placez le support dans une chambre humidifiée et fermez le couvercle. Incuber pendant au moins 45 min à température ambiante. L’incubation peut être prolongée jusqu’à la nuit si vous préférez.

7. Lavage et montage

REMARQUE : Le support de montage optimal dépend de l’ouverture numérique de l’objectif du microscope. Consultez la plateforme de microscopie locale pour obtenir des recommandations. Un choix approprié peut être le verre ProLong avec NucBlue, qui a un indice de réfraction de 1,52. Cependant, un autre support de montage peut être plus approprié en fonction du microscope à portée de main.

1. Remettez les lamelles sur la plaque à 12 puits pour le lavage. Retournez-les pour qu’ils soient côté cellule vers le haut.
2. Lavage 3× 10 min dans du tis à 70 % formamide/10 mM, pH 7,5.
   ATTENTION : Le formamide est toxique ; en disposer conformément aux politiques institutionnelles.
3. Laver 3× 5 min dans du TNT (0,05 M Tris/0,15 M NaCl/0,05 % Tween-20, pH 7,5).
4. Rincer plusieurs fois au PBS. Si une coloration d’ADN n’est pas incluse dans le support de montage, envisagez d’ajouter du DAPI lors du lavage final. Pour colorer avec du DAPI, ajoutez 300 nM de DAPI au PBS, appliquez sur des lamelles et incubez pendant 5 min. Disposer de la solution DAPI conformément aux directives institutionnelles.
5. Montez les lamelles sur des lames de verre à l’aide d’une goutte de support de montage. Inversez les lamelles sur la chute : côté cellule vers le bas.
6. Laissez le milieu de montage durcir pendant la nuit avant l’imagerie.

Résultats

Les résultats typiques de ce protocole sont illustrés à la figure 4. S’il est correctement exécuté, la morphologie cellulaire sera bien maintenue et les signaux fluorescents seront brillants. La dénaturation du télomère FISH devrait révéler un motif de dizaines de points dans chaque noyau représentant chaque télomère (voir Figure 4, exemples 1 et 2). Les foyers de télomères devraient être présents presque exclusivement dans le noyau, bien que la coloration des télomères cytoplasmiques se produise parfois, en particulier dans les lignées cellulaires ALT. Les signaux de télomères qui en résultent ont tendance à être extrêmement brillants, à tel point qu’il faut veiller à ce que le signal de télomères ne déborde pas dans d’autres canaux de détection. Dans les lignées cellulaires ALT, les télomères se regroupent souvent au niveau des corps PML¹⁴, ce qui entraîne moins de foyers que ce à quoi on s’attendrait normalement. Ce regroupement peut être observé dans la figure 4, exemple 2.

Dans les lignées cellulaires qui utilisent l’ALT pour la maintenance des télomères, le télomère natif FISH détecte l’ADNss télomérique qui est une caractéristique de l’ALT^11,12. On ne s’attend pas à ce que chaque noyau ait de l’ADNsb de télomères, ni à ce qu’un petit nombre de points soient présents dans un seul noyau (voir la figure 4, exemples 3 et 4). Le signal natif du télomère FISH ne sera pas aussi brillant que le dénaturation du télomère FISH. La lignée cellulaire d’ostéosarcome U2OS est un bon contrôle positif pour les FISH natifs. On ne s’attend pas à ce que l’ADNss des télomères soit observé dans les lignées cellulaires dont les télomères sont maintenus par la télomérase.

Pour les FISH dénaturants et indigènes, la forte fluorescence nucléolaire est artificielle. Si un signal nucléolaire excessif est observé, essayez d’utiliser une solution fraîche de RNase A ou d’étendre le traitement^{de la} RNase A 15 (étape 3.8 du protocole). Pour les expériences FISH de télomères natifs utilisant des cellules dont le statut ALT est inconnu, une lignée cellulaire ALT positive telle que U2OS est utilisée pour calibrer les paramètres de détection.

Les observations de PF dans les expériences IF-FP-FISH peuvent être facilement comparées aux expériences d’imagerie de cellules vivantes pour validation. Si des anomalies sont observées, essayez différentes conditions de fixation. La fixation dans le tampon CSB (étape de protocole 3.1.2) peut être bénéfique pour préserver les structures cellulaires, révélant une localisation plus précise de la PF¹³.

La coloration par immunofluorescence varie considérablement en fonction de la protéine d’intérêt. Les résultats de l’IF doivent être comparés à des échantillons préparés sans FISH afin d’évaluer l’impact du protocole FISH sur la localisation et l’intensité de la protéine d’intérêt. En général, les expériences IF-FP-FISH conviennent au comptage des foyers, mais les intensités peuvent ne pas être quantitatives⁶.

Figure 1 : Exemple de flux de travail avec des durées estimées. Un jour supplémentaire peut être nécessaire si l’incubation primaire de l’anticorps est effectuée pendant la nuit. Dans le cas des FISH indigènes, les jours 2 et 3 sont parfois combinés, bien que cela entraîne un temps de banc prolongé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Exemples de combinaisons expérimentales réussies utilisées avec l’imagerie quadricolore. Les exemples 1 et 2 démontrent la dénaturation des TÉLOMÈRES FISH, tandis que les 3 et 4 utilisent des FISH indigènes. Notez que ce protocole est utile qu’il s’agisse d’immunomarquage de deux protéines cibles (exemple 1), de la combinaison d’une coloration FP et d’une coloration IF (exemples 2 et 4), ou de deux FP (exemple 3). Les résultats représentatifs de ces expériences sont présentés à la figure 4. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Équipement utilisé dans le cadre de ce protocole. (A) Pince à lamelle. Alors que les pinces droites peuvent être utilisées pour manipuler les lamelles, les pinces à lamelles coudées rendent la tâche beaucoup plus facile. (B) Couvre-lamelles pour le lavage. Notez qu’en plus du rayonnage droit, les lamelles sont également inclinées entre les rainures adjacentes pour augmenter la capacité. (C) Quatre grilles de lamelles dans un plat de coloration. Un plat de coloration en verre contient des dizaines de lamelles de recouvrement et est imperméable au lavage à l’acide HCl. (D) Une chambre humidifiée préparée. L’extérieur est recouvert d’une feuille d’aluminium pour créer un environnement sombre, préservant les fluorophores. Des serviettes en papier humides au fond fournissent de l’humidité. (E) La chambre humidifiée scellée. Un couvercle hermétique est essentiel pour éviter le dessèchement. (F) Fabrication du support de feuille d’aluminium. L’embossage des arêtes sur la feuille coupée permet d’éviter que les lamelles ne glissent les unes dans les autres pendant l’étape de dénaturation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Résultats représentatifs d’expériences d’imagerie à quatre canaux, y compris IF, FISH et PF exprimés. Les panneaux illustrent les résultats réels des expériences décrites à la figure 2. DAPI colore l’ADN, nAC-GFP met en évidence l’actine f nucléaire, TelFISH et TRF2-mCherry marquent les télomères, l’immunocoloration PML marque les corps nucléaires PML et nTelFISH révèle l’ADNsb télomérique. Toutes les cellules sont des cellules d’ostéosarcome U2OS. Les images ont été acquises à l’aide d’un microscope confocal doté d’une capacité de super-résolution. Exemple 1 : les images ont été acquises par microscopie confocale à balayage laser ; toutes les autres images ont été acquises par microscopie à illumination structurée. Toutes les barres d’échelle représentent 5 μM. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Les expériences utilisant IF-FISH ont longtemps été un pilier dans le domaine des télomères en tant que test de stress télomère ou de détection de l’ALT ^5,6,16. Ici, le protocole est étendu pour inclure une protéine fluorescente. De plus, l’option de télomère natif FISH est proposée sous la forme d’un test ALT orthogonal¹¹. Ce protocole est simple à mettre en œuvre et produit des résultats satisfaisants de manière fiable.

En opérant sur des lamelles avec des gouttelettes d’anticorps ou des sondes PNA, ce protocole est conçu pour être économe. L’utilisation de gouttelettes permet d’économiser de précieux réactifs. En revanche, les alternatives telles que les lames chambrées sont chères et offrent moins de flexibilité. Bien que la manipulation des lamelles demande de la pratique pour développer les compétences, les économies réalisées font que l’investissement en temps en vaut la peine. Il convient de noter que les gouttelettes de réactif de plus de 75 μL ne sont pas recommandées. Les gouttelettes plus grosses font simplement glisser les lamelles et n’améliorent pas les résultats.

L’expression de nAC-GFP est un outil indispensable pour la visualisation de la f-actine⁸ nucléaire, comme le montre la figure 4. Il existe de nombreux autres réactifs étiquetés qui peuvent aider à répondre à d’importantes questions biologiques. Par exemple, le système plasmidique FUCCI peut être utilisé pour visualiser le cycle cellulaire, et l’utilisation de ce protocole pourrait être combinée avec le télomère FISH¹⁷. Une approche différente pour doser le cycle cellulaire pourrait utiliser le chromobody PCNA pour obtenir des informations sur le cycle cellulaire¹⁸. Selon la question posée, de nombreux réactifs marqués FP sont disponibles dans le commerce.

Ici, ce protocole est démontré avec des FISH de télomères, mais des résultats positifs ont également été obtenus avec des FISH centromères, en utilisant une sonde PNA à la même concentration. Il est possible de multiplexer une sonde centromère marquée FAM avec une sonde télomère marquée Cy3, par exemple. Il est important de souligner qu’il est peu probable que le protocole fonctionne avec l’ADN FISH à locus unique. Pour sonder un seul locus, la digestion de l’échantillon par la protéase est nécessaire, et cette digestion est clairement incompatible avec la détection IF ou FP¹⁹. Cependant, la combinaison de la FI et de l’ARNm FISH avec une approche similaire a été couronnée de succès ; évidemment, l’étape de traitement de la RNase doit être omise dans ce scénario.

Enfin, il est évident que le FISH de télomères natifs devient rapidement un test essentiel pour le statut ALT^20,21 . Contrairement au test du cercle C pour ALT, qui est basé sur la population²², le FISH de télomères natifs fournit une lecture ALT au niveau cellulaire, permettant une détection sensible des changements dans la dynamique ALT. En unissant le télomère natif FISH avec l’expression d’IF et de FP, des informations importantes sur le mécanisme ALT peuvent être révélées. Avec le temps, nous espérons que ces connaissances conduiront à des thérapies ciblées pour les tumeurs qui dépendent de l’ALT pour l’entretien des télomères.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10 % Préadolescent-20	Bio-Rad	1610781	Jeter si la solution est trouble.
10 fois par PBS	Gibco	70011044	Pour préparer des tampons de fixateur et d’autres tampons, utilisez la post-fixation
Plaques de culture cellulaire à 12 puits	Nunc	150628
16 % de formaldéhyde sans méthanol	Thermo Scientifc	28908
5 M de chlorure de sodium	Millipore Sigma	S6546
Cellules adhérentes, par exemple cellules d’ostéosarcome U2OS	ATCC	HTB-96
Boîte hermétique pour chambre humidifiée	Mépal	106415032500	N’importe quelle boîte hermétique appropriée fera l’affaire, mais méfiez-vous des boîtes dont le fond est inégal.
Alconox	Millipore Sigma	Z742914
Aluminium	Fisher Scientific	01-213-100
Milieu de culture cellulaire approprié, par exemple McCoy’s 5A	Gibco	16600082	pour U2OS, ajouter 15 % FBS
Sonde centromère (FAM)	Biographie de PNA	F3001	Plusieurs fluorophores sont disponibles
Plasmide ChromoTek Nuclear Actin-Chromobody (TagGFP)	Proteintech	ACG-N
Forceuses à lamelles	Outils scientifiques fins	11251-33
Supports à lamelles	Millipore Sigma	Z688568
DAPI	Invitrogen	Réf. D21490	Facultatif, dans le cas où le support de montage ne contient pas de tache d’ADN
Sérum d’âne	Jackson Immunorecherche	017-000-121
EGTA	Bio-Monde	40520008	0,5 M Solution pH 8,0
éthanol	Warner-Graham	200 Épreuve
Sérum fœtal bovin	Gibco	A5670801
Fibronectine	Millipore Sigma	F0635	Pour le revêtement facultatif des lamelles
Formamide	Millipore Sigma	47671-250ML-F
Lamelles de protection en verre allemandes	Engagements Warner	64-0714	CS-18R15 (Épaisseur #1.5, vérifiez qu’il convient à votre microscope)
GFP Booster	Proteintech	gb2AF488	reconnaît GFP/mClover/YFP/Venus et d’autres.  ; Voir les informations sur le produit pour une liste complète
Plat en verre avec couvercle	Millipore Sigma	900203
Nettoyeur à ultrasons chauffé avec minuterie numérique	Branson	Réf. CPX-952-218R	Ce modèle de sonicateur de bain inclut de la chaleur mais n’a pas de puissance ou d’intensité configurable.
Acide chlorhydrique	Millipore Sigma	258148	Le HCl concentré est de 12 N. Ajouter 20 mL de HCl concentré à 220 mL d’eau déminéralisée pour 1 N HCl
Solution de chlorure de magnésium	Millipore Sigma	63069	Solution de 1 m
MES	Millipore Sigma	475893
méthanol	Millipore Sigma	179337
Parafilm	Scientifique américain	3023-4526
Chlorure de potassium	Millipore Sigma	P9541
anticorps primaires  ; souris anti-PML	Santa Cruz	SC-377390
anticorps primaires  ; lapin anti-53BP1	Novus	Réf. NB100-904
anticorps primaires  ; lapin anti-PML	ABclonal	A1184
Prolongez le verre avec NucBlue	Invitrogen	Réf. P36981
Booster d’appel d’offres	Proteintech	Référence : rb2AF568	reconnaît mRFP/mCherry/mKate2/mPlum.  ; Voir les informations sur le produit pour une liste complète
ARNase A	Millipore Sigma	ARNASEA-RO
Solution de blocage Roche	Millipore Sigma	11096176001
anticorps secondaires, par exemple AF488 anti-souris	Invitrogen	; A-11001	Ou similaire
anticorps secondaires, par exemple AF594 anti-lapin	Invitrogen	A-11012	Ou similaire
anticorps secondaires, par exemple AF647 anti-souris	Invitrogen	A-21235	Ou similaire
spatule	Fisher Scientific	10257402
PBS stérile	Gibco	14190144	Pour la préparation des lamelles
saccharose	Millipore Sigma	S0389
Sonde TelC (Cy3)	Biographie de PNA	F1002	Plusieurs fluorophores sont disponibles
Sonde TelG (AF647)	Biographie de PNA	F1014	Plusieurs fluorophores sont disponibles
Tris Base	Millipore Sigma	648311	Préparez une solution de 1 M dans l’eau, ajustez le pH à l’aide de HCl
triton X-100	Millipore Sigma	X100
Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge de phénol	Gibco	25200072
Microscope Zeiss Elyra	Zeiss		Ou similaire