Article de méthode

Essai d’épissage massivement parallèle pour examiner les erreurs d’épissage causées par des variants introniques liés à des maladies

DOI :

10.3791/68984

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9 septembre 2025

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1Institute of Molecular Biology, Academia Sinica, 2Genome and Systems Biology Degree Program, Academia Sinica and National Taiwan University, 3Institute of Statistical Science, Academia Sinica

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous présentons un protocole détaillé pour effectuer des tests d’épissage massivement parallèle (MaPSy), qui utilisent des constructions de minigènes pour évaluer systématiquement les variants introniques en vrac. Cette approche permet une analyse à haut débit des changements d’épissage induits par les variants dans les cellules par séquençage d’amplicon, fournissant des évaluations fonctionnelles de leur impact sur l’épissage pré-ARNm.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les erreurs d’épissage représentent 10 à 30 % des mutations pathogènes responsables de maladies génétiques rares. L’épissage de l’ARN assure une bonne expression des gènes en joignant sélectivement les exons et en supprimant les introns, les séquences régulatrices clés étant situées dans les introns. Le site d’épissage 5' et le site de branche interagissent avec de petits ARN nucléaires pour former le complexe de reconnaissance de l’épissage, tandis que des éléments tels que le tractus polypyrimidine et les amplificateurs/silencieux d’épissage recrutent des protéines pour réguler l’assemblage de l’épissage. Il est difficile de prédire les perturbations de l’épissage à partir de variants introniques en raison de la complexité de ces interactions.

Les variants introniques, qui représentent 90 % des variations naturelles des gènes humains, peuvent perturber l’épissage canonique et donner lieu à des maladies. Pour étudier cette possibilité, nous avons développé un test d’épissage massivement parallèle (MaPSy) pour évaluer les variants introniques identifiés par les patients. Des oligonucléotides synthétisés avec des séquences de référence ou variantes ont été ligaturés en minigènes d’épissage contenant des signaux de promoteur et de polyadénylation. Chaque construction comprenait deux exons constants flanquant un exon central qui abritait la séquence de jonction intron-exon variable d’intérêt. L’efficacité de l’épissage cellulaire des séquences de variantes a été comparée à celle de leurs homologues de référence, ce qui nous a permis d’identifier des perturbations significatives en tant que variantes d’épissage.

Les résultats du MaPSy peuvent être validés par des approches supplémentaires, telles que des tests de minigènes ou l’édition du génome médiée par CRISPR in vivo. De plus, l’analyse globale des jonctions perturbées peut fournir des informations plus approfondies sur les mécanismes d’épissage et la base moléculaire des maladies associées aux erreurs d’épissage.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’épissage de l’ARN est un processus crucial qui relie les exons pour la traduction et élimine les introns, facilitant l’exportation de l’ARN et maintenant l’homéostasie des acides nucléiques. Ce mécanisme étroitement régulé fonctionne de manière temporelle et spatiale, contribuant à la diversité et à la complexité du transcriptome1. L’épissage est guidé par des signaux clés, notamment le site d’épissage 5' (5'ss), le site de branche et le site d’épissage 3' (3'ss), ainsi que par des éléments régulateurs supplémentaires tels que le tractus polypyrimidine en aval du site de branche et la zone d’exclusion des dinucléotides AG, qui aident à la reconnaissance des 3 s2. Mécaniquement, le petit ARN nucléaire U1 (ARNnb) s’apparie avec le 5'ss, tandis que le site de la branche interagit avec l’ARNnbU2 3. L’activité coordonnée du site de branche, du tractus polypyrimidine et des 3 ss facilite la liaison des petites nucléoprotéines U2 (snRNP) et des facteurs auxiliaires U2, stabilisant l’épissage et positionnant le point de branche pour l’attaque nucléophile sur les 5, initiant ainsi l’épissage.

Avec les progrès rapides des technologies de séquençage, le coût du séquençage du génome entier continue de diminuer, conduisant à un catalogue toujours plus large de variantes génétiques humaines. On estime que 10 à 30 % des mutations associées à la maladie dans les maladies génétiques rares affectent l’épissage de l’ARN 4,5,6, produisant souvent des produits géniques aberrants qui peuvent servir de cibles thérapeutiques. Cependant, l’évaluation de l’impact fonctionnel des variantes introniques reste difficile en raison de la complexité des signaux d’épissage, qui sont souvent redondants et dégénérés. Bien que les sites d’épissage de 5' et 3' soient relativement bien caractérisés, les sites de branchement, les voies de polypyrimidine et d’autres éléments régulateurs d’épissage présentent une variabilité considérable de séquence et de position chez les eucaryotes supérieurs. Des études de cartographie à grande échelle ont en outre démontré que plusieurs sites de branches peuvent exister dans un seul intron7, 8, 9, 10, ce qui complique l’interprétation des variations de la limite intron-exon.

L’apprentissage profond a été utilisé pour évaluer comment les séquences primaires contribuent à la reconnaissance des sites d’épissage 4,11,12, révélant que les variantes d’épissage se regroupent aux sites d’épissage canoniques tout en s’étendant peu dans l’exon et la région 3' des introns. Ce modèle s’aligne sur la compréhension établie selon laquelle la sélection du site d’épissage 5' est principalement dictée par des séquences consensus, tandis que la reconnaissance du site d’épissage 3' dépend d’éléments introniques supplémentaires, tels que les sites de ramification et les faisceaux de polypyrimidine. Cependant, les modèles existants ont été entraînés à distinguer les sites d’épissage constitutifs des sites alternatifs ou artificiels plutôt que de se concentrer spécifiquement sur les variantes introniques. En conséquence, ces outils de calcul ne montrent qu’une précision prédictive modérée, identifiant principalement les sites d’épissage et les variantes d’épissage exonique 13,14,15,16. En plus des modèles prédictifs, un système expérimental capable de valider les variantes d’épissage en vrac améliorerait considérablement l’identification et la caractérisation des défauts d’épissure.

Les données complètes de séquençage de l’ARN reliant les variants introniques associés à la maladie aux phénotypes d’épissage restent rares en raison de leur faible fréquence et de la difficulté de prédire les résultats de l’épissage à partir des ensembles de données existants. Pour combler cette lacune, des tests d’épissage à haut débit et des modèles informatiques ont été développés pour analyser systématiquement les variantes d’épissage. Des tests de rapporteur d’épissage massivement parallèle (MaPSy) ont été conçus pour évaluer l’impact de séquences variables sur la sélection du site d’épissage. En incorporant des variations de séquence près des sites d’épissage 5' et 3' ou en couvrant des régions entières d’intron-exon dans des squelettes minigènes fixes, MaPSy permet une évaluation fonctionnelle des altérations de l’épissage. Cependant, en raison des limites de la synthèse d’oligonucléotides en vrac, les variants introniques profonds et l’activation des pseudo-exons ne sont pas pris en compte dans cette approche.

La robustesse de MaPSy a été validée à l’aide de 70 minigènes d’épissage indépendants, ce qui donne une corrélation de Pearson de 0,8917. Notamment, environ 90 % des variantes donneuses d’épissage (+1 et +2) présentaient des défauts d’épissage, ce qui souligne la précision du test. De plus, MaPSy avec des séquences de sites de branche randomisées a révélé la nature dégénérée de la reconnaissance des sites de branche et sa dépendance aux protéines du noyau U218. De plus, une conception MaPSy à GFP divisée couplée à un tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) a été utilisée pour étudier les événements de saut d’exon causés par des variations génétiques. Cette approche a révélé que 54 % des variants perturbateurs de l’épissage résident dans les régions introniques, y compris les sites d’épissage canoniques13, soulignant le rôle significatif des éléments introniques dans la régulation de l’épissage. Collectivement, ces résultats renforcent l’importance des séquences introniques dans le contrôle de l’épissage et démontrent l’utilité de MaPSy dans l’identification des défauts d’épissage associés à la maladie (Figure 1).

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Figure 1 : Conception expérimentale d’un test d’épissage massivement parallèle (MaPSy) de mutations introniques proches de l’exon. Les variantes documentées dans les bases de données de maladies humaines ont été collectées et synthétisées sous la forme de 5 307 paires d’oligos. Chaque paire d’oligos contient un allèle de référence et un allèle variant dans les régions introniques à 78 nucléotides (nt) et exoniques à 35 nt. Les oligonucléotides sont flanqués de sites d’amorçage communs pour l’amplification et la ligature en minigènes d’épissage à 3 exons. En conséquence, la région synthétisée comprend les 3's du deuxième exon du minigène. Après l’assemblage des minigènes, les minigènes regroupés ont été épissés dans des cellules de rein embryonnaire humain (HEK293T). Les isoformes épissées résultantes ont été récoltées et résolues par séquençage d’amplicons. Cette figure a été adaptée avec la permission de Chiang et al.17. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synthèse de la banque d’oligonucléotides (oligo) MaPSy

  1. Structure oligologique de base : Concevez chaque oligo du pool de 155 nonlototides (nt) pour inclure une séquence exonique de 35 nt et une séquence intronique de 80 nt, formant une région spécifique au gène de 115 nt flanquée de séquences d’amorçage communes de 20 nt nt à chaque extrémité (Figure 2A).
  2. Collection de variantes : Pour conserver l’intégrité du motif et se concentrer sur les régions régulatrices affectant l’épissage, collectez les variantes introniques qui sont :
    -78 à +10 nt des 3
    -3 à +30 nt du 5'ss
    REMARQUE : Les variants cliniques peuvent provenir de ClinVar19, d’entrées à faible fréquence dans dbSNP20, de publications pertinentes et de bases de données cliniques supplémentaires. Les coordonnées du génome peuvent être utilisées pour croiser les variants avec les régions génomiques souhaitées (par exemple, en utilisant BEDTools21). Seuls les polymorphismes mononucléotidiques (SNP) et les petites insertions/délétions (indels) inférieures à 15 nt doivent être sélectionnés pour minimiser la variabilité de taille au sein du pool d’oligonucléotides pour la synthèse en vrac.
  3. Structure de base du minigène : Pour préserver la structure de la jonction d’épissage, chaque squelette de minigène contient trois exons : deux exons externes constants codant pour des fragments d’EGFP (de pGint, Addgene Plasmid #24217) et un exon moyen dérivé de l’exon 15 de CAMTA2 humain (Figure 2B). Digérer à la fois le fragment CAMTA2 et pGint avec les enzymes de restriction BamHI et SalI et ligaturer le fragment CAMTA2 en pGint entre les exons EGFP, créant ainsi des minigènes à trois exons pGint-CAMTA2 (Fichier supplémentaire 1).
    REMARQUE : L’exon moyen, c’est-à-dire l’exon 15 de CAMTA2 , doit présenter une efficacité d’épissage intermédiaire lorsqu’il est exprimé dans les cellules cibles. Cette caractéristique est essentielle car elle fournit une base de référence équilibrée, permettant de détecter à la fois les augmentations et les diminutions de l’efficacité de l’épissage dues à des effets variants.
  4. Conception du site d’amorçage : Ajouter la séquence du site d’insertion aux deux extrémités de la bibliothèque de sorte que chaque oligo contienne des séquences flanquantes de ~20 nt qui chevauchent le site d’insertion prévu dans l’exon/l’intron moyen (Figure 2A).
    REMARQUE : Si le pool d’oligo-gènes est conçu pour plusieurs constructions de minigènes, plusieurs sites d’amorçage peuvent être incorporés.
  5. Conception de codes-barres : Pour les variantes introniques, les codes-barres exoniques sont essentiels pour distinguer les génotypes des produits épissés, car les séquences introniques sont perdues après l’épissage. Pour éviter toute altération de l’épissage due aux séquences de codes-barres (c’est-à-dire l’effet du code-barres), positionnez les codes-barres distalement à l’intérieur des exons, loin des sites d’épissage (c’est-à-dire juste à côté du site d’amorçage exonique).
    REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser plusieurs codes-barres par variante dans la mesure du possible. La longueur requise du code-barres dépend de la complexité de la bibliothèque. Par exemple:
    Un code-barres de 1 nt est suffisant si un allèle de référence ne s’apparie qu’à une seule variante.
    Un code-barres de 2 nt est préférable si un allèle de référence s’apparie avec six variantes différentes.
    Les banques comportant plusieurs variants étroitement liés à un seul allèle de référence (p. ex., ne différant que d’un seul nucléotide) peuvent augmenter la complexité de l’analyse.
  6. Ordre des oligos : Ordre des oligos au format de fichier FASTA, chaque variante étant associée à son allèle de référence.
    REMARQUE : Pour les jonctions avec plusieurs variantes, un seul allèle de référence est nécessaire par jonction. Des services de synthèse de séquences groupées sont disponibles auprès de sociétés telles que GeneScript (https://www.genscript.com/gentitan-oligo-pools.html), Twist Bioscience (https://www.twistbioscience.com/products/oligopools), IDT (https://sg.idtdna.com/pages/products/custom-dna-rna/dna-oligos/custom-dna-oligos/opools-oligo-pools) et Agilent (https://www.agilent.com/en/product/oligo-pools-oligo-gmp-manufacturing/pooled-oligo-synthesis). La durée de la synthèse, la capacité de la bibliothèque et les coûts peuvent varier en fonction du fournisseur et de la région.

figure-protocol-1
Figure 2 : Conception de minigènes d’oligo-épissage et d’épissage pour MaPSy. (A) Conception pour la synthèse d’oligos groupés de l’extrémité 3' ou 5' des introns. Les diagrammes illustrent la structure de base des oligos de 155 nt. La capacité réelle de synthèse d’oligo-éléments dépend de l’entreprise sélectionnée pour la production. (B) Conception des minigènes MaPSy. Un minigène à trois exons (ii) a été modifié à partir du plasmide pGint (i), et les sites d’épissage ont été remplacés par les oligos regroupés pour introduire des variations de signal d’épissage (iii). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Construction de modèles d’ADN de la bibliothèque MaPSy

  1. Amplification initiale à la réception du pool d’oligo-umçons
    1. À la réception du pool d’oligonucléoses, amplifier 10 à 50 ng de la bibliothèque d’oligos avec les sites d’amorçage flanquants conçus par une réaction en chaîne par polymérase (PCR) de 100 μL à l’aide d’une ADN polymérase haute fidélité pour convertir les oligos en doubles brins (amorces LibF et LibR dans le tableau 1, réglages du thermocycleur dans le tableau 2).
    2. Nettoyez les produits PCR à l’aide de colonnes de purification. Dans le détail, liez le produit PCR à la membrane de la colonne, puis lavez-le avec des tampons contenant 70 % d’éthanol pour éliminer les amorces, les sels et la polymérase résiduels. Enfin, éluez le produit PCR purifié à l’aide d’un tampon à faible teneur en sel ou d’eau sans nucléases.
    3. Vérifiez la taille de l’oligo amplifié par électrophorèse sur gel. Chargez 5 μL du produit PCR purifié sur un gel d’agarose à 1,5 % préparé dans un tampon TAE 1× (40 mM de base Tris, 20 mM d’acide acétique, 1 mM d’EDTA, pH 8,0).
      REMARQUE : Limitez les cycles d’amplification de la PCR à 15 pour éviter la suramplification et le biais de la PCR. Une bande floue secondaire, généralement plus grande que le produit cible, peut indiquer une suramplification et un recuit incomplet au sein du pool d’oligos. Conservez une partie des produits PCR et séquencez le pool d’oligo-éléments pour évaluer la qualité et les taux d’erreur avant de procéder (point d’arrêt).
  2. Construction de minigènes d’épissage MaPSy - PCR initiale.
    1. Fragments de squelette : Utiliser 0,5 ng du squelette plasmidique pGint-CAMTA2 comme source pour les deux principaux fragments de PCR
      1. Produit PCR 1 : Amplifier le promoteur du CMV, le premier exon (EGFP N-terminal) et une partie du premier intron (Tableau 1 et Tableau 2).
      2. Produit PCR 3 : Amplifier une partie de l’exon moyen (exon 15 de CAMTA2), du deuxième intron, du troisième exon (EGFP C-terminal) et du signal de polyadénylation SV40 (Figure 3, Tableau 1 et Tableau 2).
    2. Amplicon de la bibliothèque : Produit PCR 2 : Pour la banque 3ss, amplifiez les amplicons de la bibliothèque avec des séquences qui se chevauchent à chaque extrémité pour correspondre aux extrémités internes du produit PCR 1 et du produit PCR 3, permettant une intégration efficace au niveau des 3 de l’exon 15 de CAMTA2 (Figure 3, Tableau 1 et Tableau 2).
      REMARQUE : Pour la bibliothèque 5'ss, remplacez l’extrémité 5' de la jonction d’exon centrale par la séquence de bibliothèque.
  3. Après la PCR, nettoyez tous les produits à l’aide de colonnes de purification à l’étape 2.1.2. Pour éviter la contamination par le vecteur matrice, purifier les produits souhaités de la PCR1 et de la PCR3 par extraction sur gel d’agarose. Plus précisément, après l’électrophorèse, excisez ~ 100 mg de gel d’agarose contenant le produit PCR cible et dissolvez-le dans le tampon de liaison. Liez la solution de gel dissous à la membrane de la colonne, puis procédez avec le protocole de purification PCR standard.
  4. Construction de minigènes d’épissage MaPSy - PCR d’extension de chevauchement : Effectuez un ou plusieurs cycles séquentiels de PCR superposés pour ligaturer les trois fragments principaux (produit PCR 1, amplicon de bibliothèque et produit PCR 3 ; utilisez ~ 20 ng chacun comme modèle) en un minigène d’épissage complet (utilisez les amorces les plus externes CAMGFPF et CMVGFPR dans le tableau 1, et les paramètres du thermocycleur dans le tableau 2).
    REMARQUE : Le produit final contient le promoteur CMV et trois exons avec les 3 premiers s dérivés de la bibliothèque d’oligonucléotides, et il est prêt pour la transfection pour les expériences cellulaires.
  5. Après l’assemblage, nettoyez les matrices d’ADN sur toute leur longueur à l’aide de colonnes de purification par PCR. Si des bandes non spécifiques sont observées dans le gel, effectuez l’extraction du gel pour isoler précisément le produit souhaité sur toute la longueur à l’étape 2.3.
    REMARQUE : Des séquences très similaires dans la bibliothèque peuvent entraîner un assemblage incomplet. S’il est difficile d’effectuer un assemblage complet en une seule réaction de PCR, des PCR séquentielles superposées (en commençant par deux fragments, puis en ajoutant un troisième) peuvent être tentées. Pour améliorer la spécificité de la PCR, envisagez d’ajuster la température de recuit ou de mettre en œuvre une PCR de contact pour améliorer la spécificité de liaison des modèles complexes. Préparez suffisamment de constructions MaPSy pour réaliser au moins quatre expériences indépendantes. Conservez une petite aliquote de chaque construction pour le séquençage de nouvelle génération afin de vérifier l’intégrité de la séquence, car certains oligonucléotides peuvent ne pas s’amplifier efficacement et entraîner des assemblages incomplets (point d’arrêt).

figure-protocol-2
Figure 3 : Flux de travail de la construction de la bibliothèque. (A) Amorces utilisées dans la PCR qui se chevauche (voir aussi le tableau 1). (B) La procédure de chevauchement des PCR. En bref, les pools d’oligo-éléments et les autres parties des minigènes d’épissage ont été amplifiés par 25 cycles de PCR. Le fragment contenant le promoteur et le premier exon (produit PCR 1) a été cousu au pool d’oligo (produit PCR 2) en chevauchant la PCR à l’aide de 20 cycles d’amplification. Ensuite, le produit cousu (produit PCR 1+2) a été cousu au fragment contenant le 3eexon et le signal de polyadénylation (produit PCR 3) en utilisant 20 cycles d’amplification pour obtenir la construction finale (produit PCR 1+2+3). Cette figure a été adaptée avec la permission de Chiang et al.17. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Construction de l’abécédaire de la bibliothèque MaPSynote
CMVGFPFCCGCCATGCATTAGTTATTAATAGProduit PCR 1
LibR2CAGGTCTTCAGGCCCCAGCCProduit PCR 1
LibFGGCTGGGGCCTGAAGACCTGProduit PCR 2
LibrAAGGCGCACATGACCCCGGGProduit PCR 2
LibF2CCCGGGGTCATGTGCGCCTTProduit PCR 3
CMVGFPRGGACAAACCACAACTAGAATGCProduit PCR 3
Amorce PCR de la bibliothèque MaPSy pour le séquençage d’amplicons
P7-Lib0FGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTATAAGAGACAGAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P7-Lib1FGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTATAAGAGACAGNAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P7-Lib2FGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTATAAGAGACAGNNAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P7-LIB3FGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTATAAGAGACAGNNNAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P5-Lib0RITCGTCGGCAGCGTCAGATGTATAAGAGACAGCGAAGGCTCCTGTCTCTGTAGT
P5-LIB1RITCGTCGGCAGCGTCAGATGTATAAGAGACAGNCGAAGGCTCCTGTCTCTGTAGT
P5-Lib2RITCGTCGGCAGCGTCAGATGTATAAGAGACAGNNCGAAGGCTCCTGTCTCTGTAGT
P5-Lib3RITCGTCGGCAGCGTCAGATGTATAAGAGACAGNNNCGAAGGCTCCTGTCTCTGTAGT
Introduction à la validation
Lib0F (Validation de la bibliothèque)AAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
Lib0R (Validation de la bibliothèque)CAGCTTGCCGTAGGTGGCAT

Tableau 1 : Amorces utilisées dans ce protocole.

Mélange réactionnel PCR
ComposantsVolume
jjH2O13,4 μL
5x tampon HF4 μL
10 mM de dNTP0,4 μL
Amorce avant 10 μM0,5 μL
Amorce inversée 10 μM0,5 μL
ADNc1 μL
ADN polymérase haute fidélité0,2 μL
Exécuter le programme PCR (réaction de 20 μL)
IntérimaireHeureCycles
Dénaturation initiale98°C1 minute1
Dénaturation98°C30 secondes10–20
Recuit65°C30 secondes
Extension72°C30 secondesRetour à la dénaturation
Extension finale72°CDurée : 5 minutes1
Tenir4°CTenirTenir

Tableau 2 : Réglages du thermocycleur.

3. Expression et récupération de minigènes d’épissage à partir de cellules de mammifères

  1. Culture cellulaire : Maintenir HEK293T cellules dans le milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 100 unités/mL de pénicilline et de streptomycine, et 2 mM de L-glutamine dans 5 % de CO2 à 37 °C.
  2. Transfection des minigènes d’épissage :
    1. Plaque 5 × 105 HEK293T cellules dans 2 mL de milieu dans des plaques à 6 puits 24 h avant la transfection.
    2. Cellules transfectives avec 1 à 2 μg de constructions MaPSy, pré-incubées pendant 5 min avec un réactif de transfection de 3,75 μL, selon le protocole du fabricant. La réussite de la transfection est indiquée par la présence de signaux EGFP provenant de la bibliothèque épissée.
    3. Lyser les cellules à l’aide de 250 μL de Trizol (ou l’équivalent) 24 h après la transfection.
  3. Extraction de l’ARN : Extrayez l’ARN total à l’aide d’un kit miniprep d’ARN, en suivant le protocole du fabricant. Plus précisément, lier l’ARN du Trizol aux membranes de la colonne, laver avec des tampons contenant 70 % d’éthanol pour éliminer les sels, les protéines et autres impuretés, et éluer l’ARN purifié à l’aide d’un tampon à faible teneur en sel ou d’eau sans nucléases.
    ATTENTION : Le trizol (ou l’équivalent) est très corrosif et toxique. L’exposition peut entraîner de graves brûlures chimiques, des cicatrices permanentes et une insuffisance rénale.
    REMARQUE : L’ARN peut être stocké dans Trizol (ou un réactif équivalent à base de Trizol, tel que l’extracteur d’ARN TOOLSmart de TOOLS) à -80 °C pendant une période maximale d’un an (point d’arrêt). L’ARN purifié peut être stocké à -80 °C jusqu’à deux ans si les cycles de congélation-décongélation sont minimisés (point d’arrêt).
  4. Transcription inverse : Préparez de l’ADNc à partir de 2 μg d’ARN total en utilisant la transcriptase inverse avec des hexamères aléatoires, en suivant le protocole du fabricant. Plus précisément, incubez l’ARN avec 50 μM d’hexamères aléatoires à température ambiante pendant 10 min pour permettre le recuit, puis effectuez une transcription inverse à 55 °C pendant 10 min.
    REMARQUE : L’ADNc peut être stocké à -20 °C jusqu’à un an (point d’arrêt).
  5. Amplification des minigènes épissés : Effectuer une PCR en utilisant les séquences d’amorçage spécifiques des minigènes épissés (Tableau 2). Utilisez le nombre minimal de cycles nécessaire pour visualiser le produit sur un gel d’agarose.
    REMARQUE : Des bandes mélangées de produits non épissés et épissés doivent être visibles sur le gel. Les bandes peuvent sembler diffuses en raison de la population mixte d’espèces d’ADN (figure 4A).
  6. Nettoyez le produit PCR à l’aide des colonnes de purification à l’étape 2.1.2.
  7. Fixation des adaptateurs de séquençage : effectuez une dernière série de PCR pour attacher les séquences d’adaptateurs de séquençage aux extrémités de l’amplicon. Inclure 0 à 3 nucléotides aléatoires à l’extrémité des amplicons pour assurer une détection de fluorescence équilibrée sur la plateforme NextSeq (Tableau 1).
  8. Nettoyez le produit PCR à l’aide des colonnes de purification à l’étape 2.1.2.

4. Séquençage et analyse des amplicons

  1. Séquençage à lecture courte : Soumettre les amplicons PCR à un séquençage à 150 extrémités appariées à l’aide d’Illumina Miseq, de Novaseq ou d’un équivalent, par le biais d’une plateforme ou d’un service commercial.
  2. Alignement:
    1. Créer un génome de référence : créez un « génome de référence » synthétique en étiquetant chaque génotype unique comme un chromosome distinct. Le génome de référence comprend les exons et introns synthétiques contenus dans les amplicons.
    2. Aligner les lectures de séquençage : Alignez les lectures d’extrémité appariée sur le génome de référence à l’aide de HISAT222,23, en ajustant les paramètres pour contrôler les éléments spécifiques à l’épissage (voir le fichier supplémentaire 2 pour plus de détails sur la ligne de commande).
    3. Sélectionnez des lectures de haute qualité : convertissez SAM au format BAM, filtrez les lectures de haute qualité (qualité de mappage ≥60), puis triez et indexez les fichiers BAM24 (voir Fichier supplémentaire 2 pour plus de détails sur la ligne de commande).
    4. Identifiez les jonctions d’épissure et calculez les lectures de jonction : quantifiez l’utilisation des jonctions d’épissage en extrayant les événements de saut d’exon des chaînes CIGAR dans le fichier BAM aligné. Identifiez les lectures couvrant les jonctions en fonction des opérations « N » et agrégez le nombre de lectures par coordonnée de jonction et par brin pour évaluer les modèles d’épissage (voir le fichier supplémentaire 2 pour plus de détails sur la ligne de commande).
    5. Classer les sites d’épissage canoniques : Classez les sites d’épissage comme canoniques s’ils correspondent aux jonctions GT-AG annotées.
      REMARQUE : Dans de rares cas, les allèles de référence dans MaPSy peuvent utiliser des sites d’épissage non canoniques. Les lectures qui n’ont pas de jonctions couvrant la position désignée du site d’épissage sont conservées en tant que lectures non épissées.
  3. Analyse statistique pour identifier les variantes d’épissage : Catégoriser les lectures en trois groupes :
    (1) lectures épissées ou non épissées ;
    (2) canonique ou non canonique parmi toutes les lectures épissées ;
    (3) Lectures canoniques ou non canoniques plus non épissées.
    Effectuez un test exact de Fisher bilatéral, suivi d’une correction du taux de fausses découvertes (FDR) (tableau 3), afin d’évaluer l’impact des variantes sur l’efficacité et la précision de l’épissage.
  4. Filtrez les variantes d’épissage à haut niveau de confiance : classez comme significatives les paires référence/variante dépassant 100 lectures avec une valeur q inférieure à 0,05 sur quatre répétitions. Ensuite, considérons les candidats avec une variation du rapport de cotes de 2 fois avec l’allèle de référence ou le variant ayant >5 % de lectures non épissées et non canoniques, des variantes d’épissage à haut niveau de confiance (Figure 4B).
LitÉpisséNon épissé et/ou non canonique
Référenceunb
Variantecd

Tableau 3 : Tableau deux par deux pour le test exact de Fisher.

5. Validation

  1. Épissage de minigènes pour validation :
    1. Synthèse et amplification d’oligonucléotides : synthétiser individuellement les oligonucléotides d’ADN de séquences candidates MaPSy sélectionnées (par exemple, par des technologies d’ADN intégrées). Ensuite, amplifiez les oligonucléotides à l’aide des séquences flanquantes conçues en doubles brins par PCR à l’aide de l’ADN polymérase haute fidélité (Tableau 2).
    2. Clonage de minigènes : Digérer à la fois les produits de PCR résultants et le pGint-CAMTA2 par BbsI et SmaI et ligaturer le produit digéré par des ADN ligases.
    3. Transfection : Transfectez les constructions résultantes dans des cellules HEK293T à l’aide d’un réactif de transfection à l’étape 3.2.2.
    4. Extraction de l’ARN : Extraire l’ARN des cellules transfectées, comme décrit à l’étape 3.3.
    5. Transcription inverse : Effectuez une réaction en chaîne par polymérase à transcription inverse (RT-PCR) à l’aide d’hexamères aléatoires.
    6. Amplification des isoformes d’épissage : Amplifiez les isoformes d’épissage avec des amorces ciblant les deux premiers exons du minigène (Lib0F et Lib0Rl, tableau 1, paramètres du thermocycleur dans le tableau 2). Résoudre les produits amplifiés par électrophorèse et visualiser à l’aide du système Gel Doc.
    7. Quantification : Quantifiez l’intensité du signal de chaque isoforme d’épissage à l’aide d’ImageJ (National Institutes of Health, États-Unis)25,26. Vous pouvez également utiliser le kit de dépistage d’ADN à l’aide de l’analyseur d’acide nucléique haute performance eGENE HDA-GT12 pour quantifier l’intensité et le poids moléculaire des produits de PCR.
    8. Extraction et confirmation des isoformes : Isolez chaque isoforme par extraction sur gel d’agarose à l’étape 2.3, et confirmez le résultat de l’épissage par séquençage Sanger des produits PCR par le biais d’une installation centrale ou d’un service commercial, en évaluant l’épissage normal, l’inclusion d’intron et le saut d’exon.
  2. Minigènes d’épissage multi-exons :
    1. Après avoir validé les résultats de MaPSy, sélectionnez le variant d’intérêt et clonez trois à cinq exons de l’ADN génomique (ADNg) afin de fournir un contexte plus génomique pour le défaut d’épissage observé.
    2. Effectuer une mutagénèse dirigée à l’aide d’amorces mutagénisantes et de PCR superposées pour assembler des constructions de minigènes hébergeant l’altération de séquence souhaitée sur le site cible.
      REMARQUE : Si les introns flanquants sont trop longs pour le clonage, conservez environ 300 nt de la séquence intronique pour chaque site d’épissage afin d’assurer un contexte d’épissage approprié.
    3. Effectuez le test d’épissage cellulaire comme décrit ci-dessus en 5.1.
  3. Validation cellulaire : pour valider l’effet d’épissage dans les cellules, utilisez l’édition CRISPR basée sur un modèle pour modifier la séquence des variantes sélectionnées dans un modèle cellulaire approprié.
    REMARQUE : Dans la mesure du possible, utilisez des échantillons humains porteurs de la variante spécifique pour évaluer directement le modèle d’épissage.

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Résultats

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Après l’épissage cellulaire des constructions MaPSy, les produits épissés et non épissés sont présents sous forme de mélange. En raison de la diversité de la taille de la bibliothèque et du potentiel d’épissage non canonique, les deux types de produits peuvent sembler quelque peu diffus sur un gel. Dans les constructions ciblant l’extrémité 3', le deuxième intron, contenant des séquences adénovirales partielles, a tendance à s’épisser de manière très robuste (Figure 4A).

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Discussion

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Le signal EGFP intrinsèque dans la construction MaPSy permet la détection par fluorescence du saut d’exon. Si la séquence dans l’exon ou les introns moyens favorise le saut d’exon, la ligature du premier et du troisième exon produit un signal EGFP détectable par FACS, ce qui en fait une méthode précieuse pour identifier les variants qui influencent le saut d’exon et faciliter la visualisation par microscopie des variants d’épissage13. Cependant, l’approche de séqu...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

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Le financement de ce travail a été fourni par le Career Development Award, le Multidisciplinary Health Cloud Research Program, le Grand Challenge Seed Grant de l’Academia Sinica (AS-CDA-108-M03, AS-PH-109-01-3 et AS-GCS-113-L03), le Career Development Award des National Health Research Institutes de Taiwan (NHRI-EX112-10908BC), l’Excellent Young Scholar Research Grants et le Ta-You Wu Memorial Award du National Science and Technology Council, Taïwan (MOST 112-2628-B-001-009-MY3 et 108-2118-M-001-013-MY5).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Kit d’ARN Direct-zol MiniPrep PlusRecherche ZymoR2072
Dulbecco' s Aigle modifié' s Moyen (DMEM)Thermo Fisher Scientific11965084
Sérum fœtal bovin (FBS)Thermo Fisher Scientific26140079
L-GlutamineThermo Fisher ScientificA2916801
Lipofectamine 3000°Thermo Fisher ScientificL3000015
Pénicilline-streptomycineThermo Fisher Scientific15140122
Plasmide pGintAddgene24217
ADN polymérase haute fidélité PhusionThermo Fisher ScientificF530L
Kit d’extraction de gel QIAquickQiagen28706
Kit de purification QIAquick PCR  ;Qiagen28106
Kit de dépistage ADN QIAxcel (2400)Qiagen929004
Transcriptase inverse SuperScript IVThermo Fisher Scientific18090010

Références

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Mots-clés

Splicing ErrorsIntronic VariantsRNA SplicingMassively Parallel AssaySplicing MinigenesExon JunctionSpliceosome AssemblyGenome EditingSplicing EfficiencyDisease Mutations

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