Article de méthode

Fabrication par recombinaison de vecteurs viraux modifiés pour la recherche et la thérapie

DOI :

10.3791/68988

⸱

26 septembre 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CEINGE Biotecnologie Avanzate Franco Salvatore S.C.aR.L., 2Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 3ImGen-T Srl

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La recombinaison, une méthode de génie génétique médiée par la recombinaison, permet des modifications précises du génome viral sans dépendre de la digestion enzymatique. Cette approche est cruciale pour la recherche fondamentale, comme les délétions ciblées, et pour le développement de virus modifiés utilisés dans les thérapies oncolytiques, la thérapie génique et les vaccins génétiques, élargissant ainsi les possibilités de recherche et d’applications cliniques.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La demande croissante de vecteurs viraux modifiés dans la recherche fondamentale et translationnelle a souligné la nécessité de méthodes flexibles, rapides et évolutives pour générer des virus à ADN recombinant. Les stratégies reposant sur la restriction, la digestion enzymatique et la ligature sont limitées par des limitations dépendantes de la séquence et des étapes de clonage chronophages. Ici, nous décrivons la méthode de génie génétique médiée par recombinaison (recombineering) qui contourne ces limites en permettant des modifications précises et transparentes des génomes viraux dans les chromosomes artificiels bactériens (BACs). Cette approche permet la suppression, l’insertion ou la substitution efficaces d’éléments génétiques codants ou non codants, fournissant ainsi une plate-forme puissante pour le développement de vecteurs viraux à haut débit. La recombinaison est particulièrement précieuse dans les applications de recherche fondamentale, telles que la délétion ou la mutation de gènes viraux pour étudier leur fonction. Plus important encore, cette méthodologie permet de générer des dizaines de virus recombinants codant en parallèle pour des charges utiles immunostimulantes ou thérapeutiques distinctes, ce qui la rend exceptionnellement bien adaptée à l’évaluation préclinique rapide de nouvelles constructions. Bien que cette technologie puisse être potentiellement mise en œuvre à des fins scientifiques, cet article se concentre sur l’application de la recombinaison dans deux domaines spécifiques : la génération de virus oncolytiques basés sur le virus de l’herpès simplex et le développement de vecteurs adénoviraux non réplicatifs pour le transfert de gènes. En conclusion, la recombinaison offre une approche polyvalente de l’ingénierie du génome viral, accélérant considérablement le pipeline, de la conception aux tests fonctionnels. Sa pertinence s’étend de la virologie fondamentale à la médecine translationnelle pour répondre à l’évolution de la recherche et des besoins cliniques.

Introduction

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Les vecteurs viraux sont devenus des outils puissants dans la thérapie génique, la virothérapie oncolytique et le développement de vaccins génétiques en raison de leur capacité naturelle à délivrer du matériel génétique dans les cellules hôtes. Ils exploitent le tropisme naturel des virus et les mécanismes de transduction, facilitant l’expression des gènes à la fois transitoire et à long terme. Ils sont capables de survivre dans l’environnement extracellulaire, de se fixer à un récepteur cellulaire spécifique (qui définit le tropisme viral) et de favoriser leur internalisation, de détourner la machinerie d’expression des gènes de la cellule hôte et de piloter l’expression de leurs propres gènes, et d’échapper aux capteurs membranaires et intracellulaires du bras immunitaire inné 1,2. De cette façon, après une infection virale productive, les virus transforment les cellules en usines de descendance virale qui propagent de nouveaux virus dans l’organisme, provoquant finalement une maladie.

Les virus de type sauvage peuvent être transformés en outil biotechnologique par génie génétique : leur génome peut être facilement manipulé pour conserver la capacité de transduction et obtenir un résultat clinique. Sur la base de leur application clinique, les vecteurs viraux peuvent être modifiés pour conserver (au moins en partie) ou être ablatés dans leur compétence de réplication afin de générer des vecteurs compétents ou incompétents en réplication 3,4.

Les virus compétents en matière de réplication sont principalement destinés aux virus oncolytiques. Les cellules cancéreuses, souvent déficientes en défenses antivirales1, permettent la réplication de virus recombinants atténués modifiés par délétion de gènes de virulence. Ces virus se répliquent sélectivement dans les tumeurs tout en épargnant les tissus normaux. Au fur et à mesure que la compréhension de la virologie a progressé, les virus atténués ont été remplacés par des modifications génomiques plus précises conçues pour améliorer à la fois l’innocuité et l’efficacité thérapeutique.

Parmi les domaines d’intérêt nécessitant une ingénierie moléculaire chirurgicale des génomes viraux, citons : i) Les virus oncolytiques conditionnels à la réplication, où les promoteurs viraux sont remplacés par des promoteurs associés à la tumeur (promoteurs cellulaires surtranscrits dans les cellules tumorales), limitant ainsi l’expression des gènes viraux aux cellules malades5. ii) Virus à tropisme altéré 6,7, où les glycoprotéines d’enveloppe qui déterminent l’infection peuvent être modifiées ou remplacées par des fragments d’anticorps ou des ligands qui ciblent les protéines surexprimées sur les cellules tumorales 8,9. iii) Virus oncolytiques armés. La mort cellulaire tumorale induite par les virus oncolytiques déclenche la mort cellulaire immunogène (CIM), caractérisée par la libération de médiateurs inflammatoires 1,10 et d’antigènes tumoraux11. Ces signaux favorisent la reconnaissance efficace des antigènes tumoraux par le système immunitaire, rétablissant la surveillance12et permettant la combinaison avec des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires 13,14,15 et d’autres thérapies immunitaires telles que les thérapies à base d’ARN et les vaccins 16.

À l’appui de cet effet immunothérapeutique, des transgènes d’intérêt peuvent être codés dans le génome viral, exploitant ainsi le virus non seulement pour son activité oncolytique, mais aussi pour améliorer son potentiel immunothérapeutique grâce à la production in situ de charges utiles pertinentes 3,7,17,18,19. Ces charges utiles peuvent comprendre des cytokines, des chimiokines, des anticorps, des gènes de suicide et des antigènes 3,20. L’insertion nécessite de la précision, les régions intergéniques du génome viral étant privilégiées pour minimiser la perturbation des gènes viraux et préserver la réplication et la puissance7. Par conséquent, les techniques qui permettent de cribler à la fois les sites d’insertion optimaux et les transgènes d’intérêt sont essentielles.

D’autre part, dans le contexte des virus non réplicatifs, utilisés pour la thérapie génique ou comme vecteurs de vaccins génétiques, il est important que le vecteur viral délivre le transgène (de manière transitoire ou durable) sans se répliquer dans la cellule hôte pour éviter la toxicité21. Les vecteurs adénoviraux se caractérisent par une efficacité de transduction élevée, une expression robuste des transgènes et la capacité d’infecter les cellules en division et non divisées3. Ces propriétés en ont fait les premiers de leur catégorie pour le développement de vaccins génétiques, y compris ceux contre les maladies infectieuses émergentes, telles que le COVID-19, ainsi que les thérapies de remplacement génique22. L’exemple le plus célèbre de vecteur adénoviral qui a atteint le marché est le vaccin COVID-19 d’Oxford-AstraZeneca, connu sous le nom commercial de Covishield ou Vaxzevria, basé sur un adénovirus de chimpanzé modifié, ChAdOx1, codant pour la protéine Spike du SARS-CoV-2. Lorsqu’il est injecté par voie intramusculaire, Covishield est capable de pénétrer à l’intérieur des cellules et d’induire l’expression de la protéine Spike, incitant le système immunitaire à monter une réponse immunitaire contre celle-ci3.

Il est clairement nécessaire de modifier les génomes viraux sans être contraint par des sites de reconnaissance d’enzymes de restriction. Parmi les virus oncolytiques, les vecteurs basés sur le virus de l’herpès simplex 1 (HSV-1) offrent des avantages uniques, notamment la capacité lytique, l’innocuité et la grande taille du génome, permettant l’insertion de transgènes de taille importante ou de plusieurs éléments génétiques23,24. Au-delà du HSV, de nombreux autres virus sont prometteurs sur le plan thérapeutique, comme l’a récemment examiné Sasso et al.3. Plutôt qu’un vecteur universel « best-in-class », différentes plateformes virales sont adaptées à des besoins thérapeutiques distincts3. À l’heure actuelle, les systèmes de recombinaison homologue dans le clonage de bactéries ou de levures hybrides restent les alternatives les plus courantes aux enzymes de restriction, mais ceux-ci sont laborieux, en plusieurs étapes et inefficaces25.

Une alternative émergente est l’utilisation de CRISPR/Cas9, récemment appliqué pour modifier les génomes de virus, y compris le virus de la vaccine (VV), le virus de l’herpès simplex et les vecteurs adénoviraux. Cas9 est attrayant pour l’inactivation des gènes via des mutations indel, mais devient moins pratique lorsque plusieurs coupes sont nécessaires pour supprimer des segments de génome ou insérer un transgène via l’ADN du donneur. De plus, l’édition est limitée par la conception de l’ARNg, les effets hors cible dans les génomes viral et hôte, et la dépendance aux séquences PAM dans les régions d’intérêt25.

Dans cette optique, et à travers deux exemples basés sur le HSV et l’adénovirus, cet article illustre la méthode de recombinaison, qui peut être appliquée à grande échelle, des virus aux bactériophages, en passant par les plasmides complexes et divers systèmes expérimentaux. La recombinaison est une technique de génie génétique in vivo , utilisée principalement chez Escherichia coli, qui exploite les protéines de recombinaison de bactériophages dépendantes de la température pour catalyser la recombinaison homologue entre les éléments de l’ADN avec aussi peu que 30 pb d’homologie26. Cette approche permet l’insertion, la suppression ou la modification précises de séquences sans dépendre des sites de restriction ou de la taille de l’ADN. Dans ce manuscrit, nous décrivons une version basée sur la souche SW102 d’E. coli inductible par la chaleur, bien que d’autres souches avec des systèmes inductibles spécifiques soient également disponibles27.

La recombinaison commence par la préparation de cellules bactériennes électrocompétentes par le biais d’un choc de température contrôlé pour activer la machinerie de recombinaison de phages. Les molécules d’ADN portant les bras d’homologie appropriés sont ensuite électroporées. Il peut s’agir d’ADN double brin (ADNdb) généré par digestion de restriction ou PCR ou d’ADN simple brin (ADNsb) tels que les oligonucléotides. La présence de séquences homologues ainsi que de protéines de recombinaison active permet la création de nouvelles molécules d’ADN avec la modification souhaitée.

La technologie de clonage moléculaire recombinatoire permet un génie génétique précis et est appliquée dans divers contextes, y compris l’insertion de marqueurs sélectionnables ou non sélectionnables dans les plasmides, l’ADN chromosomique bactérien et les chromosomes artificiels bactériens (BACs). Les BACs sont particulièrement précieux pour le clonage de grands fragments génomiques, y compris l’ADN adénoviral et HSV, permettant la production rapide de vecteurs viraux. Au-delà des applications translationnelles, la recombinaison soutient également la recherche fondamentale en permettant la suppression, la modification ou le remplacement ciblés de gènes viraux ou de domaines protéiques. La recombinaison a certaines limites : des bras d’homologie courts entravent la recombinaison dans des régions répétitives ; Les substrats amplifiés par PCR peuvent occasionnellement introduire des mutations ; et la séquence de la région cible doit être connue.

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Protocole

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Comme condition préalable à la recombinaison, une souche bactérienne compétente (par exemple, SW102) avec un BAC-Genome d’intérêt doit être disponible. Bien que la recombinaison soit une méthode très efficace pour enrichir les colonies qui ont subi la modification souhaitée, nous décrivons ici une stratégie de recombinaison en deux étapes, appelées première et deuxième étapes (Figure 1). Dans un premier temps, une cassette d’expression contenant des marqueurs de sélection positifs et négatifs est insérée dans le lieu d’intérêt. Dans un deuxième temps, cette cassette est remplacée par la modification génétique réelle destinée au génome final. Les marqueurs de sélection utilisés dans cette étude comprennent la résistance à l’ampicilline (AmpR), l’activité de la bêta-galactosidase (β-gal) et le gène sacB ; Cependant, n’importe quelle combinaison de marqueurs de sélection positifs et négatifs peut être utilisée, en fonction des besoins spécifiques du groupe de recherche.

1. Insérez la cassette de sélection dans la région cible

  1. Jour 0
    1. Cellules SW102 striées contenant le taux d’alcoolémie souhaité sur la gélose LB + antibiotique (dont le gène de résistance est dans le taux d’alcoolémie (p. ex., chloramphénicol 12,5 μg/mL). Cultivez-les toute la nuit dans l’incubateur à 32 °C.
      REMARQUE : Évitez les températures > 32 °C pour éviter l’induction de gènes de recombinaison pendant cette phase.
  2. Jour 1
    1. Effectuez une PCR pour amplifier la cassette de sélection AmpR/LacZ/SacB. Utilisez des amorces avant et inverse contenant à l’extrémité 3' la séquence pour recuire et amplifier la cassette de sélection et à l’extrémité 5' 30-80 pb qui représentent des bras d’homologie à la région génomique virale à modifier (Tableau 1).
      REMARQUE : La cassette de sélection, ainsi que l’insert, peuvent être facilement commandés en tant que constructions synthétiques auprès de fournisseurs spécialisés. Cependant, il faut veiller à éviter la présence de promoteurs dupliqués, de terminateurs ou d’autres éléments génétiques soit dans le BAC (contrôle des gènes BAC) soit dans le génome viral pour éviter les événements de recombinaison indésirables.
    2. S’assurer de l’identité et de la pureté du fragment de PCR par électrophorèse sur gel d’agarose (car la cassette AmpR/LacZ/SacB est de 3 400 pb, utilisez un gel d’agarose à 1 %) et que les valeurs 260/230 et 260/280 sont conformes à l’acide nucléique pur.
    3. Dans l’après-midi, inoculer une seule colonie de SW102 dans 5 mL de LB et incuber toute la nuit à 32 °C.
  3. Jour 2
    1. Injectez 1 à 2 ml de la culture de nuit dans 100 ml de lb frais. Cultivez les bactéries jusqu’à une DO600 de 0,55 à 0,7, en mesurant régulièrement la DO600 pour ne pas manquer la phase exponentielle.
    2. Préparez un bain-marie à 42 °C pour l’induction et refroidissez à 4 °C ~250 mL de ddH2O stérile pour les lavages.
    3. Une fois que la culture a atteint la DO désirée, transvaser 50 mL dans un tube conique propre et incuber à 42 °C dans un bain-marie pendant 15 min. Inclure un contrôle négatif non induit.
      REMARQUE : Cette étape induira des protéines rouges lambda.
    4. Laissez les tubes dans de la glace pendant 10 min, puis centrifugez-les pendant 5 min à 3 200 × g à 4 °C (à 42 °C induits et non induits).
    5. Jeter le surnageant, ajouter 40 mL de ddH2O stérile et glacé et remettre la pastille en suspension (à 42 °C et non induite).
    6. Centrifugez à nouveau pendant 8 minutes (voir étape 1.3.4) et répétez l’étape de lavage (étape 1.3.5) et la centrifugation. Répétez l’étape de lavage jusqu’à ce que le surnageant soit aussi clair que l’eau (sans turbidités ni suspensions) (2-4 lavages).
    7. Après la dernière centrifugation, jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 200 μL de ddH2O stérile et glacé (à 42 °C induit et non induit).
    8. Transvaser une aliquote des pastilles remises en suspension (50 μL de HSV-1 et 25 μL d’Adeno) dans des tubes prérefroidis de 1,5 mL (à 42 °C induits et non induits). Ajouter 50 à 400 ng de produit PCR purifié (ne pas dépasser 5 μL). Faites tourner les tubes et incubez sur de la glace pendant 5 min.
    9. Transvasez le mélange de l’étape précédente dans une cuvette prérefroidie et électroporate à 2,50 kV (2 500 V, cuvette de 0,2 cm) (à 42 °C induit et non induit).
    10. Après l’électroporation, laissez les bactéries se rétablir dans 1 mL de LB pendant 1,5 h à 32 °C. Ajoutez 1 mL de LB dans la cuvette pour la nettoyer et recueillir le tout.
    11. Répartissez différentes quantités de bactéries (10, 50, 200 μL) sur LB Agar + Ampicilline (100 μg/mL), X-Gal (20 μg/mL) et IPTG (0,5 mM) et laissez-les se développer pendant la nuit (ON) à 32 °C.
    12. Préparez des plaques avec de l’AMP/X-Gal (même concentration qu’à l’étape 1.3.11) et des plaques avec du saccharose5.
  4. Jour 3
    REMARQUE : À ce stade, on s’attend à ce que les colonies se soient développées et qu’elles apparaissent bleues, mais seulement sur les plaques où les bactéries ont été induites à 42 °C et électroporées avec l’insert contenant la cassette de sélection ont été plaquées. Une fois cela établi, il est nécessaire de vérifier l’intégrité de la cassette de sélection dans certaines colonies.
    1. Identifiez les plaques de l’Ontario où les colonies sont <50 pour éviter de choisir deux colonies ou plus. Choisissez plusieurs colonies (généralement 8 à 10 suffisent pour identifier au moins une colonie appropriée) et diluez-les dans environ 50 μL de H2O. Inoculez des colonies uniques et bleues dans 50 μL de H2O et striez-les sur des plaques sélectives négatives (gélose LB/Saccharose/Chloramphénicol) et positives (gélose LB/Ampicilline/Chloramphénicol/X-Gal/IPTG) (même concentration qu’aux étapes 1.1.2 et 1.3.11) (figure 2).
      REMARQUE : On s’attend à ce qu’il y ait de 20 à 100 colonies sur la plaque, où 50 μL ont été épandés. Cependant, si le nombre de colonies est plus faible, cela ne signifie pas nécessairement que la recombinaison est compromise.
    2. Inoculer l’eau de l’étape 1.4.1 dans 5 mL de LB et incuber les plaques et la culture de LB pendant une nuit à 32 °C (figure 2).
  5. Jour 4
    1. Ne sélectionnez que des colonies bleues qui ont poussé sur des plaques d’Amp/X-Gal et qui n’ont pas poussé sur des plaques de saccharose (figure 3). Pour ces clones positifs (tableau 2), transférez une aliquote de 500 μL de la culture de nuit dans 50 mL de LB frais.
  6. Jour 5
    1. Pour chaque clone positif, préparez un stab de glycérol et extrayez et isolez le plasmide BAC (midiprep).
    2. Après l’extraction BAC, effectuez un contrôle de qualité pour vérifier si la recombinaison s’est déroulée correctement. Effectuez le séquençage de Sanger du site d’insertion. Si tout semble correct, passez à la deuxième section.

2. Remplacez la cassette de sélection par la modification souhaitée

  1. Jour 0
    1. Streak le clone positif sur la gélose LB. Incuber toute la nuit à 32 °C.
  2. Jour 1
    1. Effectuez une PCR pour amplifier l’insertion/modification. Utilisez des amorces avant et arrière contenant à l’extrémité 3' la séquence pour recuire et amplifier la cassette de sélection et à l’extrémité 5' les mêmes bras d’homologie de 30-80 pb utilisés à l’étape 1.3.1 (Tableau 1).
    2. S’assurer de l’identité et de la pureté du fragment de PCR par électrophorèse sur gel d’agarose et que les valeurs 260/230 et 260/280 sont conformes à celles de l’acide nucléique pur.
    3. Inoculer une seule colonie dans 5 mL de LB et incuber toute la nuit à 32 °C.
  3. Jour 2
    1. Transférez 2 mL de la culture de nuit dans 100 mL de LB et cultivez à 32 °C jusqu’à ce que la DO600 atteigne 0,55-0,7 (en ~2,5-3 h). Préparez un bain-marie à 42 °C pour l’induction et refroidissez à 4 °C ~250 mL de ddH2O stérile pour les lavages.
    2. Une fois que la DO souhaitée est atteinte, transférez 50 mL de culture dans un tube conique et incubez dans le bain-marie à 42 °C pendant 15 min pour induire des protéines de recombinaison λ-phage. Conserver un autre tube de 50 mL à 32 °C comme témoin non induit.
    3. Après l’induction de la chaleur, placez les tubes sur de la glace pendant 10 min.
    4. Centrifugeuse pendant 8 min à 3 200 × g à 4 °C (à 42 °C induit et non induit).
      REMARQUE : À partir de ce moment, travaillez sur la glace pour maintenir la compétence de la cellule SW102.
    5. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension avec 40 mL d’eau prérefroidie en remuant doucement.
    6. Centrifuger pendant 5 min à 3 200 × g à 0-4 °C.
    7. Répétez l’étape de lavage (étape 2.3.5) une fois.
    8. Retirez le surnageant et remettez doucement la pastille en suspension dans 100 μL d’eau.
    9. Transvaser une aliquote des pastilles remises en suspension (50 μL de HSV-1 et 25 μL d’Adeno) dans des tubes prérefroidis de 1,5 mL (à la fois induits à 42 °C et non induits). Ajouter 50 à 400 ng de produit PCR purifié (ne pas dépasser 5 μL). Faites tourner les tubes et incubez sur de la glace pendant 5 min.
    10. Transférez le mélange de l’étape précédente dans une cuvette prérefroidie et électroporate à 2,50 kV (à 42 °C induit et non induit).
    11. Laisser les cellules se rétablir dans 5 mL de milieu LB pendant 4 à 5 h à 32 °C en agitant.
      REMARQUE : Le temps de récupération est plus long que lors de la première étape de recombinaison pour permettre la dégradation de la protéine SacB résiduelle après le remplacement de la cassette.
    12. Déposer différentes quantités (50, 200, 500 μL) de culture sur des boîtes de Pétri de gélose LB contenant du saccharose, du X-Gal et de l’IPTG (même concentration qu’aux étapes 1.1.2 et 1.3.11). Incuber toute la nuit à 32 °C.
  4. Jour 3
    1. Cribler un nombre important de colonies (20 à 100) pour augmenter la probabilité d’identifier les clones positifs qui ont réussi à subir une recombinaison avec le fragment porteur de la modification souhaitée et la cassette de sélection. Réaliser un dépistage de premier niveau par PCR de colonie. Utilisez une boîte de Pétri avec une grille ; choisissez des colonies dans un quadrant donné et étiquetez-les (Figure 4).
      REMARQUE : Une approche particulièrement efficace consiste à utiliser une paire d’amorces dans lesquelles l’une des recuits d’amorce à l’extérieur de la région cible (sur le génome viral) et l’autre à l’intérieur du fragment recombiné (Figure 5).
    2. Vérifiez la présence et la taille de l’amplicon PCR par gel d’agarose (1,5 %).
    3. Choisissez dans le bon quadrant les clones positifs et inoculez dans 100 mL de LB. Incuber toute la nuit à 32 °C.
  5. Jour 4 :
    1. Effectuez une midiprep pour extraire le plasmide des cultures bactériennes.
    2. Digérez le plasmide avec des enzymes de restriction et exécutez un gel d’agarose pour analyser le schéma de digestion.
    3. Si le schéma de digestion est correct, procédez au séquençage de la région modifiée du génome viral.
    4. Après s’être assuré de l’identité moléculaire des clones recombinants, procéder à la transfection et au sauvetage des particules virales.

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Résultats

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Génération d’un virus de l’herpès oncolytique codant pour l’IL12
Comme indiqué dans la section introductive de ce travail, une application potentielle de la recombinaison est l’insertion de transgènes immunostimulants dans le génome des virus oncolytiques, dans le but d’améliorer leur potentiel immunothérapeutique. Ci-dessous, nous présentons un exemple d’une telle application utilisant un vecteur oncolytique basé sur HSV-1. Plus précisément, cette étude étudie l’impact de l’insertion d’un transgène d...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole « RECOMBINEERING » (homologue RECOMBInation-mediated genetic engiNEERING) utilise une stratégie en deux étapes : d’une part, l’intégration d’une cassette de sélection dans le locus génomique d’intérêt, et d’autre part, le remplacement de cette cassette par la modification souhaitée (Figure 1).

Les marqueurs de sélection utilisés comprennent la résistance à l’ampicilline (AmpR), la bêta-galactosidase (β-gal) et le sacB...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun intérêt financier ou non financier pertinent à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par : PRIN 2022-MUR Italie, Grant 20224NCSN5 (PreMeRetHOn). POR Campania : piattaforma per lo sviluppo di nuove tecnologie vaccinali. PNRR CN3 Centre National de Thérapie Génique et de Médicaments basés sur la Technologie de l’ARN. PNRR PE13 : Actions de recherche fondamentale et translationnelle One Health pour répondre aux besoins non satisfaits en matière de maladies infectieuses émergentes. Les auteurs remercient le service de synthèse Geneart de fournir des ADN personnalisés. Les auteurs expriment également leur sincère gratitude à Michele Veneruso, qui a contribué à la réussite de cette étude.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Ampicillinequelconquequelconquegrade moléculaire
Pour que l’oligo amplifie Il-12 : CTGGCTAGCGTTTAA
ACGGGCCCTCTAGACTCG
AGCGGCCGCACGCCACCA
TGTGTCCTCAGAAGCTAACC		quelconquequelconqueHPLC purifié
Pour oligo à amplofy AmpR/LacZ/SacB  ; cassette : CTGGCTAGCGTTTAAA
CGGGCCCTCTAGACTCGAG
CGGCCGCACCaccC
CCTATTTGTTTATTTTTC		quelconquequelconqueHPLC purifié
L’IPTGquelconquequelconquegrade moléculaire
Gélose LB
LB moyen
Phusion Hot Start II ADN polymérase haute fidélité  ;Thermo ScientificF549S
Rev oligo pour amplifier Il12 : GGCAACTAGAAGGCA
CAGTCGAGGCTGATCAGC
GGTTTAAACTTAAGCTTTC
AGGCGGAGCTCAGATAG  ;		quelconquequelconqueHPLC purifié
Rev oligo en amplofy AmpR/LacZ/SacB  ; cassette : GGCAACTAGAAGGCAC
AGTCGAGGCTGATCAGC
GGTTTAAACTTAAGCTTT
TATTTGTTAACTGTTAATTG  ;		quelconquequelconqueHPLC purifié
Cassette de sélection SacB/AmpR/LacZCe manuscrit--
Saccharosequelconquequelconquegrade moléculaire
SW102 avec BAC-HSV-1 ou BAC-AdvCe manuscrit--
Tryptonequelconquequelconquegrade moléculaire
Wizard SV GelPromegaA9281
Gal Xquelconquequelconquegrade moléculaire
Extrait de levurequelconquequelconquegrade moléculaire

Références

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