Évaluation de l’innocuité microbienne des laiteries à l’aide du profilage protéomique bactérien via l’approche MALDI

Résumé

Ce protocole permet une évaluation rapide et rentable de la composition microbienne des produits laitiers en combinant la culturomique avec la SM MALDI-TOF. Il fournit des résultats de taxonomie comparables au séquençage de l’ARNr 16S avec un délai d’exécution plus court que les méthodes de culture traditionnelles.

Résumé

Nous présentons un protocole utilisant la méthode d’identification de la spectrométrie de masse à temps de vol par désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI-TOF MS, ci-après dénommée « MS ») pour surveiller la présence de micro-organismes dans différents produits laitiers (beurre, mozzarella, lait, crème) en utilisant une approche protéomique, une culturomique moderne et diverses procédures de préparation d’échantillons qui pourraient être incorporées aux laboratoires de contrôle de la qualité de la sécurité alimentaire sous forme rapide, Outil fiable et robuste pour la surveillance de la sécurité microbienne. Il comprend une étape d’isolement microbien, la sélection des colonies cultivées, les procédures de préparation des échantillons (cellules intactes, extraction sur place et en tube), la définition des paramètres d’analyse MS, la génération et la collecte de spectres MS (empreintes protéiques), et enfin l’obtention de la taxonomie à l’aide de la plateforme MS, suivie de l’interprétation et de la visualisation des données. Cette méthode, validée par de nombreuses études, offre une identification plus fiable et plus rentable des micro-organismes du lait par rapport aux systèmes d’analyse biochimiques commerciaux. Il s’agit d’une avancée prometteuse en microbiologie alimentaire, répondant aux diverses exigences des laboratoires grâce à des protocoles simples et à un temps d’analyse considérablement réduit. Le protocole présenté répond aux besoins de l’industrie alimentaire en fournissant une identification microbienne fiable dans un délai d’exécution approprié (TAT) bien adapté aux processus de fabrication.

Introduction

L’objectif global de ce protocole est de fournir une méthodologie complète pour surveiller l’innocuité microbienne de divers produits laitiers, y compris le beurre, le fromage, le lait et la crème, en utilisant la spectrométrie de masse pour le profilage protéomique bactérien. Cette approche, qui combine la culturomique moderne avec des procédures optimisées de préparation des échantillons, se veut un outil rapide, fiable et robuste pour les laboratoires de sécurité alimentaire et de contrôle de la qualité. La raison de la création et de l’application de cette méthodologie provient des limites des méthodes standard d’identification microbienne. Pendant de nombreuses années, les laboratoires vétérinaires et de diagnostic alimentaire se sont appuyés sur des tests biochimiques conventionnels qui examinent la croissance et le métabolisme bactériens sur des milieux de culture différentiels suivis de divers tests enzymatiques¹. Bien que ces méthodes, souvent basées sur des directives standard telles que celles du Manuel de bactériologie déterminante de Bergey, soient relativement peu coûteuses et puissent produire des données quantitatives et qualitatives, elles sont laborieuses et prennent du temps, nécessitant une préparation approfondie des milieux, la dilution des échantillons, le placage, l’incubation, le comptage des colonies, l’isolement et des étapes de caractérisation détaillées ^2,3.

L’introduction de systèmes commerciaux semi-automatisés et automatisés tels que l’Analytical Profile Index (API), le BBL Crystal, le Vitek et les Biolog MicroPlates a rationalisé l’identification microbienne à l’aide d’analyses biochimiques, réduisant ainsi les coûts et les délais d’exécution. Cependant, ces systèmes présentent certains inconvénients, tels qu’une faible reproductibilité, un manque d’entrées dans leurs bases de données respectives et des difficultés à déterminer les variations phénotypiques entre les souches, en particulier pour les bactéries non fermentatives ou les souches au sein d’une espèce présentant des différences biochimiques mineures, ce qui pourrait conduire à des résultats in vitro incorrects⁴. Dans ce contexte, la SEP est devenue une alternative puissante, actuellement courante en microbiologie clinique et qui attire l’attention des laboratoires de diagnostic vétérinaire et de qualité du lait. Cette approche a été complétée par sa rapidité, sa précision et sa rentabilité dans la détection de plusieurs micro-organismes¹. De nombreuses études ont démontré que la spectrométrie de masse offre une identification plus fiable des micro-organismes à partir du lait, ce qui permet d’obtenir des résultats plus rapides et moins coûteux que les systèmes d’essai biochimiques^{commerciaux5,6,7}. Alors que les tests biochimiques peuvent suffire pour l’identification au niveau du genre ou du groupe, le diagnostic au niveau de l’espèce nécessite souvent des méthodes plus avancées comme la MS ou le séquençage de l’ARNr 16S⁸. En effet, la spectrométrie de microbiologie alimentaire est considérée comme une plate-forme prometteuse pour l’identification flexible et fiable des isolats microbiens alimentaires, répondant aux diverses exigences des laboratoires de microbiologie alimentaire grâce à ses protocoles simples et à sa réduction significative du temps d’analyse, améliorant ainsi la sécurité des aliments ^4,5. Les coûts d’exploitation sont minimes en raison de la faible consommation de réactifs, et la manipulation des échantillons permet une plus grande automatisation et un débit élevé⁸. Cependant, il convient de noter que l’utilité de cette méthode dépend intrinsèquement des conditions de croissance microbienne sélectionnées (y compris le type de milieu de culture) et de la couverture d’espèces d’une base de données de référence, qui sont reconnues comme les principaux facteurs limitant son utilité.

La SEP joue un rôle important dans la microbiologie alimentaire en identifiant et en différenciant les bactéries pathogènes d’origine alimentaire, les bactéries lactiques (LAB) et d’autres bactéries fermentatives⁹. Son utilité s’étend à la culturomique moderne, permettant l’identification de toutes les colonies microbiennes cultivées sur des milieux de culture et facilitant l’acquisition d’informations sur les unités formant colonies (UFC)⁷. Cette approche a déjà été appliquée avec succès pour découvrir des communautés microbiennes aussi complexes que celles présentées dans les intestins humains, impliquées dans les infections du pied diabétique ou liées aux voies urinaires, revitalisant les méthodes dépendantes de la culture dans les pratiques microbiologiques^10,11.

Ce protocole est présenté pour guider les laboratoires dans la mise en œuvre efficace de la MS pour l’évaluation de routine de l’innocuité microbienne des produits laitiers, répondant ainsi au besoin de l’industrie d’une identification microbienne fiable dans un délai d’exécution pratique (TAT) adapté aux processus de fabrication. Le protocole détaille les étapes cruciales, notamment (1) l’isolement microbien de produits laitiers liquides (lait, crème, lactosérum) et solides (beurre, fromage) à l’aide d’une sélection de milieux de culture appropriés (gélose de Man, Rogosa et Sharpe - gélose MRS, gélose M-17, gélose tout usage Tween 80 - gélose APT, gélose au lactose bleu de Chine - gélose CBL, gélose au lait en plaque - MPCA, gélose tryptique au soja - TSA) et des conditions d’incubation adaptées ; (2) des procédures normalisées de préparation d’échantillons pour l’analyse MS, offrant des options telles que le transfert direct de colonie, l’extraction à l’acide formique sur cible et l’extraction en tube d’éthanol/protéine d’acide formique pour s’adapter à différents types de bactéries et aux flux de travail de laboratoire ; et (3) l’analyse systématique de la MS, y compris l’étalonnage des instruments, la définition des paramètres optimaux d’acquisition des spectres et les lignes directrices pour l’interprétation des données, y compris l’évaluation de la valeur du score et les vérifications de cohérence pour une attribution taxonomique fiable. En fournissant une approche structurée et validée, ce protocole vise à améliorer la précision et l’efficacité de la surveillance microbienne dans l’industrie laitière, contribuant ainsi à l’amélioration de la qualité des aliments et de la santé publique.

Protocole

Les réactifs et l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Isolement des bactéries liées aux produits laitiers

1. Obtention de cultures bactériennes à partir de produits laitiers liquides ou solides
   1. Sélection des milieux de culture
      1. Pour l’isolement bactérien à partir d’échantillons de produits laitiers, sélectionnez les milieux de culture en fonction des groupes microbiens attendus, y compris les milieux de croissance généraux, les milieux pour les bactéries à Gram négatif, les bactéries lactiques (LAB), les bactéries sporulées, ainsi que les micro-organismes à croissance lente ou fastidieux.
         REMARQUE : Pour maximiser le rétablissement des espèces dominantes et rares, plusieurs milieux doivent être inoculés en parallèle. Le tableau 1 présente un ensemble d’exemples de milieux pour l’analyse du microbiome à partir d’échantillons de produits laitiers.
   2. Inoculation et placage
      1. Obtenez un échantillon représentatif du produit laitier et mélangez soigneusement.
      2. Transvaser aseptiquement 1 mL (échantillons liquides : lait, crème, babeurre) ou 1 g (échantillons solides : fromage, beurre) de l’échantillon dans un tube à centrifuger conique de 15 mL contenant 9 mL de milieu liquide stérile (eau peptonée / solution de NaCl à 0,85 %). Pour les échantillons solides, réchauffez le milieu liquide à 40-42 °C avant d’ajouter l’échantillon.
      3. Homogénéiser l’échantillon en tourbillonnant vigoureusement pendant 30 à 60 s. Pour les échantillons gras ou durs, poursuivre l’homogénéisation jusqu’à l’obtention d’une suspension uniforme.
      4. Préparez une série de dilutions décuplées en prélevant 1 mL de suspension et en le transférant dans des tubes successifs contenant 9 mL de solution stérile. Mélangez bien chaque dilution.
         REMARQUE : Selon le type d’échantillon et le niveau prévu de contamination microbienne, préparer des dilutions allant de ^10-1 à ^10-6. Pour la plupart des échantillons, des dilutions allant jusqu’à ^10-3 seront suffisantes ; Cependant, lors de l’analyse du lait frais ou du fromage bleu, il sera nécessaire de préparer d’autres dilutions. Pour assurer une isolation précise et faciliter la sélection des colonies, la dilution optimale de l’inoculation doit donner de 30 à 300 colonies par plaque. Cette gamme permet une différenciation claire des colonies individuelles et minimise le risque de chevauchement de croissance, facilitant ainsi l’obtention de cultures bactériennes non contaminées et homogènes pour une analyse ultérieure. Pour certains produits laitiers transformés (p. ex., le babeurre), un échantillon frais non dilué (p. ex., 0,1 mL) peut être utilisé pour le placage direct.
      5. Prélever 0,1 mL de l’échantillon ou de sa dilution et transférer à la surface de boîtes de Pétri préalablement préparées contenant le milieu gélosé approprié.
      6. Répartissez uniformément l’inoculum sur la surface de la gélose à l’aide d’un épandeur stérile. Laisser l’inoculum pénétrer dans le milieu pendant 15 min, puis retourner les plaques.
   3. Incubation
      1. Incubation aérobie : pour tous les échantillons étudiés, inoculer des plaques gélosées APT, M-17, CBL, MPCA et TSA, incuber dans des conditions aérobies à 37 °C et 30 °C pendant 24 h. Les températures d’incubation ont été déterminées en fonction des besoins de croissance optimaux de différents groupes microbiens cruciaux pour évaluer à la fois la qualité hygiénique (30 °C pour les mésophiles généraux) et la sécurité pour la santé publique (37 °C pour les agents pathogènes associés à l’homme et les organismes indicateurs) des produits laitiers.
         REMARQUE : Si une croissance intensive de bactéries sporulées est prévue, dans le cas de la TSA, une durée d’incubation plus courte (~12 h) est préférable.
      2. Incubation anaérobie : pour tous les échantillons étudiés, inoculer des plaques de gélose MRS, incuber dans des conditions anaérobies à 37 °C et 30 °C pendant 24 à 72 h, en vérifiant la croissance microbienne tous les jours. Les températures d’incubation ont été déterminées comme mentionné à l’étape 3.1.
         REMARQUE : Les conditions d’incubation anaérobie peuvent être obtenues en plaçant les plaques dans des récipients hermétiques avec des sachets générant une atmosphère anaérobie, qui éliminent l’oxygène et fournissent une atmosphère appropriée pour la croissance des bactéries anaérobies.
   4. Obtention de cultures pures
      1. Après l’incubation, inspectez les plaques et sélectionnez les colonies individuelles cultivées en fonction de leurs caractéristiques morphologiques (p. ex., taille, forme, couleur, texture).
      2. Purifier les colonies sélectionnées en les sous-cultivant (streaking) sur le même milieu gélosé à l’aide d’une boucle microbienne de 1 μL et dans les mêmes conditions d’incubation.

Milieu de culture	Application	État de culture
Gélose tryptique de soja (TSA)	milieu général pour la culture d’un large éventail de bactéries	30–37 °C, 24–48 h, aérobie
Gélose au sang (BLA ; avec 5 % de sang de mouton)	enrichi, différenciation de l’hémolyse, utile pour Streptococcus, Listeria, Bacillus	30–37 °C, 24–48 h, aérobie
Agar MRS (de Man, Rogosa et Sharpe agar)	sélectif pour les Lactobacillus et autres LAB Ajouter 1 % de Tween-80 pour soutenir la croissance de L. casei, L. delbrueckii, L. helveticus ou L. acidophilus.	30 °C, 48–72 h, anaérobie ou microaérophile
Gélose M17	sélectif pour Lactococcus, Streptococcus thermophilus	30 °C, 48–72 h, anaérobie ou microaérophile
Gélose APT (gélose tout usage Tween 80)	sélectif pour les bactéries lactiques et certaines bifidobactéries	30 °C, 48–72 h, anaérobie ou microaérophile
Gélose écharde	isolement sélectif et enrichissant d’anaérobies, dont Bifidobacterium, Clostridium	30–37 °C, 48–72 h, anaérobie
Gélose CBL (agar au lactose bleu de Chine)	milieu différentiel, pour les bactéries coliformes et autres bactéries fermentant le lactose	37 °C, 24–48 h, aérobie
Gélose à numération sur plaque du lait (AAM)	universel, pour le nombre total de bactéries aérobies mésophiles	30–37 °C, 24–48 h, aérobie

Tableau 1 : Liste des milieux suggérés pour l’analyse du microbiome d’échantillons laitiers dans des conditions de culture spécifiées.

2. Préparation des échantillons bactériens pour l’analyse MS

1. Avant de commencer, préparez la solution matricielle MALDI
   REMARQUE : Le composé matriciel le plus couramment utilisé est le HCCA, α-acide cyano-4-hydroxycinnamique. Ce composé est photosensible, alors préparez et stockez la matrice dans des récipients sombres ou à l’abri de la lumière.
   1. Préparez le mélange de solvants en utilisant les proportions suivantes : 50 % d’acétonitrile (grade HPLC), 47,5 % d’eau (grade HPLC) et 2,5 % d’acide trifluoroacétique (TFA).
   2. Dissoudre la matrice dans le mélange de solvants jusqu’à une concentration finale d’environ 10 mg/mL (ou jusqu’à saturation - jusqu’à ce que les cristaux non dissous restent visibles).
   3. Si la solution n’est pas claire (il reste des cristaux), centrifugez-la ou filtrez-la (par exemple, à travers un filtre à seringue de 0,22 μm) pour obtenir un liquide clair.
      REMARQUE : Le stockage au réfrigérateur est autorisé pendant de courtes périodes, à condition d’un faible nombre de cycles de dégivrage.
2. Pour identifier les bactéries à l’aide de la spectrométrie de masse, utilisez l’une des 3 procédures de préparation des échantillons :
   1. Transfert direct de colonie - Utilisez cette méthode la plus simple et la plus rapide lorsque vous avez affaire à des bactéries en bonne croissance et non résistantes à la lyse, telles que la plupart des bactéries à Gram négatif.
      1. À l’aide d’une boucle stérile ou d’un cure-dent, transférez une petite quantité (~1 μL) de la colonie cultivée à un endroit de la plaque MALDI.
      2. Étalez le matériau bactérien directement sur un endroit désigné sur la plaque cible MALDI pour créer une couche mince et uniforme.
      3. Une fois sec, recouvrir la tache de 1 μL de solution matricielle HCCA et laisser sécher à l’air libre à température ambiante.
   2. Extraction à l’acide formique sur cible - À utiliser pour les bactéries difficiles à identifier (par exemple, Gram positif, levures) dont les parois cellulaires rendent difficile la libération de protéines sans traitement supplémentaire.
      1. Prélevez une petite quantité de biomasse bactérienne d’une seule colonie bactérienne à l’aide d’une boucle microbienne jetable ou d’un cure-dent stérile.
      2. Étalez le matériau bactérien directement sur un endroit désigné sur la plaque cible MALDI pour créer une couche mince et uniforme.
      3. Recouvrir la matière bactérienne enduite de 1 μL de solution d’acide formique à 70 % et sécher à l’air libre à température ambiante.
      4. Une fois sec, recouvrir la tache de 1 μL de solution matricielle HCCA et laisser sécher à l’air libre à température ambiante.
   3. Extraction des protéines dans le tube (méthode à l’éthanol et à l’acide formique) - Utilisez cette méthode pour les micro-organismes difficiles à identifier, y compris certaines bactéries à Gram positif, les levures et les mycobactéries.
      1. À l’aide d’une boucle ou d’un écouvillon stérile, transférez 1 à 3 colonies complètes d’une plaque de culture en gélose dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL contenant 300 μL d’eau stérile.
      2. Ajouter 900 μL d’éthanol absolu pour ajuster la concentration finale d’éthanol à environ 75 %. Mélangez ou vortex pendant quelques secondes.
      3. Centrifuger l’échantillon pendant 2 min à 15 000 x g (température ambiante).
      4. Jetez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille cellulaire.
         REMARQUE : Dans le cas de souches muqueuses, une centrifugation supplémentaire à 4 °C est recommandée.
      5. Laissez le tube à granulés ouvert jusqu’à ce que tout l’éthanol résiduel se soit évaporé (5-10 min, température ambiante).
      6. Ajoutez 20 à 50 μL d’acide formique (FA) à 70 % dans la pastille de cellules séchées. Mélanger par pipetage ou vortex jusqu’à ce que la pastille soit complètement remise en suspension.
         REMARQUE : Le volume doit être proportionnel à la quantité de matière biologique.
      7. Ajoutez un volume égal d’acétonitrile (ACN) à la suspension d’acide formique. Mélangez soigneusement.
      8. Centrifugeuse à 15 000 x g pendant 2 min (température ambiante).
      9. Transférez 1 μL de surnageant à un endroit désigné sur une plaque cible MALDI.
      10. Laissez l’endroit sécher complètement à l’air libre à température ambiante.
      11. Recouvrir le point d’échantillon séché de 1 μL de solution matricielle d’acide α-cyano-4-hydroxycinnamique (HCCA).
      12. Laissez la matrice sécher complètement à l’air libre à température ambiante avant l’analyse MS (Figure 1).
          REMARQUE : 70 % Acide formique : Corrosif ; Provoque des brûlures. Poignée dans une hotte. Acétonitrile : Inflammable et toxique. Tenir à l’écart des flammes et éviter l’inhalation/contact. Acide trifluoroacétique (TFA) : Fort, corrosif et volatil ; Évitez le contact avec la peau ou les yeux et l’inhalation. Portez toujours une blouse de laboratoire, des gants résistant aux produits chimiques et des lunettes de sécurité. Manipulez tous les réactifs dans une hotte pour éviter l’inhalation. Éviter le contact avec la peau et les yeux ; Travailler à l’abri des flammes nues. Collectez les déchets de solvants acides et organiques dans des contenants compatibles clairement étiquetés pour une élimination appropriée.

Figure 1 : Arbre de décision qui visualise le processus de sélection d’une procédure de préparation d’échantillon appropriée pour l’identification des isolats bactériens par la technique MS. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Acquisition de spectres et identification microbienne à l’aide de la technique MS

1. Étalonnage
   REMARQUE : Pour une détermination précise de la masse en MS, avant d’analyser des échantillons inconnus, calibrez l’instrument à l’aide d’étalons appropriés. Un bon étalonnage de l’instrument est crucial pour une identification fiable.
   1. Préparer des points d’étalonnage sur la plaque cible MALDI contenant 1 μL de : (a) étalon d’essai bactérien (BTS), contenant un extrait d’Escherichia coli DH5 alpha, couvrant une gamme de masse de 3,6 à 17 kDa (pour MBT Biotyper) ; (b) Calibrateur de microbiologie contenant de l’extrait de protéine E. coli ATCC 25922, de la ribonucléase et de la myoglobine, couvrant une gamme de masse de 3,6 à 17 kDa (pour EXS2600 système). Laisser sécher à l’air libre et recouvrir les points d’étalonnage séchés avec 1 μL de solution de matrice HCCA, similaire à la préparation de l’échantillon.
   2. Chargez dans l’instrument la plaque cible MALDI contenant les échantillons préparés et les points d’étalonnage. Exécutez l’analyse des points d’étalonnage à l’aide du mode d’étalonnage (automatique).
   3. Vérifiez l’étalonnage pour vous assurer que la précision de la masse se situe dans les limites acceptables (100 ppm) sur la plage de masse spécifiée (2-20 kDa).
2. Acquisition de spectres
   REMARQUE : Lorsque l’instrument est étalonné, les spectres de masse de chaque point d’échantillon préparé sont acquis.
   1. Paramètres généraux d’acquisition
      1. Faites fonctionner le spectromètre de masse en mode d’ions positifs linéaires.
      2. Réglez la plage de détection de masse de 2 000 à 20 000 m/z (2 à 20 kDa).
   2. Utilisez les paramètres spécifiques à l’instrument suivants
      1. Tensions des sources d’ions : source d’ions 1 (IS1) à 20 kV, source d’ions 2 (IS2) à 18 kV, tension de lentille à 9 kV. La tension d’accélération peut aller jusqu’à 25 kV.
      2. Tension du détecteur : réglée sur environ 2,65 kV.
      3. Réglages d’extraction d’ions pulsés : 100 ns, temps d’extraction différée fixé à 230 ns.
      4. Réglages de la puissance laser : ajustez manuellement pour obtenir la meilleure qualité de spectre (compte tenu du nombre de signaux et de l’intensité du signal), allant généralement de 40 % à 65 % de la puissance minimale requise.
      5. Nombre de tirs par spectre : acquérez un nombre suffisant de tirs laser à partir de différentes régions de chaque point pour générer une somme de spectres avec un bon rapport signal/bruit (S/N→ (a) une moyenne de 200 tirs, pris en 50 tirs à partir de 4 régions différentes de chaque point ou (b) acquisition en 500 pas de tir - 50 coups à partir de dix positions différentes du point cible à l’aide du mode AutoXecute.
   3. Stratégie de mesure de l’échantillon
      1. Mesurez plusieurs points par isolat (au moins 2 points par isolat).
      2. Acquérir des spectres en répétition pour chaque spot afin d’assurer la cohérence et la précision des résultats → mesurer en double, en visant un certain nombre de spectres totaux par échantillon (4 spectres par échantillon au moins → réplicats techniques).
         REMARQUE : Soumettre des échantillons biologiques (au moins 3) à des répétitions biologiques.

4. Identification des micro-organismes et analyse des données

REMARQUE : L’identification de l’organisme se fait en comparant le profil protéique obtenu (« empreinte » protéique spécifique du micro-organisme) avec une base de données de référence, et la corrélation résultante de la position et de l’intensité du signal est utilisée pour générer une valeur d’appariement, qui décrit le niveau de confiance avec lequel l’organisme étudié a été apparié à son micro-organisme de référence correspondant. Identifier les micro-organismes en comparant les spectres traités aux bases de données de référence.

1. Traitement des spectres
   1. Utiliser un logiciel approprié pour le traitement des spectres : (a) flexAnalysis pour les systèmes de biotyper MALDI ou (b) EX-Accuspec pour les systèmes EXS2600.
   2. Appliquer une méthode Savitzky-Golay comme algorithme de lissage (largeur 2 m/z, 10 cycles).
   3. Effectuez une correction de ligne de base pour supprimer le bruit de fond à l’aide de l’algorithme TopHat (seuil S/N = 2, largeur du filtre TopHat 0,2 Da ).
   4. Utiliser un mode centroïde comme algorithme de détection de pic (seuil S/B = 2 ).
2. Comparaison de bases de données et interprétation des scores
   1. Téléchargez les spectres de masse traités d’isolats inconnus sur la plateforme d’identification microbienne MALDI. Ensuite, exécutez l’identification.
      REMARQUE : Les logiciels suivants ont été utilisés dans ces études : Biotyper version 4.1.100, Ex-Accuspec version V1. Dans le cas du logiciel MALDI Biotyper, la création de spectres principaux (MSP) à partir de spectres bruts est recommandée pour garantir la meilleure fiabilité d’adaptation.
   2. Évaluez les résultats d’identification selon les seuils standard du fabricant.
      REMARQUE : Pour MALDI Biotyper et EXS2600, les valeurs de score sont les suivantes :
      2.300-3.000 : identification très probable de l’espèce ;
      2.000-2.299 : identification sûre du genre, identification probable de l’espèce ;
      1.700-1.999 : identification probable du genre ;
      0,000-1,699 : identification non fiable.
      Au cours de l’évaluation du résultat de l’identification, dérivé de la plateforme MALDI Biotyper, les résultats confirment l’utilisation des catégories de cohérence : A- Espèces Cohérente → meilleure correspondance et toutes les autres correspondances avec une valeur de score tout aussi élevée (>1,999 ) pointent vers la même espèce ; B - Genre Une correspondance cohérente → meilleure correspondance et d’autres correspondances avec des valeurs de score similaires (1,700 - 1,999) pointent vers le même genre, mais peuvent différer au niveau de l’espèce ; C- Non Les exigences → relatives à l’uniformité au niveau de l’espèce ou du genre n’ont pas été respectées.

Résultats

Approche culturomique
L’approche culturomique est une stratégie visant à diversifier au maximum les conditions de culture des micro-organismes afin d’augmenter les chances d’isoler, entre autres, des espèces rares, difficiles à cultiver ou jusqu’alors non décrites¹². Cela permet d’obtenir une image beaucoup plus large de la biodiversité de la microflore présente dans divers échantillons, par exemple des échantillons alimentaires. Une diversité ...

Discussion

Le protocole dédié à l’identification microbienne des produits laitiers offre une avancée importante par rapport aux méthodes traditionnelles en assurant un consensus optimal sur la rapidité, la fiabilité et la rentabilité. Néanmoins, certaines étapes cruciales du protocole nécessitent une attention particulière. Tout d’abord, la phase d’isolement et de culture est fondamentale. Les milieux de culture et les conditions d’incubation doivent correspondre à la diversité et à la charge micro...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
70 % d’acide formique	Chempur	115676307
Acétonitrile	Merck KGaA	1.00014.1011
Agar APT	Merck KGaA	1.10453.0500
Norme de test bactérien	Bruker Daltonik GmbH	8255343
Agar CBL (Agar lactose bleu de Chine)	Merck KGaA	1.02348.0500
Agar de sang de Columbia   ;	Oxoïde	CM0331B
Agar M17
Lag Count Agars (MPCA)	Oxoïde	CM0681
MRS agar (de Man, Rogosa et Sharpe Agar)	Merck KGaA	1.10660.0500
MSP 96 cible l’acier poli BC	Bruker Daltonik GmbH	8280800
Eau à peptons	Sigma-Aldrich	70179
Agar de Scheadler	Sigma-Aldrich	91019
Sang de mouton	Biomaxima	SL0160-100
Acide trifluoroacétique	Sigma-Aldrich	T6508
Agar de soja tryptique (TSA)	Sigma-Aldrich	22091
Eau	Merck KGaA	1.15333.2500
&alpha ;-Cyano-4-hydroxycinnamique	Bruker Daltonik GmbH	8201344