Article de méthode

Préparation d’échantillons pour les études métabolomiques par spectrométrie de masse sur cellule unique : lavage, trempe, séchage et stockage combinés des cellules

DOI :

10.3791/68995

⸱

16 septembre 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Oklahoma, 2Department of Biochemistry and Physiology, University of Oklahoma Health Sciences Center

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole vise à préserver les métabolites cellulaires pour la spectrométrie de masse sur cellule unique (SCMS) en combinant le lavage en solution de sel volatil, l’extinction rapide de l’azote liquide, la lyophilisation et le stockage à -8 °C. Il démontre que l’extinction de l’azote liquide est essentielle pour maintenir les profils de métabolites, tandis que le stockage prolongé au froid doit être minimisé pour prévenir les altérations métaboliques.

Résumé

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La spectrométrie de masse unicellulaire (SCMS) est devenue un outil indispensable pour étudier le métabolisme cellulaire. En raison des progrès des techniques modernes de spectrométrie de masse (MS) et de la demande d’études de l’hétérogénéité cellulaire dans les sciences biologiques fondamentales et les maladies humaines, une variété de techniques SCMS différentes ont été développées et appliquées dans la recherche en laboratoire. Comme les métabolites peuvent refléter avec précision l’état des cellules, l’analyse métabolomique SCMS des cellules vivantes est considérée comme un outil puissant pour fournir des informations moléculaires sur les cellules. Cependant, l’un des principaux défis de l’analyse SCMS des cellules vivantes est de préserver les profils de métabolites endogènes lors de la préparation, du transport et de la mesure des échantillons. Les métabolites cellulaires subissent un renouvellement rapide et sont très sensibles aux changements environnementaux, ce qui les rend susceptibles d’être dégradés ou transformés avant l’analyse. Pour remédier à cette limitation, nous présentons un protocole de préparation cellulaire robuste et reproductible conçu pour préserver l’intégrité des métabolites cellulaires pour le SCMS. Le protocole intègre le lavage des cellules avec une solution de formiate d’ammonium volatil (AF), la trempe rapide à l’azote liquide (LN2), la lyophilisation sous vide et le stockage à -80 °C. Cette approche minimise les dommages à la membrane cellulaire tout en arrêtant efficacement l’activité métabolique. Les résultats indiquent qu’une extinction rapide des cellules est vitale ; cependant, limiter le temps de stockage à -80 °C est nécessaire pour préserver les métabolites cellulaires. Le protocole proposé peut potentiellement être utilisé pour d’autres techniques SCMS existantes pour de larges applications.

Introduction

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L’hétérogénéité de cellule à cellule est devenue un principe fondamental des systèmes biologiques, en particulier dans les contextes de progression de la maladie, de résistance aux médicaments et de différenciation cellulaire 1,2. Dans les organismes multicellulaires, même des cellules génétiquement identiques dans le même microenvironnement peuvent présenter des phénotypes distincts, résultant de différences aux niveaux transcriptomique3, protéomique4 et, surtout, métabolomique5. Alors que la génomique et la transcriptomique unicellulaires ont gagné en popularité au cours de la dernière décennie, la métabolomique unicellulaire reste relativement sous-développée en raison de la complexité inhérente et de la dynamique rapide des métabolites6. Les métabolites sont très sensibles aux signaux environnementaux, ont des structures chimiques et des polarités diverses7 et existent à de faibles concentrations dans de petits volumes cellulaires8. Ces propriétés rendent leur mesure fiable à partir de cellules individuelles un défi analytique. Comme la métabolomique offre l’instantané le plus proche de l’état fonctionnel en temps réel d’une cellule, il est essentiel de faire progresser les méthodes permettant d’étudier de manière robuste le métabolome à la résolution d’une seule cellule pour une compréhension plus approfondie de la physiologie et de la pathologie cellulaires7.

Les techniques traditionnelles de métabolomique en vrac font la moyenne des signaux sur de grandes populations cellulaires, masquant l’hétérogénéité cellulaire et obscurcissant potentiellement des signatures métaboliques rares mais significatives. En revanche, la métabolomique unicellulaire révèle des profils biochimiques uniques au niveau des cellules individuelles, ce qui la rend inestimable pour l’étude de processus tels que la différenciation des cellules souches, les réponses aux médicaments et les mécanismes pathologiques 6,9,10,11,12,13. Les méthodes basées sur la spectrométrie de masse (MS), telles que la désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI) MS et la MS d’ions secondaires (SI), ont fait progresser le domaine mais sont confrontées à des défis tels que la préparation complexe, les exigences de vide et l’ionisation destructrice qui limitent l’analyse des cellules vivantes 9,14. En particulier, les développements récents dans le domaine de l’instrumentation ont abouti à des techniques de pointe, notamment le MALDI en mode de transmission couplé à la postionisation induite par laser (t-MALDI-215) et la spectrométrie de masse d’ions secondaires Orbitrap (OrbiSIMS)16,17, qui a permis d’obtenir une imagerie métabolique 3D haute résolution sans marquage au niveau de la cellule unique et subcellulaire, offrant une précision de masse et une résolution spatiale exceptionnelles.

La spectrométrie de masse à ionisation ambiante résout ces problèmes. Les techniques SCMS ambiantes représentatives comprennent la spectrométrie de masse vidéo à cellule unique en direct (Video-MS)18, DESI19 et nano-DESI20. Parmi elles, le SCMS à sonde unique est l’une des techniques qui se distingue par sa capacité à échantillonner et ioniser directement des cellules vivantes en temps réel à l’aide d’un système à double capillaire 21,22,23,24. Cette technique minimise les perturbations de l’échantillon tout en permettant un profilage métabolique in situ à haute résolution et a été appliquée avec succès à des études sur l’absorption et l’influence des médicaments sur le métabolisme cellulaire 22,25,26,27,28,29,30, les réponses environnementales31,32 et l’hétérogénéité métabolique33, 34,35,36 parmi les cellules individuelles.

Bien que de nombreuses méthodes SCMS ambiantes permettent l’analyse de cellules vivantes, elles souffrent généralement d’un faible débit en raison de la manipulation manuelle requise pour la sélection de cellules individuelles 23,37,38. Étant donné que le métabolisme cellulaire est très dynamique, une préparation prolongée des échantillons peut modifier les profils de métabolites. Pour résoudre ce problème, les chercheurs appliquent des techniques d’extinction immédiatement après avoir isolé les cellules39,40. L’extinction stoppe l’activité métabolique soit par refroidissement rapide 41,42,43,44, soit par dénaturation enzymatique 43,45,46,47, préservant ainsi l’état biochimique des cellules à un moment précis. Cette étape est essentielle pour garantir des données métabolomiques précises et pertinentes dans le temps. Un protocole d’extinction efficace doit arrêter rapidement et complètement l’activité métabolique intracellulaire. Diverses méthodes ont été évaluées, notamment la solution saline isotonique froide48, l’acétonitrile46 réfrigéré, le méthanol froid 44,47,48,49, la solution tampon de phosphate glacée (PBS)43,50, le LN2 43,44,51, et même les traitements à l’air chaud 52. Alors que beaucoup d’entre eux ont été développés à l’origine pour la métabolomique à cellules en vrac, certains, comme le méthanol froid et l’acétonitrile, ont été adaptés pour des techniques unicellulaires telles que Pico-ESI-MS39 et MALDI-MS46. Malgré leur efficacité, chaque méthode présente des inconvénients : les solvants organiques peuvent provoquer des fuites de métabolites et endommager les membranes cellulaires48,53, et les solutions salines non volatiles peuvent interférer avec la SEP en provoquant une suppression des ions54, en réduisant la sensibilité et en compromettant la précision des données47,55.

La congélation instantanée LN2 est couramment utilisée dans la recherche biologique56 car elle arrête rapidement le métabolisme cellulaire sans laisser de sels non volatils, ce qui en fait un bon choix pour la SCMS. Cependant, il peut endommager les membranes cellulaires, ce qui est problématique pour SCMS57,58. Pour réduire ces dommages, certaines études ont utilisé une méthode impliquant une filtration rapide, un lavage à froid du NaCl et la congélation du LN2, qui aide à retenir les métabolites à rotation rapide53,59. Pourtant, cette méthode n’est pas idéale pour le SCMS en raison des difficultés à isoler les cellules individuelles et des effets matriciels potentiels des résidus de sel. Le stockage à -80 °C est une autre méthode de conservation courante, mais ses effets sur les profils de métabolites unicellulaires restent incertains. Nous avons déjà présenté des études visant à remédier à ces limites en combinant plusieurs étapes clés : les cellules sont d’abord lavées avec une solution AF volatile compatible MS, puis trempées avec du LN2, lyophilisées sous vide et stockées à basse température (-80 °C)60. L’approche actuelle minimise les dommages cellulaires et la dégradation des métabolites, ce qui permet des mesures SCMS plus précises. Ce travail est axé sur les détails expérimentaux, visant à promouvoir l’adoption de cette méthode de préparation cellulaire pour les techniques SCMS robustes.

Protocole

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Effectuez chaque étape à l’intérieur d’un laboratoire de biosécurité certifié de classe II et dans des conditions stériles. Dans cette étude, la lignée cellulaire HCT-116 a été utilisée comme système modèle, et les cellules ont été cultivées dans un milieu de culture complet. Les régents et l’équipement utilisé sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Culture cellulaire

  1. Préparez le milieu complet. Complétez le milieu McCoy’s 5A avec 10 % de sérum de bovin fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine. Réchauffez-le à 37 °C.
  2. Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2. Surveillez la confluence quotidiennement et le passage lorsque les cultures atteignent ~80 % de confluence.
  3. Passage des cellules (tous les ~2 jours).
    1. Aspirez le milieu et rincez une fois avec 5 ml de 1x PBS.
    2. Ajouter 2 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % dans la boîte de culture et incuber à 37 °C pendant 3 minutes pour faciliter le détachement des cellules.
    3. Neutralisez la trypsine en ajoutant 8 ml de milieu complet préchauffé et en pipetant doucement pour disperser les cellules.
    4. Transférer 1 mL de suspension dans 9 mL de milieu complet frais.
    5. Comptez les cellules.
      REMARQUE : Les cellules ont été comptées à l’aide d’un compteur de cellules automatisé TC20 conformément aux instructions du fabricant. Le bleu de trypan ou d’autres colorants n’ont pas été utilisés.
  4. Cellules de semence sur les lamelles.
    1. Diluer les cellules à une concentration finale de ~1 × 106 cellules/mL.
    2. Placez les lamelles individuelles en verre de 18 mm dans les puits d’une plaque à 12 puits.
      REMARQUE : Les lamelles en verre doivent être autoclavées avant d’être utilisées pour la culture cellulaire.
    3. Ajouter 2 mL du milieu complet et 200 μL de suspension cellulaire (~2 × 105 cellules/puits).
    4. Incuber les cellules pendant la nuit pour permettre la fixation des cellules.
      REMARQUE : Pour vous assurer que les cellules sont dans un état de croissance normal, vérifiez régulièrement la morphologie des cellules et leur état de croissance (à l’aide d’un microscope) et examinez la contamination potentielle par les mycoplasmes (à l’aide d’une trousse de détection de mycoplasmes).

2. Lavage cellulaire avec une solution de formiate d’ammonium (AF)

REMARQUE : Préparez une solution fraîche de FA à chaque fois.

  1. Préparez le tampon de lavage AF. Peser 0,45 g de formiate d’ammonium et dissoudre dans 50 mL d’eau de qualité LC/MS. La concentration finale de formiate d’ammonium est de 0,14 M (0,9 % p/p).
    REMARQUE : Conservez la solution glacée (0-4 °C) jusqu’à utilisation.
  2. Ajouter 2 mL de solution AF froide dans chaque puits de la plaque à 12 puits.
  3. Rincez les lamelles. À l’aide d’une paire de pinces stériles, soulevez doucement chaque lamelle contenant des cellules adhérentes de son puits, puis placez-la brièvement (pendant 2 à 3 s) dans un puits séparé prérempli de 2 ml de solution froide de formiate d’ammonium à 0,9 % (FA). Répétez le processus de rinçage.
    REMARQUE : Pour éviter de déranger les cellules pendant l’étape de lavage, effectuez un rinçage très doux.

3. Trempe cellulaire par azote liquide (LN2)

  1. Placez chaque lamelle rincée AF (cellules vers le haut) dans la boîte de Pétri à l’intérieur du récipient en papier d’aluminium.
    REMARQUE : Portez des gants cryogéniques, des lunettes de sécurité et une blouse de laboratoire. Effectuez toutes les manipulations LN2 dans un endroit bien ventilé. Le papier d’aluminium peut être utilisé pour plier un récipient pour la trempe LN2 .
  2. Versez lentement 10 à 20 ml d’azote liquide sur les lamelles, en assurant une couverture complète.
  3. Inclinez immédiatement la boîte de Pétri à l’aide d’une pince à épiler pour décanter l’azote liquide restant.
    REMARQUE : Complétez cette action en quelques secondes pour éviter la formation de gros cristaux de glace due à l’humidité résiduelle du lavage.

4. Lyophilisation cellulaire sous vide

  1. Lyophiliser immédiatement après la trempe LN2 pour éviter la décongélation.
    REMARQUE : Retirez le rotor du SpeedVac pour créer une plate-forme plate pouvant accueillir une boîte de Pétri de 100 mm.
  2. À l’aide de gants cryogéniques et d’une pince à épiler isolée, placez la boîte de Pétri contenant les lamelles réfrigérées LN2 sur la chambre du concentrateur sous vide.
  3. Traitez à l’aide de ses réglages de vide standard et continuez pendant 5 à 7 minutes jusqu’à ce que le LN2 visible se soit évaporé et que les lamelles semblent sèches. Les lamelles séchées ne doivent pas contenir de LN2 résiduel ni de cristaux de glace.

5. Stockage des cellules dans un congélateur à -80 °C

  1. Enveloppez le récipient avec une serviette en papier et transférez-le dans un congélateur à -80 °C pendant 48 h.
  2. Après l’entreposage, transférez immédiatement les lamelles contenant la boîte de Pétri dans un dessiccateur à température ambiante pendant ~10 min. Assurez-vous que le givre condensé ou l’eau sur les lamelles disparaît complètement avant de les sortir du dessiccateur.
    REMARQUE : Le transfert rapide des lamelles vers le dessiccateur minimise la condensation ; Même un mouillage mineur de la surface peut dissoudre les métabolites séchés.
  3. Après le lavage AF, divisez les échantillons en deux groupes (groupe 1 et groupe 2). Appliquez les protocoles de traitement suivants.
    Groupe 1 : trempe LN2 → lyophilisation → analyse SCMS (pas de stockage).
    Groupe 2 : trempe LN2 → lyophilisation → stockage à −80 °C 48 h → analyse SCMS.
  4. Procédez à l’analyse SCMS comme décrit ci-dessous.
    REMARQUE : D’autres groupes de cellules peuvent être préparés à l’aide de différentes conditions. Les groupes 1 et 2 sont utilisés pour illustrer les protocoles généraux.

6. Fabrication d’une sonde unique et configuration SCMS

REMARQUE : La sonde unique est fabriquée conformément aux procédures établies 21,24,60,61, et seuls de brefs protocoles sont fournis ici.

  1. Tirez l’aiguille à quartz à double alésage à l’aide d’un extracteur laser et générez une pointe de ~10 μm. Assemblez une sonde unique en insérant le capillaire de silice fondue et l’émetteur nano-ESI dans l’aiguille de quartz à double alésage. Fixez tous les composants à une lame de verre avec de l’époxy à prise rapide.
  2. Montez la sonde simple sur la platine XYZ. Fixez la sonde unique à un manipulateur XYZ motorisé placé sous un microscope numérique.
  3. Couplez l’installation à un spectromètre de masse pour l’analyse SCMS.
  4. Utiliser de l’acétonitrile (≥99,9 %) contenant 0,1 % d’acide formique comme solvant d’extraction à un débit de 150 nL/min délivré par une pompe à seringue.
  5. Définissez les paramètres MS.
    Mode ions positifs : m/z 200-1500, +2,9 kV, résolution de masse 120 k (à m/z 200).
    Mode ions négatifs : m/z 70-900, −2,1 kV, résolution de masse 120 k (à m/z 200).
    REMARQUE : Étant donné que les ions négatifs sont généralement détectés dans la plage m/z inférieure à celle des ions positifs, différentes plages m/z peuvent être utilisées pour ces deux modes ioniques. Les paramètres MS supplémentaires incluent un temps d’injection maximal de 100 ms, un microbalayage, un contrôle automatique de gain (AGC) standard, un mode de balayage complet (pour l’analyse MS), une dissociation collisionnelle à plus haute énergie (HCD) (pour l’analyse MS/MS) avec une énergie de collision normalisée (NCE) de 10 à 35 et une température de 320 °C pour la température du tube de transfert d’ions. Un chromatogramme ionique total (TIC) a été généré à chaque point de balayage/temps pour surveiller la stabilité du signal et la détection d’une seule cellule.

7. Expériences SCMS à sonde unique

  1. Placez les deux lamelles (groupe 1 et groupe 2) ensemble sur la platine XYZ motorisée de la configuration SCMS à sonde unique 21,24,61.
  2. Pour minimiser les effets de lot, sélectionnez les cellules au hasard au microscope.
  3. Acquisition de spectres de masse en mode ions positifs et négatifs. Analysez plusieurs cellules (par exemple, ~30) par groupe avec la même sonde unique, le même débit de solvant et la même tension d’ionisation.
    REMARQUE : Utilisez les mêmes tensions de sonde unique, de débit de solvant et d’ionisation pour chaque expérience afin de garantir la comparabilité des données. Calibrez l’Orbitrap quotidiennement avant l’acquisition. Les analyses MS et MS/MS peuvent être effectuées au niveau de la cellule unique. Collecter des données MS afin d’obtenir des valeurs m/z précises pour l’étude des profils de métabolites et des étiquettes provisoires dans le cadre d’analyses non ciblées. Effectuer des analyses MS/MS d’ions sélectionnés pour l’identification moléculaire dans le cadre d’une analyse ciblée. Les données ont été acquises à l’aide d’un logiciel d’acquisition et d’interprétation compatible.

8. Analyse des données

  1. Prétraitez les données SCMS brutes à l’aide d’un script R personnalisé. Les étapes de prétraitement comprennent l’élimination de l’arrière-plan et du bruit et la normalisation de l’intensité ionique selon TIC 11,12,23.
  2. Désisotopez les données SCMS à l’aide du package Python ms_deisotope.
  3. Effectuez l’alignement des pics à l’aide d’un script Python60 interne. Utilisez une largeur de bac de 0,01 m/z pour le binning. Utilisez une tolérance de masse de 0,01 m/z ou 5 ppm pour l’alignement des pics.
  4. Effectuez une analyse statistique des données à l’aide de MetaboAnalyst 6.062. Effectuez un test t et générez une carte thermique (pour les niveaux relatifs de métabolites). Sélectionnez Utiliser les 100 premiers métabolites du test T/ANOVA pour générer les 100 principaux métabolites, classés par valeurs p de faible à élevée, avec une différence significative (p < 0,05) par rapport à la comparaison. Tracez une carte thermique à l’aide de ces 100 principaux métabolites.
  5. Recherchez des valeurs m/z précises et des spectres MS/MS dans la base de données sur le métabolome humain (HMDB63). Utilisez une tolérance de masse de 10 ppm dans la recherche dans la base de données MS.
    REMARQUE : D’autres bases de données, telles que LipidMaps64, peuvent être utilisées pour la recherche dans les bases de données.

Résultats

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Ce rapport décrit une méthodologie qui intègre le lavage des cellules, la trempe rapide des cellules, le séchage sous vide et le stockage à -80 °C (Figure 1). Plus précisément, cette approche est conçue pour préserver l’état métabolomique des cellules avant l’analyse SCMS. L’efficacité de ce protocole a été testée en préparant des cellules dans deux conditions différentes : des cellules fraîchement trempées et séchées (groupe 1, servant de contrôle), et des cellules trempées, séchées et stockées à -80 °C (groupe 2). Chaque groupe a été analysé à l’aide de la méthode SCMS à sonde unique en modes ions positifs et négatifs. L’analyse en composantes principales (ACP) et la visualisation de la carte thermique ont été utilisées pour évaluer les différences dans les profils métabolomiques entre les groupes.

Les résultats de l’ACP en mode ionique positif (figure 2A) ont révélé que les groupes 1 et 2 avaient des profils globaux de métabolites similaires. Les profils presque identiques du groupe 1 et du groupe 2 montrent que le stockage à -80 °C pendant 48 h n’altère pas significativement le métabolome si les cellules sont correctement trempées avant le séchage. Dans le mode d’ions négatifs (figure 2B), un schéma comparable est observé, bien que le groupe 2 semble légèrement plus distinct, peut-être en raison de différences d’ionisation entre des classes de métabolites spécifiques, par exemple, les phosphatidylcholines sont mieux détectées en mode positif, tandis que les acides gras s’ionisent plus efficacement en mode négatif60. Malgré cette variation, le regroupement cohérent entre les groupes 1 et 2 dans les deux modes soutient la conclusion que le protocole intégré de trempe-séchage-stockage maintient l’intégrité métabolique.

L’analyse de la carte thermique a permis de valider les résultats de l’ACP en décrivant l’abondance relative des 100 principaux métabolites dans deux groupes. Comme le montre la figure 3, les 100 principaux métabolites présentent des profils d’abondance très cohérents entre le groupe 1 et le groupe 2 dans les deux modes ioniques. Aucun changement majeur ou regroupement spécifique à un groupe n’est observé, bien que des variations mineures dans quelques groupes de métabolites puissent refléter des différences dans l’efficacité de l’ionisation ou la stabilité des métabolites. Ces résultats démontrent collectivement que le flux de travail trempe-séchage-stockage préserve les profils métabolomiques cellulaires avec une grande fidélité, ce qui le rend bien adapté aux applications SCMS ambiantes.

figure-results-1
Figure 1 : Flux de travail général pour l’analyse par spectrométrie de masse à cellule unique (SCMS) portant sur la façon dont l’extinction du LN2 et le stockage de 48 heures à -80 °C affectent les profils de métabolites dans les cellules uniques. (A) Les cellules ont été ensemencées, incubées et rincées à l’aide d’une solution au format ammonium (AF). (B) Deux groupes de cellules ont été préparés : le groupe 1 : les cellules ont été lavées, trempées et lyophilisées pour des expériences SCMS immédiates sans stockage ; Groupe 2 : les cellules ont été lavées, trempées, lyophilisées et stockées à -80 °C. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Analyse en composantes principales (ACP) des données SCMS des cellules HCT-116 dans des groupes expérimentaux en (A) mode d’ions positifs et (B) en mode d’ions négatifs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Cartes thermiques montrant les niveaux relatifs des 100 principaux métabolites détectés dans des cellules HCT-116 individuelles préparées dans diverses conditions, présentées pour (A) le mode d’ions positifs et (B) le mode d’ions négatifs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

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Une étape critique de ce protocole est l’extinction immédiate des cellules vivantes à l’aide de LN2 après lavage avec AF, ce qui réduit considérablement l’activité enzymatique et arrête les processus métaboliques en cours. De plus, le lavage des cellules avec AF avant l’extinction a amélioré l’intensité ionique et réduit les effets de matrice, soutenant son inclusion en tant qu’étape préparatoire pour améliorer la sensibilité du SCMS. Dans les études actuelles, des cellules de différents groupes (c.-à-d. les groupes 1 et 2) ont été cultivées à l’aide du même lot initial afin de minimiser leur variance biologique. Une période d’entreposage de 48 h a été choisie parce que les cellules ayant un temps de croissance supplémentaire (groupe 1) peuvent encore maintenir des densités cellulaires appropriées (p. ex., pour éviter les agrégats cellulaires) pour l’analyse SCMS comparative avec les cellules stockées (groupe 2). Cependant, la prudence est de mise lorsqu’on s’y fie lorsqu’on s’y fie à l’entreposage frigorifique, même pendant 48 heures, car des changements métaboliques importants ont tout de même été observés dans les comparaisons entre les échantillons fraîchement séchés et entreposés (groupe 1 c. Groupe 2). Bien que dans les études réelles, les échantillons de cellules et de tissus soient généralement conservés pendant de longues périodes (p. ex., des semaines et des mois) dans un congélateur à -80 °C, il est suggéré de raccourcir la durée de conservation afin de minimiser les changements dans les métabolites.

Le dépannage doit donc se concentrer sur la minimisation du temps entre le séchage et l’analyse SCMS, en veillant à ce que les conditions de dégivrage évitent la condensation ou la réhydratation partielle. La teneur en eau résiduelle et la condensation de l’eau pendant les transitions d’échantillon peuvent réhydrater partiellement les cellules et permettre des réactions enzymatiques et chimiques telles que l’hydrolyse, l’oxydation et la protéolyse qui dégradent les métabolites65, entraînant des modifications artificielles de la composition des métabolites. Des échantillons soigneusement séchés arrêtent efficacement ces processus et préservent l’intégrité moléculaire66. Il est essentiel d’assurer un environnement de dessiccation exempt d’humidité et une transition rapide vers le SCMS pour éviter ces pièges.

Malgré le succès de cette méthode dans la préservation des profils de métabolites, des limites subsistent. La méthode nécessite l’accès à un système de séchage sous vide et à un congélateur à -80 °C, et elle n’est pas pleinement efficace pour le stockage à long terme. De plus, si le séchage rapide à température ambiante préserve temporairement les métabolites, il ne remplace pas la trempe LN2 . Des modifications liées à l’entreposage peuvent encore se produire en raison d’une élimination incomplète de l’eau et du risque de réhydratation pendant la manipulation des échantillons. Ces limitations soulignent la nécessité d’affiner la méthode si l’on souhaite un stockage plus long ou un débit plus élevé.

Les protocoles rapportés dans ce travail offrent une approche simplifiée et efficace pour préserver le métabolome unicellulaire pour le SCMS ambiant. Contrairement aux méthodes nécessitant des cryoprotecteurs élaborés ou une congélation in situ, notre flux de travail est facilement compatible avec les techniques d’ionisation ambiante existantes et permet des délais d’échantillonnage et d’analyse flexibles. L’intégration du lavage de cellules, de la trempe, du séchage et du stockage à court terme sans perte substantielle de fidélité métabolomique offre une solution pratique pour les laboratoires qui n’ont pas d’accès à la demande aux spectromètres de masse. Cette approche présente un fort potentiel pour faire progresser la recherche en biologie des systèmes unicellulaires, en métabolisme du cancer, en hétérogénéité de la réponse aux médicaments et en phénotypage métabolique de populations cellulaires rares. La large applicabilité de ces protocoles, en particulier pour les plates-formes SCMS basées sur l’ionisation ambiante, en fait une contribution importante au domaine des techniques analytiques unicellulaires. Dans les études futures, ces protocoles pourront être adaptés et affinés pour s’adapter à une plus grande variété de types de cellules. Avec des étapes supplémentaires de préparation des échantillons (par exemple, l’application de matrice), les cellules traitées peuvent potentiellement être analysées par d’autres techniques SCMS (par exemple, MALDI et SIMS), offrant une résolution spatiale et un débit plus élevés pour l’analyse d’un plus grand nombre de cellules (par exemple, des cellules très confluentes). Les résultats suggèrent également que ces protocoles de trempe-séchage-stockage peuvent potentiellement être utilisés pour préparer les cellules pour l’expédition (par exemple, dans des conteneurs de glace sèche), permettant des études SCMS collaboratives à différents endroits.

Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

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Cette étude a été soutenue par la National Science Foundation (2305182), les National Institutes of Health (1R01AI177469) et la Chan Zuckerberg Initiative. La figure 1 a été créée dans BioRender (https://BioRender.com/yqn5isk).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
-80 ° ; Congélateur CEppendorf (Nouveau-Brunswick)U700Préparation des échantillons
AcétontrileThermoFisher Scientific240744Configuration de l’expérience SCMS
Formiate d’ammonium ThermoFisher Scientific401152500Préparation des échantillons
Lamelle 18 mmMicro verre de protection VMR48380046Culture cellulaire
Stéréomicroscope numériqueShenzhen D& Cie FSupereyes T004Analyse
Tube en quartz à double alésage, 1.120"x0.005"x12 »Friedrich & Dimmock, Inc.MBT-005-020-2QFabrication d’une sonde unique
Résine époxyDevconRéf. 20945Fabrication d’une sonde unique
Acide méthanoïqueLa science de Ward 470301-120 500mLConfiguration de l’expérience SCMS
Capillaire en silice fondue, ID : 40 & micro ; m, OD : 100 et micro ; mPolymicro TechnologiesTSP040105Fabrication d’une sonde unique
Capillaire en silice fondue, ID : 50 & micro ; m, OD : 150 & micro ; mPolymicro Technologies1068150015Configuration de l’expérience SCMS
Lamelles en verre, 18 mmVWR 48380046Culture cellulaire
Sérum synthétique HyClone (FBS)HycloneSH3006603Culture cellulaire
Incubateur HeraCell (Heraeus)Culture cellulaire
Extracteur laserSutter Instrument Co.Modèle P-2000Fabrication d’une sonde unique
Lampe UV LEDÉquipement dentaire Foshan Liang YaLY-C240Fabrication d’une sonde unique
Le 5A de McCoy Gibco 2537128Culture cellulaire
Micro-unionIDEX Santé & Science LLCM-539Configuration de l’expérience SCMS
Interface FAIMS pro modifiée Thermo Fisher 98100-20046Analyse
Kit de détection de mycoplasmes MycoAlert PLUSLonzaRéf. LT07-703Culture cellulaire
Carte optique Thorlabs Inc., NewtonAnalyse
Eau de qualité Optima LC/MS (Fisher Chemical, États-Unis)ThermoFisher ScientificW6500Préparation des échantillons
Spectromètre de masse Orbitrap Exploris 240 ThermoFisher ScientificConfiguration de l’expérience SCMS
Pénicilline/streptomycineGibco15140-122Culture cellulaire
Saline tamponnée au phosphate (PBS)VWR0780-50LCulture cellulaire
Concentrateur SpeedVac (Savant)ThermoFisher Scientific SPD111 VPréparation des échantillons
Pousse-seringue (SKE10)Chemyx Inc.80561Configuration de l’expérience SCMS
Seringue, 250 & micro ; LHamilton1725LTN250ULConfiguration de l’expérience SCMS
Compteur de cellules automatisé TC20Laboratoires Bio-Rad 1450102EDUNumération cellulaire
Plat de culture tissulaire, 100 mmFisher scientifique FB012924Culture cellulaire
Trypsine-EDTAThermoFisher Scientific25200-072Culture cellulaire
Microscope numérique USB (Zoom « Scorpio » 500)Chinavasion, Wholesale Ltd.Analyse
Résine à durcissement UVPrime DentalN° d’article 006.030Fabrication d’une sonde unique
Logiciel XcaliburThermoFisher Scientific
Étage XYZ (CONEX- MFACC)Newport Corp.Analyse

Références

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