Induction de précision et distinction des réflexes de toux et d’éternuement chez la souris

Résumé

Cette étude a établi des modèles de toux et d’éternuements chez la souris en appliquant des stimuli spécifiques à la trachée et à la cavité nasale, et a développé une méthode audio pour distinguer la toux et les éternuements chez la souris en analysant les différences dans leurs signaux acoustiques.

Résumé

La toux et les éternuements, en tant que réflexes défensifs respiratoires vitaux, ont vu la recherche sur leurs mécanismes limitée par la stimulation non spécifique inhérente aux modèles traditionnels. Les méthodes existantes, telles que la capsaïcine ou la nébulisation à l’acide citrique, peuvent activer simultanément la toux (médiée par les fibres trachéales C) et les éternuements (médiés par les nerfs trijumeaux nasaux), conduisant à des observations comportementales confondantes. Bien que des études antérieures aient tenté de distinguer la toux et les éternuements en analysant les schémas respiratoires ou les signatures acoustiques, ces études manquent de modèles capables de stimuler spécifiquement la trachée et la cavité nasale. Ici, nous avons développé un modèle murin utilisant une stimulation spécifique au site de la trachée (pour induire la toux) et de la cavité nasale (pour déclencher l’éternuement). À l’aide d’enregistrements multimodaux synchronisés, de pléthysmographie corps entier (WBP), de microphones à ultrasons à large bande (0-250 kHz) et de vidéographie à haute vitesse (160 fps), nous avons quantifié les signatures physiologiques distinctes de la toux et des éternuements. Nos résultats ont révélé que la toux et les éternuements présentent tous deux des schémas respiratoires à un ou deux pics, avec des différences significatives dans la composition de leurs spectres de fréquences audio. En construisant un système de coordonnées basé sur des caractéristiques audio, nous avons pu distinguer efficacement la toux et les éternuements, en les cartographiant à différents quadrants de l’axe des coordonnées. Cette étude, par le biais d’une stimulation anatomiquement spécifique et d’une analyse des caractéristiques acoustiques, a établi un modèle murin capable de distinguer quantitativement la toux et les éternuements, fournissant une méthode expérimentale de haute précision pour l’étude des réflexes de défense des voies respiratoires et le développement thérapeutique ciblé.

Introduction

La toux et les éternuements sont des réflexes défensifs cruciaux pour que le corps élimine les substances étrangères des voies respiratoires, et des anomalies dans ses voies neuronales connexes déclenchent souvent des maladies chroniques, telles que la toux chronique et la rhinite. Les deux réflexes impliquent une phase inspiratoire, une phase compressive et une phase expiratoire ^1,2. Le réflexe de toux est principalement médié par les neurones sensoriels des voies respiratoires innervés par le nerf vague ^3,4,5. Les neurones vagues reçoivent des stimuli mécaniques, chimiques ou électriques des voies respiratoires et transmettent les signaux au noyau tractus solitarius (NTS) dans le bulbe rachidien⁶. Le NTS intègre ces informations et les projette ensuite vers les centres respiratoires de la moelle épinière et du pont⁷. Ces centres coordonnent finalement les groupes de muscles respiratoires pertinents (tels que le diaphragme, les muscles intercostaux et les muscles laryngés) pour exécuter l’action de la toux, expulsant les irritants potentiellement nocifs et le mucus des voies respiratoires à travers la cavité buccale ^8,9,10. Le réflexe d’éternuement est principalement médié par les neurones sensoriels nasaux du ganglion trijumeau^11,12. Leurs stimuli mécaniques ou chimiques sont transmis au noyau du trijumeau spinal (SP5), qui relaie ensuite l’information aux centres respiratoires 13,14,15,16. Ces centres régulent les muscles pertinents (tels que les muscles respiratoires, les muscles palatins et les muscles faciaux) pour initier un éternuement¹⁷. Le puissant souffle expiratoire de l’éternuement force la majeure partie de l’air à sortir par le nez pour expulser les irritants ^9,18. La recherche sur la toux et les éternuements aide non seulement à élucider les mécanismes neuronaux de la défense respiratoire, mais fournit également des cibles thérapeutiques pour la toux chronique et la rhinite. À cette fin, il est primordial d’établir un modèle animal robuste et fiable.

Au cours des dernières années, les souris sont devenues un organisme modèle pivot pour l’étude des voies neuronales de la toux et des éternuements 19,20,21. La méthodologie actuelle prédominante consiste toujours à induire ces comportements réflexes par l’inhalation de composés stimulants en aérosol ^8,20,22. Une limitation importante de cette approche par inhalation est que les stimuli agissent simultanément sur la cavité nasale et la trachée, activant de manière non spécifique les systèmes afférents sensoriels distincts médiant l’éternuement (via la voie trijumeau) et la toux (via la voie vagale). Cela pose un défi substantiel pour la différenciation précise du type de comportement induit dans les expériences. Cette divergence est évidente dans la littérature : certaines études définissent les réflexes respiratoires induits par la capsaïcine chez la souris comme des éternuements²¹, tandis que d’autres rapportent que ces réflexes englobent à la fois les composants de la toux et des éternuements ^8,22.

Pour relever ce défi, des méthodologies avancées ont été développées, notamment l’analyse des schémas et des trajectoires respiratoires pour classer les comportements réflexes distincts⁸. Une autre étude démontre que la toux et les éternuements présentent des différences marquées dans les caractéristiques temporelles et spectrales, telles que la durée, la modulation de fréquence²². Leurs travaux ont mis en évidence que la toux présente une concentration d’énergie dans des plages de fréquences de pointe inférieures (20-80 kHz), tandis que les éternuements présentent des composants s’étendant au-delà de 90 kHz²². Ces divergences acoustiques offrent un cadre nouveau et non invasif pour la discrimination comportementale, complétant les analyses traditionnelles de formes d’ondes respiratoires. Malgré ces innovations, une lacune critique persiste : les modèles existants manquent de spécificité anatomique dans l’administration des stimulus, confondant souvent les voies réflexes trachéales et nasales. Cette limitation montre que nous avons besoin de meilleures façons de cibler et d’étudier les réflexes respiratoires.

La recherche sur les mécanismes sous-jacents à la toux et aux éternuements induits par la stimulation mécanique et chimique des voies respiratoires a été largement menée sur des modèles de grands animaux (par exemple, des chats)¹⁷. Cependant, dans les modèles de petits animaux (p. ex., cobayes, rats et souris), les limitations techniques ont généralement nécessité le recours à des composés aérosolisés (tels que la capsaïcine ou l’acide citrique) pour obtenir une stimulation chimique.

Ce protocole propose une nouvelle méthode pour induire des comportements semblables à la toux et aux éternuements chez la souris et établit un nouvel ensemble de méthodes pour quantifier et caractériser ces réflexes respiratoires. Cette approche établit une stratégie pour différencier les comportements semblables à la toux et aux éternuements chez les souris en identifiant les vocalisations caractéristiques et en analysant leurs caractéristiques spectrales et leur intensité acoustique. Cette nouvelle méthodologie a le potentiel de normaliser la quantification des réflexes respiratoires murins, d’améliorer la reproductibilité expérimentale et d’approfondir la compréhension mécaniste de la neurophysiologie de la toux et des éternuements.

Protocole

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives du protocole d’utilisation et de soins des animaux du laboratoire de Guangzhou (GZLAB-AUCP- 2024-04-A10). Des souris C57BL/6 femelles et mâles exemptes d’agents pathogènes spécifiques, âgées de 8 à 10 semaines, ont été utilisées dans cette étude.

1. Préparation expérimentale

1. Préparation des animaux d’expérimentation
   1. Hébergez les souris dans des cages avec un accès libre à la nourriture et à l’eau, et maintenez-les à 22 ± 1 °C sous un cycle standard de 12 h lumière/obscurité.
2. Préparation de la solution de capsaïcine
   1. Dissoudre 30,5 mg de poudre de capsaïcine dans du PBS contenant 10 % d’éthanol et 10 % de Tween-80 pour préparer une solution mère de 10 mM.
   2. Diluer une solution mère 1:100 dans une solution saline physiologique pour préparer une solution de travail de 100 μM.
3. Préparation du tribromoéthanol (Avertin)
   1. Pesez 0,5 g de tribromoéthanol dans un tube Eppendorf de 1,5 ml. Ajouter 1 mL de 2-méthyl-2-butanol.
   2. Incuber à 55 °C avec agitation (400-600 tr/min) dans l’obscurité jusqu’à dissolution complète (~20 min).
   3. Placez 40 ml de solution saline physiologique dans un bécher. Tout en remuant, ajoutez la solution de tribromoéthanol dissoute goutte à goutte. Continuer à remuer jusqu’à ce que les cristaux dissous se dissipent complètement (~40 min).
   4. Ajustez le pH à 7,0-7,3 à l’aide de NaOH.

2. Etablissement et enregistrement d’un modèle de comportement semblable à celui de la toux

1. Préparation de la canule d’implantation
   1. Coupez une aiguille de 28 G (ID : 0,19 mm, OD : 0,35 mm) dans une canule de ~5 mm. Lissez les deux extrémités avec du papier abrasif à l’aide d’une pince. Fixez une extrémité à un tube en silicone (ID : 0,3 mm, OD : 0,8 mm). Connectez-le à une seringue de 1 mL et rincez la canule avec de l’eau pour vérifier la perméabilité.
   2. Canule pliée à 90° avec rapport de bras de 2:3. Insérez le bras plus long dans le tube en silicone (ID : 0,3 mm, OD : 0,8 mm, longueur 5 cm ; Figure 1A). Désignez l’extrémité pliée pour l’implantation trachéale. Étendez le tube de silicone de la trachée au crâne pour la fixation (Figure 1B).
2. Préparation de la configuration de l’appareil d’enregistrement
   1. Préparer le système de pléthysmographie corps entier (WBP), l’enregistreur à ultrasons, la caméra à grande vitesse, la pompe de micro-injection.
3. Attribution de groupe de souris
   1. Répartissez aléatoirement les souris en trois groupes (n = 6/groupe) : i) Groupe témoin : Maintenez un état normal non traité. ii) Groupe fictif : Implanter la canule trachéale sans stimulation. iii) Groupe de stimulation : Implantez la canule trachéale et administrez de la capsaïcine pour induire la toux.
4. Intervention chirurgicale
   1. Anesthésier les souris par injection intrapéritonéale de tribromoéthanol (125-250 mg/kg), et confirmer l’anesthésie complète par l’absence de réponse à un pincement de l’orteil.
   2. Fixez la souris anesthésiée en décubitus dorsal. Rasez les poils crâniens et cervicaux. Désinfecter avec de l’iodophore. À l’aide de ciseaux chirurgicaux, coupez une section circulaire du cuir chevelu d’environ 5 mm de diamètre pour exposer le crâne.
   3. Au microscope : Inciser la peau du col de l’utérus sur environ 1 cm. Disséquez brutalement les tissus et les muscles pour exposer la trachée. Percez les tissus mous entre les cartilages cricoïde et trachéal à l’aide d’une aiguille de 32 G. Créez une ouverture trachéale minimale avec des ciseaux ophtalmiques.
      REMARQUE : Gardez la taille de l’ouverture juste assez grande pour le diamètre de la canule afin d’éviter d’endommager les tissus.
   4. Insérez une canule métallique (gainée de silicone) de ~1 mm dans la lumière trachéale. Jonction canule-trachée sécurisée avec suture 7-0.
      REMARQUE : Limitez la profondeur d’insertion à 1 mm pour éviter toute atteinte respiratoire.
   5. Tunnel sous-cutané du cou au crâne. Acheminez le tube de silicone vers le crâne et fixez-le avec du ciment dentaire.
   6. Suture de l’incision cervicale. Placez la souris sur un coussin chauffant jusqu’à ce qu’elle soit consciente. Maison en cage pendant 5 jours.
   7. Rincer quotidiennement la canule ou la tubulure trachéale avec une seringue à air comprimé.
      REMARQUE : Omettre les bouffées vasomotrices dans les 24 heures précédant l’induction de la toux.
5. Enregistrement de la toux
   1. Équipez la sonde à ultrasons d’une bague d’étanchéité compatible avec les ports. Insérez la sonde dans l’orifice de la chambre WBP pour assurer un contact étanche avec l’air.
   2. Connectez la chambre WBP, le capteur de débit et le débit de polarisation. Calibrez via un logiciel.
   3. Fixez un tube en silicone fixé au crâne à un tube d’extension de 30 cm. Placez la souris dans la chambre WBP. Étendez le tube par l’orifice supérieur. Scellez le port avec de la pâte à modeler. Vérifiez l’étanchéité à l’air de la chambre en confirmant que les pics de forme d’onde respiratoire se situent entre 4 ± 2.
   4. Chargez la seringue de 1 mL avec 5 mL de solution de capsaïcine. Éliminez les bulles d’air. Connectez-vous au tube d’extension. Montez la seringue sur la pompe de micro-injection et réglez le débit à 10 μL ^min-1.
      REMARQUE : Un débit excessif peut transporter la capsaïcine vers la cavité nasale.
   5. Positionnez une caméra haute vitesse face à la chambre. Ajustez la distance et la mise au point. Réglez la fréquence d’échantillonnage sur 160 ips (maximum).
   6. Démarrez simultanément le WBP, l’échographie et le logiciel de la caméra ; Déclenchez la pompe pour infuser la capsaïcine. Enregistrez le nombre de toux pendant 10 min.

3. Etablissement et enregistrement d’un modèle de comportement semblable à celui de l’éternuement

1. Préparation de l’équipement expérimental
   1. Préparez un tube PE stérile (ID : 0,5 mm, OD : 1 mm) pour la fixation comme canule de stimulation sur l’os nasal murin.
   2. Préparez un filament de nylon stérilisé de 0,25 mm de diamètre pour la stimulation nasale trans-canule. Inspirez-vous de la méthode d’étalonnage de Vonfrey, lorsque le filament de 5 cm de long est pressé verticalement sur une balance jusqu’à ce qu’il se plie à environ 45°, la force mesurée est de 0,6 g.
2. Configuration de l’appareil d’enregistrement
   1. Un système de pléthysmographie corps entier (WBP), un enregistreur à ultrasons et une caméra haute vitesse.
3. Attribution de groupe de souris
   1. Répartissez au hasard les souris en trois groupes (n = 6/groupe) : i) Groupe témoin : Maintenez l’état de base non traité. ii) Groupe simulé : Canule nasale fixe sans stimulation. iii) Groupe de stimulation : Fixer la canule nasale + évoquer l’éternuement par stimulation filamentaire.
4. Intervention chirurgicale
   1. Anesthésier les souris par injection intrapéritonéale de tribromoéthanol (125-250 mg/kg), et confirmer l’anesthésie complète par l’absence de réponse à un pincement de l’orteil.
   2. Rasez les poils du crâne et de l’arête nasale.
   3. Fixez la souris dans un cadre stéréotaxique. Désinfecter avec de l’iodophore. Inciser la peau sur le crâne et l’os nasal. Exposez l’os du nez.
   4. Créez un trou de 0,5 mm dans la jonction entre l’os nasal et l’apophyse latérale du cartilage septal nasal à l’aide d’une micro-perceuse. Exposer la muqueuse nasale.
      REMARQUE : Limitez la taille du trou à 0,5 mm pour éviter d’endommager les tissus.
   5. Soulevez doucement la muqueuse nasale avec une aiguille de 32 G. Exposez la cavité nasale.
   6. Montez le tube PE dans le bras stéréotaxique. Positionnez l’embout du tube au ras du trou de bavure. Fixez le tube à l’os nasal avec du ciment dentaire.
   7. Placez la souris sur un coussin chauffant jusqu’à ce que la conscience revienne.
5. Enregistrement des éternuements
   1. Connectez la chambre WBP, le capteur de débit et le débit de polarisation conformément au manuel. Calibrez à l’aide d’un logiciel.
   2. Équipez la sonde à ultrasons d’un joint adapté à l’orifice. Insérez la sonde dans la chambre. Vérifiez que le joint est étanche à l’air.
   3. Transférez la souris dans la chambre WBP. Étendez le tube PE à travers l’orifice supérieur. Scellez l’orifice avec de la pâte à modeler autour du tube. Vérifiez l’étanchéité à l’air de la chambre en confirmant que les pics de forme d’onde respiratoire se situent entre 4 ± 2.
   4. Positionnez une caméra haute vitesse face à la chambre. Ajustez la distance et la mise au point. Réglez la fréquence d’échantillonnage sur 160 ips (maximum).
   5. Avancez un filament de nylon de 0,25 mm de diamètre à travers un tube souple dans la cavité nasale jusqu’à des profondeurs de 0 à 3 mm. La partie du filament qui dépasse du tube manuel mesure 5 cm de long. Pendant la stimulation, appuyez sur cette extrémité libre jusqu’à ce qu’elle se plie à 45°, délivrant ~0,6 g de force à la muqueuse nasale pendant 1 s, répétez l’opération une fois toutes les 30 s. Enregistrez les éternuements pendant 10 min.

4. Toux et éternuements induits par la capsaïcine chez la souris

1. Affectation de groupe
   1. Divisez les souris en groupes de chirurgie simulée et de chirurgie (n = 5/groupe). Groupe fictif : Exposer les nerfs ethmoïdaux antérieurs bilatéraux et infraorbitaires. Groupe de chirurgie : Transect bilatéral des nerfs ethmoïdaux antérieurs et infraorbitaires.
2. Nébulisation par ultrasons
   1. Préparez la chambre comportementale (20 cm × 14 cm × 17 cm).
   2. Positionnez l’enregistreur à ultrasons et la caméra pour une surveillance optimale.
   3. Chargez le nébuliseur avec 100 μM de solution de capsaïcine. Délivrer des impulsions d’aérosol de 30 s toutes les 2 minutes pendant 10 minutes.
   4. Enregistrez les comportements en continu à l’aide de l’enregistreur à ultrasons et de la caméra.

5. Processus d’analyse des données

1. Analyse du traçage respiratoire par pléthysmographie corps entier (WBP)
   1. Importez les fichiers texte enregistrés WBP dans le logiciel Spike2 et synchronisez-les avec les signaux audio.
   2. Analysez les signaux audio correspondant aux modèles de respiration à un seul pic et à deux pics, et enregistrez la durée de la phase de compression pour chaque modèle.
   3. Sélectionnez le point le plus bas de la phase expiratoire comme point médian et prenez les données d’une demi-seconde avant et après pour calculer la valeur moyenne.
2. Analyse de la forme d’onde audio
   1. Importez des fichiers audio dans le logiciel Spike2, sélectionnez un son individuel de toux ou d’éternuement et exportez-les au format TXT (avec une fréquence d’échantillonnage réglée sur 100 kHz et une durée de 0,1 s).
   2. Importez les fichiers TXT dans Excel et convertissez-les en valeurs absolues des signaux audio.
   3. Utilisez le logiciel GraphPad Prism pour lisser les valeurs absolues des formes d’onde audio à l’aide d’une spline de lissage à 50 points.
      REMARQUE : Pour s’assurer que la courbe se rapproche étroitement des données d’origine tout en évitant les points d’inflexion excessifs, la sélection d’une spline de lissage de 50 points est optimale ; Les courbes générées avec des valeurs supérieures à 50 points présentent un écart négligeable par rapport à la courbe à 50 paramètres.
   4. Sur la base des formes d’onde audio lissées, calculez la pente k du point de départ au point le plus élevé.
3. Analyse spectrale audio
   1. Importez des fichiers audio dans le logiciel Spike2.
   2. Sélectionnez les points temporels de début et de fin de l’audio de toux ou d’éternuement individuel pour l’analyse spectrale, puis exportez les résultats de l’analyse spectrale.
   3. Utilisez GraphPad Prism pour générer des courbes d’analyse spectrale et calculer l’aire sous les courbes.
   4. Calculer le rapport de l’aire sous la courbe entre les bandes de fréquences 30-60 kHz et 0-30 kHz pour distinguer la toux de l’éternuement.
4. Calcul de l’indice composite
   1. Effectuez une transformation logarithmique népérienne (ln) sur la pente k et le rapport de l’aire sous la courbe d’analyse spectrale pour améliorer la discriminabilité des données.

6. Analyse statistique

1. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. Des comparaisons statistiques entre deux groupes ont été effectuées à l’aide du test t et de l’ANOVA à deux facteurs, avec un P < 0,05 considéré comme statistiquement significatif. Toutes les analyses ont été effectuées avec le logiciel GraphPad Prism.

Résultats

Dans cette étude, nous avons effectué une analyse détaillée des schémas respiratoires des comportements de toux et d’éternuements des souris à l’aide de techniques de pléthysmographie du corps entier (WBP) et d’enregistrement par échographie. Les résultats ont montré que les souris soumises à une chirurgie trachéale ou nasale présentent une réponse à la toux et aux éternuements comparable à celle des témoins naïfs. Cependant, la capsaïcine (chimique) et la stimulation mécanique évoquent efficacement la toux et les réflexes d’éternuement chez ces animaux préparés chirurgicalement (Figure 2A,B). Les résultats de la WBP ont révélé que les deux comportements présentaient des modèles à un ou deux pics, leurs signaux sonores apparaissant pendant la phase expulsive du schéma respiratoire (Figure 3A, C, E, G). Une analyse échographique plus poussée a révélé des profils acoustiques distincts : les bruits de toux présentaient une apparition soudaine avec une intensité maximale se produisant instantanément, principalement dans la gamme de fréquences de 0 à 30 kHz, et de plus courte durée (Figure 3B, D ; Vidéo de soutien S1). Les sons d’éternuement ont montré une augmentation progressive de l’intensité jusqu’à l’amplitude maximale, une distribution de fréquence à large bande (0-80 kHz) et une durée prolongée (figures 3F, H ; Vidéo de soutien S2). L’analyse statistique a révélé que la phase de compression moyenne du comportement de toux à pic unique était de 32,39 ± 0,73 ms, significativement plus courte que celle du comportement de toux à double pic à 53,17 ± 2,29 ms (Figure 4A, B, C). La phase de compression moyenne du comportement d’éternuement à un seul pic était de 44,03 ± 1,84 ms, inférieure à la valeur moyenne du comportement de toux à double pic, tandis que la phase de compression moyenne du comportement d’éternuement à double pic était de 74,24 ± 1,29 ms, significativement plus longue que celle du comportement d’éternuement à un seul pic (Figure 4E, F, G). De plus, le taux d’occurrence du modèle à pic unique dans le comportement de toux était de 77,55 ± 2,10 % (Figure 4D), tandis que dans le comportement d’éternuement, le modèle à pic unique ne représentait que 32,42 ± 5,88 %, le modèle à double pic représentant 67,58 ± 5,88 % (Figure 4H). L’analyse statistique de la durée audio a révélé des différences significatives entre les durées audio de la toux et des éternuements, mais il y avait un chevauchement considérable entre les deux (figure 5A). Grâce à l’analyse spectrale de l’échographie audio de la toux et des éternuements, nous avons constaté que le spectre de fréquences de l’audio de la toux était principalement concentré dans la gamme 0-30 kHz, tandis que l’audio des éternuements avait une proportion plus élevée dans la gamme 0-60 kHz (Figure 5B). Bien que le son de la toux ait également des fréquences dans la gamme de 30 à 120 kHz, la proportion de basses fréquences était toujours plus élevée que celle des hautes fréquences. Par conséquent, nous avons utilisé la pente de l’intensité sonore du point de départ à la valeur maximale (Figure 5C) comme coordonnée verticale et le rapport d’énergie de 30-60 kHz à 0-30 kHz (Figure 5D) comme coordonnée horizontale pour établir un système de coordonnées permettant de distinguer efficacement la toux et les éternuements. De plus, il n’y avait pas de différences significatives entre la toux à pic unique et à pic double ainsi que les éternuements à pic simple et à double pic dans ce système de coordonnées (figure 5E).

Ensuite, nous avons utilisé les méthodes de classification susmentionnées pour catégoriser les comportements de toux et d’éternuements induits par la nébulisation de la capsaïcine chez la souris. Nous avons constaté que les comportements de toux et d’éternuements induits par la nébulisation de la capsaïcine se chevauchent avec ceux évoqués par une stimulation spécifique sur les mêmes positions de coordonnées (Figure 5F,G). Après la section des nerfs afférents sensoriels nasaux (nerfs ethmoïdal antérieur et infraorbitaire), la nébulisation de la capsaïcine a significativement réduit les signaux acoustiques associés aux éternuements, tandis que les profils audio liés à la toux n’ont pas été affectés (Figure 5H,I).

Figure 1 : Schéma de principe de l’opération dans le modèle de trachée stimulée et de cavité nasale. (A) Représentation schématique du cathéter implanté dans la trachée. (B) Les plans frontal (gauche) et coronal (droite) montrent la position du cathéter implanté dans la trachée de la souris. (C) Le plan sagittal montre la position de l’implantation du cathéter dans la cavité nasale et la position de la stimulation des fibres filamentaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Quantification des comportements semblables à la toux et aux éternuements provoqués par une stimulation spécifique au site. (A) Quantification des éternuements du groupe témoin normal, du groupe simulé et du groupe de stimulation nasale mécanique. Le groupe fictif présentait une fréquence d’éternuement comparable à celle des témoins. La stimulation nasale mécanique a provoqué une augmentation significative des éternuements. (B) Quantification de la toux du groupe témoin normal, du groupe placebo et du groupe de provocation trachéale à la capsaïcine. Le groupe placebo n’a montré aucune différence significative dans la fréquence de la toux par rapport aux témoins. La stimulation trachéale à la capsaïcine a considérablement augmenté le nombre de toux. Les données sont représentées par la moyenne ± SEM, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Les traces respiratoires et l’oscillogramme sonore de la toux et des éternuements. (A) Images représentatives montrant la trace respiratoire de pointe unique et l’enregistrement audio pendant une toux induite par la capsaïcine. (B) L’oscillogramme sonore (en haut) et le spectrogramme (en bas) de l’enregistrement audio de la toux en A. (C) Images représentatives montrant les doubles pics, trace respiratoire et enregistrement audio lors d’une toux induite par la capsaïcine. (D) L’oscillogramme sonore (en haut) et le spectrogramme (en bas) de l’enregistrement audio de la toux en C. (E) Images représentatives montrant le pic unique de trace respiratoire et l’enregistrement audio pendant un éternuement induit par une stimulation mécanique. (F) L’oscillogramme sonore (en haut) et le spectrogramme (en bas) de l’enregistrement audio de l’éternuement en E. (G) Images représentatives montrant les doubles pics, la trace respiratoire et l’enregistrement audio lors d’un éternuement induit par une stimulation mécanique. (H) L’oscillogramme sonore (en haut) et le spectrogramme (en bas) de l’enregistrement audio de l’éternuement en G. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Les pics simples et doubles des traces respiratoires de comportements semblables à la toux et aux éternuements. (A) Traces respiratoires moyennes (rouges) et individuelles (grises) et moyennes (rouges) de comportements semblables à la toux avec un seul pic respiratoire (n = 52). (B) Traces respiratoires moyennes (rouges) et individuelles (grises) et moyennes (rouges) de comportements semblables à la toux avec des pics respiratoires doubles (n = 29). (C) Durée des phases compressives des pics respiratoires simples et doubles pour les toux induites par la capsaïcine (pic unique n = 52, pics doubles n = 29). (D) Le rapport moyen des traces de pic respiratoire simple et double dans la toux (n = 6 souris). (E) Traces respiratoires moyennes (rouges) et individuelles (grises) et moyennes (rouges) de comportements semblables à des éternuements avec des pics respiratoires uniques (n = 40). (F) Traces respiratoires moyennes (rouges) et individuelles (grises) et moyennes (rouges) de comportements semblables à des éternuements avec des pics respiratoires doubles (n = 74). (G) Durée des phases de compression des pics respiratoires simples et doubles pour les éternuements induits par stimulation mécanique (pic simple n = 40, pics doubles n = 74). (H) Le rapport moyen des traces de pic respiratoire simple et double dans les éternuements (n = 6 souris). Les données sont représentées par la moyenne ± MEB, ****P < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Classification de la fréquence et de la forme d’onde de l’oscillogramme sonore de la toux et des éternuements. (A) Quantification de la durée de l’échographie de la toux et des éternuements. (B) L’analyse moyenne par spectrogramme des éternuements induits par la stimulation mécanique (n = 69, noir) et de la toux induite par la capsaïcine (n = 140, rouge). (C) Un schéma représentatif pour le calcul de la pente d’un oscillogramme sonore. L’analyse comparative de la spline de lissage révèle qu’à 25 points, un lissage excessif obscurcit les caractéristiques des données d’origine, tandis que les valeurs supérieures à 50 points (par exemple, 75 points) présentent un chevauchement substantiel avec la courbe à 50 splines, mais introduisent des points d’inflexion supplémentaires. (D) Un diagramme schématique représentatif du calcul du rapport de surface, utilisant les résultats de l’analyse spectrale pour calculer l’aire sous différentes courbes de fréquence dans GraphPad Prism. Le rapport de surface est égal à l’aire sous la courbe 30-60 kHz et à l’aire sous la courbe 0-30 kHz. (E) La classification de la fréquence et de la forme d’onde des éternuements induits par la stimulation mécanique et de la toux induite par la capsaïcine, l’axe des y représentant l’exposant de la pente de la forme d’onde sonore de la ligne de base au sommet, et l’axe des x représentant l’exposant du rapport des ondes sonores entre 30-60 kHz et 0-30 kHz. (F) L’analyse spectrographique moyenne des éternuements induits par la nébulisation de la capsaïcine (n = 36, noir) et de la toux induite par la nébulisation de la capsaïcine (n = 42, rouge). (G) La classification de la fréquence et de la forme d’onde des éternuements induits par la nébulisation de la capsaïcine (n = 36, noir) et de la toux induite par la nébulisation de la capsaïcine (n = 42, rouge), l’axe des y représentant l’exposant de la pente de la forme d’onde sonore de la ligne de base au sommet, et l’axe des x représentant l’exposant du rapport des ondes sonores entre 30-60 kHz et 0-30 kHz. (H) Données statistiques sur le réflexe d’éternuement induit par la capsaïcine dans les groupes avec des nerfs ethmoïdaux antérieurs et infraorbitaires transectés par rapport au groupe de chirurgie simulée. (I) Données statistiques sur le réflexe de toux induit par la capsaïcine dans les groupes avec des nerfs ethmoïdaux antérieurs et infraorbitaires transectés par rapport au groupe de chirurgie simulée. Les données sont représentées comme la moyenne ± SEM, **P < 0,01, ****P < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo supplémentaire 1 : Vidéo d’un comportement semblable à celui de la toux synchronisée avec son spectrogramme audio, affiché à une vitesse normale et à une vitesse de 0,1x. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Vidéo supplémentaire 2 : Vidéo du comportement semblable à un éternuement synchronisée avec son spectrogramme audio, affiché à une vitesse normale et à une vitesse de 0,1x. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Dans cette étude, nous avons réussi à induire des comportements de toux et d’éternuements chez des souris en stimulant spécifiquement la trachée avec de la capsaïcine et en stimulant mécaniquement la cavité nasale ^8,17. Nous avons collecté de manière synchrone des données à partir d’enregistrements de pléthysmographie du corps entier (WBP), audio et vidéo, et avons constaté que les rapports de fréquence audio et les pentes d’intensité sonore pouvaient différencier efficacement les comportements de toux et d’éternuements chez les souris ^8,23.

Compte tenu de la nature délicate des procédures chirurgicales, une attention particulière doit être accordée à plusieurs étapes critiques. Tout d’abord, lors d’une chirurgie trachéale, la canule intratrachéale implantée doit être aussi fine que possible et insérée à une faible profondeur pour éviter l’obstruction des voies respiratoires, qui pourrait entraîner une détresse respiratoire voire la mort. De plus, comme les sécrétions à l’intérieur de la trachée peuvent facilement bloquer le cathéter, l’élimination quotidienne du cathéter est cruciale. Lors de l’administration de capsaïcine, la vitesse d’injection doit être soigneusement contrôlée pour éviter un écoulement rétrograde dans la cavité nasale, ce qui pourrait déclencher des réflexes d’éternuements. Deuxièmement, lors de la chirurgie d’implantation osseuse nasale, la taille du trou percé est cruciale pour éviter des dommages excessifs à la souris. Le cathéter doit être placé au niveau de l’os nasal sans être inséré trop profondément, afin d’éviter une irritation excessive de la cavité nasale ou une interférence avec la respiration normale. En fin de compte, la mise en œuvre d’actes chirurgicaux précis est essentielle pour l’expérience. En minimisant les blessures à la souris, non seulement la récupération peut être accélérée, mais également des réponses comportementales expérimentales plus précises peuvent être enregistrées. De telles méthodes chirurgicales permettent d’améliorer la fiabilité du modèle et de garantir des données de haute qualité, fournissant ainsi une base expérimentale solide pour l’étude des comportements réflexes respiratoires tels que la toux et les éternuements.

Traditionnellement, la modélisation du comportement de la toux s’est appuyée sur la nébulisation de composés tels que la capsaïcine et l’acide citrique pour induire la toux^24,25. Cependant, cette approche comporte des limites notables : non seulement elle provoque la toux, mais elle peut également déclencher simultanément des réflexes d’éternuement ^8,22. De plus, une variabilité interindividuelle significative de la sensibilité aux stimuli aérosolisés a été observée²⁶, et un sous-ensemble de souris n’a montré aucune réponse à la toux. En revanche, le nouveau paradigme de stimulation mécanique développé dans cette étude permet d’obtenir des comportements stables semblables à ceux de la toux tout en permettant une personnalisation flexible des stimuli grâce à des actionneurs interchangeables. De même, les modèles d’éternuement conventionnels utilisant des agents aérosolisés souffrent d’une faible spécificité comportementale, car ils évoquent fréquemment une toux collatérale²², compliquant ainsi la différenciation entre ces réflexes respiratoires distincts.

Des études antérieures ont établi des modèles de toux et d’éternuements chez la souris à l’aide de la capsaïcine, et ont différencié les deux en fonction des caractéristiques des schémas respiratoires (pics simples ou doubles) enregistrés par pléthysmographie du corps entier (WBP)⁸. Nos données de recherche indiquent que dans le comportement de toux induite, le schéma respiratoire à pic unique représentait 77,55 ± 2,10 % des occurrences, tandis que dans le comportement à éternuement, le modèle à pic unique représentait 32,42 ± 5,88 %. Ces résultats confirment que la méthode de classification basée sur les schémas respiratoires WBP est efficace dans la plupart des cas mais présente des limites et ne permet pas une différenciation parfaite entre les deux comportements. De plus, certaines études ont tenté de distinguer la toux des éternuements en utilisant les caractéristiques de durée et de fréquence des signaux audio²². Bien que la durée moyenne des signaux audio pour le comportement d’éternuement soit généralement plus longue que pour la toux, il existe un chevauchement important entre les durées des événements individuels. Par conséquent, le fait de se fonder sur la durée audio comme indicateur distinctif peut manquer de discernement. De plus, l’analyse spectrale de la toux et des éternuements n’a pas révélé de limite claire : les toux légères peuvent ne se manifester que par des signaux de basse fréquence, tandis que les toux vigoureuses peuvent produire des sons qui comprennent des composantes de haute fréquence importantes, avec des caractéristiques spectrales similaires à celles des éternuements. Notamment, les événements de toux présentent systématiquement une proportion plus élevée d’énergie à basse fréquence. En revanche, le rapport entre l’énergie des hautes fréquences et des basses fréquences (High-to-Low Frequency Energy Ratio) peut fournir une caractéristique acoustique plus discriminante pour distinguer les comportements de toux et d’éternuement.

Notre innovation répond à ces limitations grâce à une stimulation mécanique limitée dans l’espace. Le modèle comportemental affiné présente deux avantages : (1) une précision millimétrique dans les sondes stabilisées d’application de stimulus, et (2) une spécificité comportementale améliorée. De plus, notre analyse approfondie de l’acoustique de la toux et des éternuements révèle que ces comportements présentent des profils d’intensité sonore distincts, avec des différences statistiquement significatives dans leurs rapports d’énergie haute et basse fréquence. De plus, notre analyse acoustique complète des épisodes de toux et d’éternuements révèle des profils d’intensité sonore distincts entre ces comportements, accompagnés de différences statistiquement significatives dans leurs rapports d’énergie haute et basse fréquence. De plus, cette méthode de classification est également réalisable dans les enregistrements acoustiques des comportements de toux et d’éternuements induits par la nébulisation de la capsaïcine. Collectivement, ces paramètres acoustiques ont permis le développement d’un espace de caractéristiques multidimensionnelles qui établit une norme objective et quantifiable pour différencier la toux et les éternuements. Le résultat établit une bonne norme pour l’étude des mécanismes de défense des voies respiratoires avec des facteurs de confusion réduits et une reproductibilité améliorée. Cela résout non seulement les défis de longue date de la recherche sur les réflexes respiratoires, mais ouvre également la voie à des études précises de la neuromodulation des circuits neuronaux de la toux et des éternuements.

Bien que cette méthode induise efficacement des comportements de toux et d’éternuements chez les souris, elle présente encore certaines limites. Par rapport à l’induction par nébulisation, la chirurgie peut causer un certain degré de blessure aux souris, même si nous nous efforçons de minimiser les dommages pendant la procédure. Néanmoins, la chirurgie peut toujours susciter de manière stable des comportements de toux et d’éternuements, ce qui indique que la chirurgie elle-même ne diminue pas la sensibilité des souris à ces stimuli. Des défis techniques sont également apparus dans le phénotypage comportemental. La fidélité du signal acoustique nécessitait un calibrage précis du placement du microphone par rapport au sujet pour équilibrer les rapports signal/bruit tout en évitant la saturation de l’amplitude. De plus, l’intégration de cathéters d’administration de stimulus avec des chambres de pléthysmographie corps entier (WBP) a nécessité des conceptions spécialisées : le cathéter doit s’étendre à partir du haut de la chambre sans entraver les mouvements naturels de la souris ou l’administration du stimulus. En résumé, malgré les limites de la méthode chirurgicale, elle fournit un moyen efficace d’induire de manière stable des comportements de toux et d’éternuements chez les souris, et avec un processus expérimental soigneusement conçu, les blessures à la souris peuvent être minimisées pour assurer une collecte précise de données comportementales.

En conclusion, grâce à ces manipulations chirurgicales délicates et à une conception expérimentale rigoureuse, nous avons établi un modèle qui induit de manière stable des comportements de toux et d’éternuements chez la souris, fournissant une base expérimentale fiable pour une étude plus approfondie de ces deux comportements réflexes respiratoires.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

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2-méthyl-2-butanol	Sigma-Aldrich	240486-100ML
Avisoft RECORDER USGH	Avisoft		Pour l’enregistrement ultrasonore
Injecteur stéréotaxique cérébral	Propulsion	68801
Capsaïcine	MCE	HY-10448
Balancière électronique	Shanghai ZhuoJing	BSM-220.4
GraphPad Prism	GraphPadSoftware		Utilisé pour les graphiques et l’analyse de données
Système de caméra à grande vitesse	Filr	20102748
Iodophore	LIRCON		https://www.lircon.cn/products_details/218.html
Pompe à microinjection	XIMAINANOTECH	XMSP-C
Pâte à modeler			https://detail.tmall.com/item.htm ? app=weixin& bc_fl_src=share-10 41234985980666-2-1& bxsign=s cdTRuE_YDJUf3ImFGBBqpft8S OgQqVocuYNmXEUcLyxiJX85R eVH8uZxdnVBKeXGONiCQ_Fc UDXoNcDga8mP3sClXi1CKRn R6SHFSitGVUGOFOA7eGoZT 38cLXHb8wUW-S& cpp=1& h5_ spm=a-tb-item.b-tb-item& id=61 1429671875& partager _crt_v=1& shareurl=true& short _name=h.hs0LTq88ockDBN6& sp_tk=cldZNjRSREhKUDU %3 D& SPM=A2159R.13376460.0.0 & tbSocialPopKey=shareItem& tk=rWY64RDHJP5& UN=B385 9eAb62EF44248BD7bab98FFEB 263& un_site=0& ; ut_sk=1.ZZv9 EYywWWkDAI %2FaThaoYLYt _21646297_1755091386528.T aoPassword-WeiXin.1& wxsign =tbwPFmvLRyYmleaKSyVP7W t1XJnfAXUas_u1d5JJPUA91z9 4BTPKze3BbE2bNJHvC4-agGF ARD4JFW0c8hjdn7Z1Mfk1qgIZ VJ2SaGNFy8b809h3okigHQkp8 LhDopd5-VF& x-SSR=Vrai
Nébuliseur	YUWELL	M105	Pour l’atomisation de la capsaïcine
Tubulure PE & nbsp ;	Propulsion	62323
Tubes en silicone			https://item.taobao.com/item.htm ? id=618505617112& pisk=gFrice1c WPu1u5K6Stm15sEF8l7d5cijiSK xMmhV8XlBXSntDD-EBYH2ux8Z Ty27ifBf5cUniWPn_S2fCxl4gScY WwI8CRij0_Uc2ge6-dJRw5xZ3p Wqex8NpV5Fxrz-0_CR2epE51n 4Mg0bwy8EFXkZ3m8NK2krnmk< br/> Z7jWnTxDWuCPq09XnnYxw_xu qLMksIm8q7n-ULYH-QCuZ72W nhX8Z0mPqY9DjTjoq0b1J0bq4A k5cCgtoXJh0xA0iaJbW0nvrQQhu QN-D0k4n8bR-tn-4xA2cQfKHqZ hzPf3-MWSpjm2En5hLag-nY44 7HxVGjhoT8yZsXkCkMVmK_4z q-OSaKccirl3lD1igu5Zm5PvfFJo aOzGS7w1IKlE-obgHT1yLKfuuo5 CB0fUuLW08vBK-cWa4gxVesglW 8U8O0ngpWb8XlVkIKbKQBDHRe 4RzM9XHPNgZdACRK9YXlVkIKb BhKUOj7vMOw& SPM=A21xtw.291 78619.0.0
Logiciel Spike2	Spike2		Utilisé pour l’analyse des traces respiratoires et audio
SpinView	Filr		Utilisé pour l’enregistrement vidéo à haute vitesse
Tribromoéthanol	Sigma-Aldrich	T48402-100G
UltraSoundGate 116Hme	Avisoft	116Hme/63
Logiciel admiad WBP	TOW-INT-TECH		Utilisation pour l’enregistrement WBP
Système de pléthysmographie corporelle WBP	TOW-INT-TECH	2403-3204