Article de recherche

Détection rapide du staphylocoque doré et du staphylocoque doré résistant à la méthicilline par PCR fluorescente multiplex en temps réel

DOI :

10.3791/69004

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19 septembre 2025

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1Department of Cardiac Surgery, Guangdong Cardiovascular Institute, Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University, 2Department of Laboratory, Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Ce protocole utilise la PCR multiplexe en temps réel avec des amorces/sondes ciblant les gènes mécaA nuc et SARM spécifiques de SA. Il permet une détection qualitative rapide (<1 h) des acides nucléiques SA/SARM dans des échantillons d’expectorations humaines, surmontant ainsi les limites des méthodes basées sur la culture.

Résumé

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Staphylococcus aureus (S. aureus) est un agent pathogène humain à Gram positif commun qui provoque des infections communautaires et nosocomiales, avec diverses manifestations cliniques allant de lésions superficielles locales et d’intoxications alimentaires à des infections systémiques mortelles. La découverte des antibiotiques a considérablement réduit le taux de mortalité, mais le problème de la résistance aux médicaments est depuis devenu de plus en plus important. Depuis la première identification du SARM en 1960, cette souche est devenue une menace pour la santé publique à l’échelle mondiale. Le SARM est un agent pathogène majeur des infections nosocomiales, capable de provoquer diverses maladies graves telles que l’endocardite, l’ostéomyélite chronique, la pneumonie, l’arthrite pyogène et la bactériémie. Par conséquent, la détection rapide et précise de S. aureus et de sa résistance aux médicaments est cruciale pour guider le traitement clinique.

Les méthodes actuelles de détection systématique de S. aureus et du SARM présentent des limites importantes. La méthode traditionnelle de culture bactérienne, qui a servi de « référence » pendant des décennies, peut fournir des résultats définitifs d’identification des espèces et de sensibilité aux médicaments, mais le processus prend du temps, prenant de 48 à 72 heures. De plus, cette méthode est sensible à la contamination et s’appuie sur des installations de laboratoire spécialisées et des techniciens qualifiés. Les tests sérologiques permettent d’obtenir un diagnostic non invasif en détectant les anticorps anti-S. aureus dans le sérum du patient, mais ils ne peuvent pas faire la distinction entre les infections actives et les infections passées, ni identifier les souches résistantes aux médicaments (telles que le SARM).

Cette étude se concentre sur le développement d’une nouvelle méthode de détection PCR par fluorescence multiplexe en temps réel pour surmonter les limites mentionnées ci-dessus. Cette méthode conçoit des amorces spécifiques et des sondes fluorescentes TaqMan ciblant le gène nuc spécifique de l’espèce de S. aureus et le gène mecA médiant la résistance à la méthicilline, permettant l’amplification et la détection simultanées de S. aureus et du SARM dans un seul système réactionnel. Cette technologie réduit considérablement le temps de détection, offrant une solution rapide, précise et rentable pour la détection de S. aureus et du SARM. Cette approche novatrice améliore considérablement l’efficacité du diagnostic clinique et facilite la mise en œuvre précoce d’une antibiothérapie ciblée, contribuant ainsi de manière importante au contrôle des infections bactériennes résistantes aux médicaments.

Introduction

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S. aureus est un agent pathogène conditionnel à Gram positif répandu qui colonise la muqueuse nasale des individus sains 1,2. Lorsque l’immunité de l’hôte est compromise, elle peut provoquer des infections cutanées locales, une invasion des tissus profonds ou des maladies systémiques (par exemple, pneumonie, endocardite, ostéomyélite et bactériémie)3. La méthicilline, une pénicilline semi-synthétique, a été appliquée cliniquement pour les infections à S. aureus en 1959, et deux ans plus tard, le SARM est apparu au Royaume-Uni, se propageant rapidement dans les pays européens, notamment le Danemark, la France et la Suisse4. La résistance du SARM aux antibiotiques à β-lactamines complique non seulement la prise en charge clinique, mais augmente également considérablement les risques d’infection5. De multiples facteurs, notamment la colonisation/propagation incontrôlable, les coûts élevés de prévention et la surutilisation d’antibiotiques, ont collectivement fait grimper les taux d’infection à SARM6. En raison de leur transmission rapide et de leurs mécanismes de résistance complexes, les infections à SARM sont associées à des taux de létalité élevés, avec près de 150 000 cas signalés et >7 000 décès par an dans les pays de l’UE7. Selon les données de surveillance du CHINET, les taux d’infection à SARM en Chine sont restés supérieurs à 30 % au cours des cinq dernières années8. Le risque élevé d’infection croisée nosocomiale intensifie encore les charges de santé publique et met à rude épreuve les systèmes de santé 9,10. Par conséquent, le développement de technologies de détection rapide du SARM efficaces et précises est cliniquement urgent pour obtenir un diagnostic précoce, un traitement personnalisé, réduire la mortalité et interrompre les chaînes de transmission.

Les technologies actuelles de détection de S. aureus et du SARM couvrent plusieurs domaines, notamment la détection phénotypique, la détection génomique, la détection transcriptomique, la détection protéomique, la technologie de spectrométrie de masse et les analyses bioinformatiques11.

Les méthodes de détection phénotypiques, telles que la méthode de diffusion sur disque (méthode KB) et la méthode de concentration inhibitrice minimale (méthode MIC), sont recommandées comme « étalon-or » par le Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) et le Comité européen sur les tests de sensibilité aux antimicrobiens (EUCAST). Ces méthodes ont l’avantage de ne pas avoir besoin d’instruments spécialisés, étant largement utilisées pour la surveillance du spectre de résistance et les enquêtes épidémiologiques. Cependant, leurs inconvénients sont également évidents : de longues périodes de culture (plus de 24 h) et les résultats de la méthode KB pour certains nouveaux antibiotiques nécessitent une validation par des valeurs CMI, les résultats pour les souches à point critique étant sensibles aux facteurs humains12,13.

Parmi les méthodes de détection au niveau génomique, la PCR conventionnelle présente les caractéristiques d’une sensibilité élevée et d’une forte spécificité, permettant un jugement préliminaire de la résistance et réduisant le temps expérimental, avec un faible coût et une efficacité élevée. Mais ses limites résident dans le fait qu’il ne peut détecter que des gènes de résistance connus et qu’il s’appuie sur des instruments spécialisés14. Le mécanisme de la résistance microbienne est très complexe, d’où l’importance de développer des méthodes techniques capables de couvrir des phénotypes résistants inconnus et de permettre une identification rapide. La technologie émergente GoPhAST-R (Combined genotypic and phenotypic AST through RNA detection) détermine les phénotypes de résistance en détectant les niveaux d’expression de l’ARNm, ce qui permet de détecter simultanément différents gènes liés à la résistance chez plusieurs agents pathogènes, de raccourcir le délai d’exécution des expériences et d’atteindre une précision de 94 à 99 % lorsqu’elle est combinée à l’apprentissage automatique15.

Parmi les méthodes de détection au niveau protéomique, la méthode d’agglutination au latex PBP2a est basée sur la liaison spécifique antigène-anticorps, avec un fonctionnement simple et des résultats rapides, ayant une spécificité et une sensibilité élevées pour le SARM. Cependant, il ne peut pas faire la différence entre les différentes espèces de staphylocoques, et la sensibilité de détection des kits commerciaux a quelque peu diminué, ce qui nécessite de nouveaux tests après l’induction avec l’oxacilline8.

Les méthodes de détection basées sur la spectrométrie de masse MALDI-TOF, telles que la méthode DOT-MGA (DNA Oligonucleotide Tag-Microarray Detection of Genomic Amplification), permettent d’obtenir des performances analytiques optimales 6 à 8 heures après l’incubation, avec un taux de détection aussi élevé que 96,4 %, et une sensibilité et une spécificité de 100 %. Mais le coût est élevé et les positions limitées sur la plaque cible rendent difficile la détection simultanée de centaines d’échantillons 16,17.

Parmi les technologies d’analyse bio-informatique combinées aux données omiques pour la prédiction de la résistance, la technologie de séquençage du génome entier se distingue par sa haute résolution et ses capacités complètes d’analyse de l’information. Combiné à des bases de données d’analyse de gènes de résistance comme Resfinder, il peut analyser si les souches portent des gènes de résistance spécifiques, prédire le potentiel de résistance, détecter les polymorphismes mononucléotidiques (SNP) et les mutants de gènes associés à la résistance, tout en soutenant le stockage et la réanalyse des données du génome entier18. Cependant, cette méthode doit être utilisée par des professionnels ayant une formation en bioinformatique, est rarement utilisée dans les tests quotidiens et est couramment utilisée pour l’analyse épidémiologique ou la surveillance moléculaire des agents pathogènes19.

Les méthodologies susmentionnées sont soit coûteuses, soit chronophages, soit encore en phase de recherche et développement. Cliniquement, il y a un besoin urgent d’une solution équilibrant « immédiateté » et « précision » - une nouvelle technologie de PCR fluorescente multiplex comble cette lacune en amplifiant simultanément les gènes nuc/mecA dans un seul tube, comprimant le cycle de détection à 1 h. Il comble précisément le vide temporel dans le processus traditionnel de « dépistage d’urgence - typage de résistance », fournissant un outil de diagnostic moléculaire plus efficace pour la prévention et le contrôle des infections nosocomiales. Ce test PCR spécifique est principalement utilisé pour la détection d’échantillons respiratoires, avec des échantillons d’expectorations comme exemple typique. Il présente une sensibilité de 500 copies/mL et une grande spécificité, tout en restant insensible aux agents antibactériens. En raison de ces caractéristiques de performance favorables, ce test PCR a une valeur d’application substantielle pour le diagnostic des infections des voies respiratoires et la surveillance des infections nosocomiales causées par le SARM.

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Protocole

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Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’Hôpital populaire de la province du Guangdong (n° d’éthique : KY2025-510-01). Des informations détaillées concernant les matériaux utilisés dans cette recherche (réactifs, produits chimiques, équipements et logiciels) se trouvent dans la table des matériaux.

1. Protocole de collecte et de conservation des échantillons

  1. Critères d’inclusion : À l’exception des matériaux de contrôle de la qualité, identifier tous les échantillons collectés comme des échantillons positifs à l’aide de la méthode de référence (test basé sur la culture).
  2. Prélèvement d’expectorations humaines
    1. Prélever 1 à 3 ml d’expectorations pour toux profonde dans les voies respiratoires inférieures des sujets à l’aide de tubes d’échantillonnage stériles. Scellez immédiatement les tubes et transportez-les pour analyse. Traitez immédiatement les échantillons pour les analyser.
  3. Stockage des échantillons :
    1. Analysez rapidement les échantillons prélevés par la méthode ci-dessus. Le stockage à court terme est autorisé dans les conditions suivantes :
      2-8 °C : ≤7 jours
      -20 °C ± 5°C : ≤6 mois
      -70 °C ± 5°C : ≤24 mois
      REMARQUE : Dans cette étude, les échantillons d’expectorations n’ont pas été traités avec des agents de conservation (tels que le bouillon BHI + glycérol, etc.). Après la collecte, ils ont été entreposés dans les conditions décrites ci-dessus, et la congélation et la décongélation répétées ont été strictement évitées. Évitez les cycles de gel-dégel répétés. Nombre maximal de cycles de gel-dégel autorisés : ≤3.

2. Extraction des acides nucléiques

REMARQUE : Effectuez toutes les procédures à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité pour éviter toute contamination.

  1. Pour le prétraitement des échantillons d’expectorations, mélanger l’échantillon avec une solution de NaOH à 4 % dans un rapport de 1:4 (échantillon d’expectoration : solution de NaOH à 4 %) pour liquéfier les échantillons d’expectorations visqueuses et éliminer les impuretés interférentes, puis agiter à fond (30 s) et incuber à température ambiante (22-25 °C) pendant 30 min pour obtenir la liquéfaction.
  2. Préparation de réactifs d’extraction d’acides nucléiques
    1. Sortez la plaque préemballée à 96 puits du kit. Agitez légèrement la plaque à 96 puits pour concentrer les réactifs et les billes magnétiques au fond de la plaque à 96 puits.
    2. Déchirez soigneusement le film d’étanchéité en papier d’aluminium, en évitant de faire vibrer la plaque à 96 puits pour éviter les éclaboussures de liquide.
    3. Dans les solutions des colonnes 1 et 7 de la plaque à 96 puits : Ajouter d’abord 20 μL de protéinase K, puis ajouter 200-300 μL d’échantillon à extraire.
  3. Extraction automatisée des acides nucléiques (méthode à base de billes magnétiques)
    1. Placez la plaque préemballée à 96 puits avec les échantillons ajoutés dans la fente correspondante de l’instrument automatisé d’extraction d’acide nucléique.
    2. Suivez le processus d’extraction des acides nucléiques comme décrit ci-dessous.
      1. À l’aide de la baguette magnétique sur la chambre du laboratoire, transférez les billes magnétiques adsorbées avec de l’acide nucléique dans différents trous de réactif.
      2. Utilisez le kit d’agitation pour mélanger le liquide rapidement et à plusieurs reprises, afin que le liquide et les billes magnétiques se mélangent uniformément.
      3. Au fur et à mesure que le liquide et les billes magnétiques se combinent harmonieusement, la machine automatisée d’extraction d’acides nucléiques progresse à travers les étapes successives de la lyse cellulaire, de l’adsorption des acides nucléiques (70 °C, 15 min, 3 fois d’adsorption magnétique), du lavage (3 fois, mélanger pendant 2 min à chaque fois, puis d’effectuer deux fois l’adsorption magnétique (15 s chacune) et l’élution (2 fois, mélanger pendant 5 min à chaque fois, 3 fois l’adsorption magnétique), finalement, il obtient un acide nucléique de haute pureté.
      4. Validez la concentration et la pureté des acides nucléiques à l’aide d’un spectrophotomètre. Le volume de l’échantillon d’acide nucléique était de 50 μL, avec une concentration allant de 50 à 100 ng/μL, et le rapport A260/A280 étant de 1,8 ± 0,2.
    3. Une fois le programme terminé, aspirez directement la solution d’élution contenant de l’acide nucléique des colonnes 6 et 12 pour les tests ultérieurs. Si nécessaire, conservez les échantillons d’acides nucléiques extraits restants à -20 °C pour une conservation à long terme et une utilisation future.

3. Détection qPCR des acides nucléiques de S. aureus et des acides nucléiques du SARM

  1. Préparation des réactifs d’amplification
    1. Retirez la solution réactionnelle d’amplification des acides nucléiques et la solution réactionnelle nuc/mecA du kit (amorces/sondes spécifiques du gène nuc pour S. aureus et mecA pour le SARM). Après décongélation à 22-25 °C, osciller complètement et mélanger uniformément, puis effectuer une centrifugation instantanée (~6000 g, 15 s, 22-25 °C).
    2. En fonction du nombre d’échantillons à tester, N, préparer les réactifs en fonction de la quantité totale de N+2 (N est le nombre d’échantillons, et 2 sont les contrôles de qualité négatifs et positifs). Les étapes spécifiques sont les suivantes :
      1. Préparez le mélange du système réactionnel (16 μL de solution réactionnelle d’amplification des acides nucléiques (tampon, dNTPs, ADN polymérase, enzyme UDG) + 4 μL de solution réactionnelle nuc/mecA (amorces et sondes pour les gènes de détection des cibles nuc, mecA et la référence interne GAPDH).
      2. Ajoutez-le dans un tube à centrifuger de taille appropriée, oscillez complètement et mélangez uniformément, et effectuez une centrifugation instantanée (~6000 g, 15 s, 22 °C-25 °C). Ensuite, versez 20 μL par tube dans des tubes de réaction PCR.
  2. Ajouter des échantillons d’acide nucléique et de contrôle de la qualité :
    1. Dans les tubes de réaction PCR préparés ci-dessus (20 μL), respectivement, ajoutez 5 μL d’acide nucléique provenant des échantillons testés, du contrôle positif et du contrôle négatif, atteignant un volume final de 25 μL par tube.
    2. Fermez hermétiquement les tubes et effectuez une centrifugation instantanée (~6000 × g, 15 s, 22-25 °C), puis placez les tubes dans l’instrument PCR.
  3. Amplification PCR :
    1. Réglez le programme de cyclisme comme suit : Pré-dénaturation : 97 °C, 90 s, 1 cycle ; les 2 étapes suivantes pour 42 cycles : dénaturation à 97 °C pendant 2 s et recuit à 55 °C pendant 15 s.
    2. Réglez les paramètres de détection du signal de fluorescence comme suit : utilisez le marquage fluorescent FAM des gènes nuc ; Marquage par fluorescence VIC des gènes mecA ; et le marquage fluorescent CY5 du gène GAPDH comme contrôle interne du kit. Collectez des données à 55 °C. Une fois la réaction terminée, assurez-vous que les données sont sauvegardées pour une analyse future.
    3. Analysez les données à l’aide d’un logiciel spécifique à la qPCR (SLAN 96P) :
      1. Informations sur l’échantillon : Dans le schéma de disposition de la plaque de puits du logiciel, étiquetez les types d’échantillons (par exemple, contrôle positif, contrôle négatif, échantillon inconnu, gène de référence interne, etc.) correspondant aux positions de chargement de l’échantillon.
      2. Placement des tubes de réaction : Ouvrez le couvercle du module de chauffage de l’instrument, placez la ou les tubes PCR scellés fermement à l’intérieur, assurez-vous qu’ils s’adaptent parfaitement au module de chauffage et fermez bien le couvercle du module (pour éviter les irrégularités de température)
      3. Démarrage de la réaction : après avoir vérifié que les paramètres du programme dans le logiciel sont corrects, cliquez sur Démarrer l’exécution et enregistrez l’ID de l’expérience pour référence future.
      4. Arrêt de l’exécution et retrait des tubes : une fois le programme terminé, attendez que la température du module de chauffage descende en dessous de 50 °C, puis ouvrez le couvercle pour retirer la plaque ou les tubes PCR et manipulez correctement les échantillons.
  4. Analyse des données
    1. Avant l’analyse des données, confirmez trois résultats visuels : 1) Les courbes d’amplification de tous les échantillons (y compris le contrôle interne) montrent une forme en S typique, sans courbes ascendantes plates ou anormalement retardées ; 2) La ligne de seuil de fluorescence traverse la phase exponentielle des courbes, et les valeurs Ct du contrôle interne (par exemple, GAPDH) sont à ≤ 38 cycles (coefficient de variation < 5 %) ; 3) Des contrôles négatifs/positifs sont inclus tout au long de l’expérience pour surveiller la possibilité de contamination.
      1. Si l’expérience est hors de contrôle, vérifiez à nouveau l’ensemble du lot. Si un échantillon présente une amplification anormale (comme une courbe en S atypique ou une valeur Ct dans la plage critique), vérifiez à nouveau cet échantillon spécifique.
    2. Appelez les données expérimentales dans le logiciel, définissez le seuil et la ligne de base, et calculez les valeurs Ct automatiquement ou manuellement, car l’instrument sélectionne automatiquement le seuil de référence. Fixer la valeur finale de détermination positive au Ct ≤ 36 ; la plage de référence pour le gène de référence interne nécessite Ct ≤ 38. Confirmez que leurs courbes d’amplification présentent des profils caractéristiques en forme de S.

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Résultats

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Détection de S. aureus et du SARM à l’aide de la qPCR
Sur la base du gène nuc spécifique à l’espèce de S. aureus et du gène de résistance aux médicaments mecA du SARM, nous avons conçu des amorces et des sondes marquées avec des fluorophores distincts pour la détection de la qPCR. Tous les résultats du contrôle de la qualité tout au long des expériences de qPCR ont systématiquement été inférieurs aux seuils recommandés, ce qui confirme la fiabilité...

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Discussion

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La détection précise et précoce de la résistance à la méthicilline est essentielle pour le pronostic des infections causées par S. aureus. L’identification précoce de S. aureus et du SARM peut réduire l’utilisation abusive d’antibiotiques à large spectre et diminuer la pression sélective conduisant à l’émergence et à la propagation de la résistance bactérienne.

Les méthodes de détection phénotypiques traditionnelles, telles que la diffusion s...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Remerciements

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Cette étude a été financée par la Fondation de recherche médicale du Guangdong (A2025034). Ce travail a été soutenu par Shanghai BioGerm Medical Technology Co., Ltd. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Extracteur automatisé d’acides nucléiquesDAANIntelligent 32Pour l’extraction de l’ADN
BSC-1500IIA2-XBIOBASESEDA 20143222263Enceinte de biosécurité
E-CentrifugeuseWEALTECCentrifuger le liquide résiduel de la paroi du tube
Kit de détection du gène de résistance aux médicaments de Staphylococcus aureus résistant à la méthicillineBOJIEZC-HX-38-2Détection des gènes de résistance à Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline
Kit d’extraction d’acides nucléiquesBOJIETQ-BG-001-96BExtrait d’acide nucléique
SLAN Système d’analyse PCR médicale entièrement automatiqueHONGSHIAnalyse des données
SLAN-96S Machine PCR en temps réelHONGSHISLAN-96SAmplification quantitative par PCR fluorescente
Thermo Scientific NanoDropThermo ScientificNanoDrop OneAnalyse quantitative de l’ADN, de l’ARN et des protéines
Congélateurs à ultra-basse température (DW-YL450)MÉLANGESEDA 20172220091-20 ° ; C pour le stockage des réactifs
Vortex-5Kylin-bellPour mélanger le réactif

Références

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Mots-clés

Staphylococcus AureusMethicillin Resistant StaphylococcusMRSA DetectionMultiplex Real Time PCRFluorescent PCRBacterial Drug ResistanceRapid Pathogen DetectionmecA Genenuc GeneNosocomial Infections

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