Article de méthode

Un test LIVE/DEAD optimisé couplé à la cytométrie en flux pour quantifier la survie post-stress dans les cellules de levure

DOI :

10.3791/69005

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29 août 2025

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1Department of Biology, University of Iowa, 2Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons ici un protocole permettant de quantifier la survie post-stress dans des échantillons de levures. Le test utilise deux colorants fluorescents, SYTO 9 et l’iodure de propidium (PI), pour quantifier l’intégrité de la membrane plasmique. Il utilise la cytométrie en flux pour fournir des estimations quantitatives et reproductibles des fractions cellulaires vivantes, mortes et endommagées pour les échantillons de stress post-oxydatif.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La quantification de la survie est une tâche courante et critique dans la recherche sur les levures. Les colorants LIVE/DEAD basés sur l’intégrité de la membrane plasmique fournissent un test rapide et à haut débit pour la survie des levures lorsqu’ils sont associés à la cytométrie en flux. Cependant, les variations dans le tampon de coloration, la concentration du colorant, le temps d’incubation et les paramètres de cytométrie en flux peuvent avoir un impact sur la qualité et la reproductibilité des données. Ce protocole présente un test standardisé LIVE/DEAD pour la quantification de la survie post-stress chez la levure à l’aide de la cytométrie en flux. Après avoir traité Candida glabrata, un agent pathogène opportuniste de la levure, avec différentes doses de peroxyde d’hydrogène, les échantillons post-stress ont été colorés avec une coloration LIVE/DEAD à deux composants composée de SYTO 9 et d’iodure de propidium (PI). La cytométrie en flux a été utilisée pour distinguer les populations de cellules vivantes, endommagées et mortes et quantifier leurs pourcentages dans chaque échantillon. Les estimations de survie fondées sur la statistique du pourcentage de poissons vivants ont été comparées au résultat de l’unité formant colonie (UFC) sur le même échantillon. Les deux méthodes ont donné des résultats cohérents pour les échantillons traités à la dose simulée et létale (1 M, H, 2,O2). À la dose sublétale de 100 mM H2O2, SYTO 9/PI a estimé un taux de survie plus élevé que l’UFC, reflétant une différence clé entre les deux, où le protocole présenté ici évalue la survie cellulaire immédiatement après le stress, tandis que l’UFC quantifie le pourcentage de cellules capables de récupérer et de se reproduire. Par conséquent, ce protocole mesure la viabilité à un stade plus précoce du processus de mort cellulaire. En résumé, le protocole décrit ici fournit une alternative rapide et évolutive à l’UFC pour la quantification de la survie post-stress chez la levure. Ses résultats fournissent des informations complémentaires à l’UFC en évaluant la survie à un stade plus précoce et en distinguant les cellules mortes et endommagées.

Introduction

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Le sous-embranchement de la levure bourgeonnante contient de nombreux modèles biologiques et biotechnologiques importants. Une tâche courante et critique dans la recherche sur les levures consiste à quantifier l’effet des perturbations génétiques ou environnementales, ces dernières incluant le stress ou les traitements médicamenteux. Dans la fermentation industrielle, par exemple, les producteurs doivent surveiller la viabilité des cultures de levures pour s’assurer de l’efficacité et de la qualité du processus de fermentation 1,2. Lors de l’étude d’espèces de levures pathogènes, il est essentiel de mesurer leur survie après un traitement antifongique ou un stress pour comprendre la base génétique et mécaniste des traits liés à l’infection tels que la résistance aux antifongiques. La mesure de la survie sur les cathéters et les surfaces est également une tâche importante en milieu clinique3. Ces divers scénarios nécessitent tous des approches quantitatives capables de mesurer rapidement et précisément les résultats des traitements médicamenteux et du stress.

Les méthodes existantes pour atteindre l’objectif ci-dessus se répartissent en trois grandes catégories en fonction de ce qu’elles mesurent. La première catégorie mesure la clonogénicité, c’est-à-dire la capacité des cellules de levure individuelles à former une seule colonie à la suite du stress. La méthode représentative dans cette catégorie est le dosage des unités formant colonies (UFC). La deuxième catégorie mesure la vitalité, qui repose sur la détection des activités enzymatiques dans les cellules vivantes. Il s’agit par exemple de sondes chimiques telles que le FUN-1 dye4. La troisième catégorie de méthodes mesure l’intégrité de la membrane plasmique - une perte irréversible de l’intégrité de la membrane plasmique est considérée comme le « point de non-retour » de la mort cellulaire5. Des exemples de cette catégorie incluent les colorants fluorescents tels que l’iodure de propidium (PI).

Ce travail présente un test LIVE/DEAD optimisé couplé à la cytométrie en flux pour obtenir une quantification rapide et évolutive de la survie des levures après un traitement de stress. Ce test basé sur la perméabilité membranaire est plus rapide que l’UFC, prenant 15 à 30 minutes de coloration contre 24 à 48 heures d’incubation pour la formation des colonies. De plus, les échantillons colorés avec une coloration LIVE/DEAD peuvent être facilement analysés à l’aide de la cytométrie en flux en plus de la microscopie, qui mesure des dizaines de milliers de cellules en quelques secondes et peut facilement traiter des échantillons de 96 puits pour des tests à haut débit. Par conséquent, ce test est rapide, quantitatif et évolutif. Dans ce protocole, une coloration LIVE/DEAD à deux composants composée de SYTO 9 et de PI est utilisée pour obtenir un pouvoir de résolution amélioré. SYTO 9 marque toutes les cellules, vivantes ou mortes, tandis que l’IP ne pénètre que dans les cellules dont les membranes plasmiques sont compromises 6,7. Par conséquent, les cellules vivantes n’accumulent que SYTO 9 tandis que les cellules mortes accumulent à la fois SYTO 9 et PI. Parce que PI a une affinité plus élevée que SYTO 9 pour l’acide nucléique, il exclut compétitivement ce dernier dans la cellule8. De plus, les deux colorants forment une paire de transfert d’énergie de résonance de Förster (FRET), où l’émission de SYTO 9 est absorbée par PI sous forme d’excitation. En conséquence, les cellules mortes présentent une fluorescence verte sourde et une forte fluorescence rouge. En revanche, les cellules vivantes présentent une fluorescence vert vif8. Cette différence permet une meilleure différenciation entre cellules vivantes et cellules mortes en présence de variations d’intensité de fluorescence au sein de chaque groupe.

Depuis un premier rapport sur son application chez la levure en 2004, l’utilisation de SYTO 9/PI dans les études sur la levure a été inégale et largement limitée à des évaluations qualitatives utilisant la microscopie 7,9,10,11,12,13,14,15. L’une des principales limites à son adoption en tant qu’essai quantitatif pour la survie des levures est le manque de caractérisation et de comparaison systématiques avec des méthodes largement utilisées telles que l’UFC. Ce protocole décrit un test standardisé comprenant le tampon de coloration, la concentration de colorant, le temps de coloration et les paramètres de cytométrie en flux, qui se sont avérés minimiser les artefacts et générer des résultats reproductibles lorsqu’ils sont appliqués à C. glabrata et à deux autres espèces de levures16. Étant donné que la coloration SYTO 9/PI révèle une population intermédiaire de cellules « endommagées » qui diffèrent à la fois des cellules vivantes et mortes par leur modèle de coloration, elle peut compléter l’UFC en révélant des informations plus nuancées sur les effets du traitement du stress sur les cellules de levure, ce qui pourrait permettre de nouvelles applications.

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Protocole

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Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Application de la contrainte de peroxyde d’hydrogène

  1. Au moins un jour avant l’expérience, inoculer une culture de nuit de C. glabrata d’une seule colonie sur une plaque fraîchement striée dans 3 mL de milieu synthétique complet (SC) (1,7 g/L de base d’azote de levure, mélange complet d’acides aminés, 2 % p/v de glucose, eau), et cultiver le tube de verre en plaçant le tube de verre dans un tambour à roulettes et le faire croître à 30 °C. Alternativement, un agitateur orbital peut être utilisé en plaçant le tube de verre à un angle incliné et en secouant la culture à 200 tr/min.
    1. Mesurer la densité optique (OD600) de la culture de nuit le lendemain matin et la diluer avec un milieu SC frais àOD 600 ~ 0,2 dans un volume total de 10 mL. Laissez-le pousser pendant deux doublages, ce qui prend environ 4 h, pour atteindre la phase mi-log (OD600 ~1).
      EXEMPLE : Si une culture de nuit a une DOde 600 = 10, ajoutez 200 μL de cette culture à 9,8 mL de milieu SC.
  2. Dans les 30 minutes précédant le traitement du stress, préparez le milieu de stress au peroxyde d’hydrogène. Diluer en série le peroxyde d’hydrogène à partir de la couche à 30 % (9,798 M) dans un milieu synthétique complet (SC) jusqu’à la concentration souhaitée. Inclure un traitement simulé (SC sans peroxyde d’hydrogène ajouté) et une dose létale (1 M convient à C. glabrata).
    EXEMPLE : Pour fabriquer un milieu de stress de peroxyde d’hydrogène de 100 mM, ajoutez 10,3 μL de peroxyde d’hydrogène de 9,798 M à 1 mL de SC. Pipetez doucement pour mélanger. Pour fabriquer un média de stress de peroxyde d’hydrogène de 10 mM, diluez 500 μL de milieu de stress de peroxyde d’hydrogène de 100 mM dans 4,5 mL de SC.
  3. Mesurez la DO600 de la culture mi-log et normalisez-la, par exemple, à DO600 = 1, en ajoutant un milieu SC.
    EXEMPLE : La culture mi-log est à OD600 = 1,2. Ajouter 0,2 mL de milieu SC par 1 mL de culture.
  4. Transvaser 600 μL de culture mi-log par condition d’essai dans une plaque à 96 puits profonds. Cellules à granulés par centrifugation à 3 000 x g pendant 5 min à température ambiante. Retirez soigneusement le surnageant par aspiration sans perturber la cule cellulaire.
  5. Ajouter 600 μL de milieu de stress au peroxyde d’hydrogène préparé à l’étape 1.2 dans chaque puits et pipeter doucement pour remettre les cellules en suspension.
  6. Incuber la plaque pendant 120 min à 30 °C en secouant à 300 tr/min.
    REMARQUE : Le temps d’incubation dépend de la question biologique d’intérêt.

2. Application de la coloration SYTO 9/PI

  1. Avant l’expérience, préparer au moins 10 ml de tampon stérile de solution saline à 0,85 %.
    REMARQUE : Nous avons constaté qu’un tampon salin à 0,85 % produisait des artefacts de coloration minimes, c’est-à-dire des cellules non colorées et de type mort dans des échantillons traités de simulation, par rapport à de l’eau désionisée ou à un milieu de croissance16.
  2. Préparez une solution mère de PI à 0,2 mM en utilisant de l’eau stérile désionisée.
    REMARQUE : Ce stock de travail de PI peut être stocké jusqu’à 6 mois à 4 °C.
  3. Immédiatement avant l’expérience, préparer une solution mère de SYTO 9 fonctionnelle à 33,4 μM avec de l’eau stérile désionisée.
    REMARQUE : Préparez le matériau de travail SYTO 9 pour chaque expérience. Ne pas stocker et réutiliser.
  4. Pipetez doucement pour mélanger les cellules de chaque puits à partir de la plaque de traitement. Mesurez la DO600 de chaque condition de traitement et calculez la quantité de tampon nécessaire pour remettre les cellules en suspension à une DO600 de 1.
    REMARQUE : Des pipettes multicanaux peuvent être utilisées pour un mélange efficace et uniforme. Évitez de trop mélanger les échantillons.
  5. Prélever les cellules de levure après le traitement simulé ou le traitement de stress par centrifugation à 3 000 x g pendant 5 min. Éliminer le surnageant avec précaution par aspiration. Remettre les cellules en suspension dans un tampon salin stérile à 0,85 % à600 DO = 1 (calculé à l’étape 2.4).
    REMARQUE : Utilisez une pipette multicanaux pour remettre les cellules en suspension. Manipulez toutes les cultures post-traitement avec soin et évitez de trop mélanger.
  6. Réservez 50 μL de chaque échantillon pour servir de contrôle de coloration non colorée et à colorant unique.
    REMARQUE : Une autofluorescence minimale a été observée pour C. glabrata de type sauvage dans les deux canaux pour SYTO 9 et PI. Cependant, vérifiez toujours que les échantillons non colorés ne contiennent pas d’autofluorescence et effectuez une soustraction appropriée de l’arrière-plan ou utilisez un milieu de croissance à faible autofluorescence.
  7. Aliquote de 16 μL de l’échantillon de post-traitement remis en suspension dans un tampon salin à 0,85 % dans un tube PCR de 50 μL. Ajoutez 2 μL de la quantité active de 0,2 mM de PI dans la suspension de la cellule. Ajoutez ensuite 2 μL de la masse utile de 33,4 μM de SYTO 9 dans le même tube jusqu’à un volume final de 20 μL.
    1. Les concentrations finales de PI et de SYTO 9 seront respectivement de 20 μM et 3,34 μM. Pipeter doucement pour mélanger et incuber pendant 30 min dans l’obscurité (une boîte noire peut être utilisée) à température ambiante.

3. Mise en place et étalonnage du cytomètre en flux

REMARQUE : Cela doit être fait sur chaque nouvel instrument et également sur les nouvelles applications de la coloration SYTO 9/PI, y compris pour une espèce/souche différente, un nouveau facteur de stress ou un protocole de croissance, etc. Les paramètres ci-dessous ont été développés sur un cytomètre en flux Attune NxT. Reportez-vous au manuel d’utilisation de l’instrument utilisé pour des instructions spécifiques.

  1. Choisissez des canaux/filtres de fluorescence appropriés pour le cytomètre en flux : un filtre passe-bande 530 nm ± 30 nm (BL1) et un filtre passe-long 600 nm (> 600 nm, BL3) ont été utilisés pour collecter les signaux dans les canaux vert (SYTO 9) et rouge (PI et SYTO 9). Les deux ont été excités par un laser bleu de 488 nm.
  2. Réglez le débit à 200 μL/min et arrêtez-le lorsqu’au moins 30 000 événements ont été collectés.
    REMARQUE : Le nombre d’événements par échantillon peut être ajusté dans le but d’obtenir des estimations robustes des pourcentages. Les échantillons comportant trop peu d’événements (cellules) doivent être exclus. L’étape suivante consiste à ajuster les tensions sur les canaux FSC et SSC lors de la configuration initiale.
  3. Diluer 16 μL d’échantillon non coloré dans 200 μL de tampon salin stérile à 0,85 %. Pipeter doucement pour mélanger immédiatement avant la cytométrie en flux. Exécutez cet échantillon et ajustez les tensions des canaux FSC et SSC de sorte que la population soit au centre du FSC vs. Graphique de densité SSC.
    REMARQUE : Une tension de 345 mV et 399 mV a été utilisée pour le FSC et le SSC, respectivement. Les étapes suivantes consistent à ajuster les tensions sur les canaux de collecte (BL1 et BL3) lors de la configuration initiale.
  4. Mélanger 24 μL d’échantillon traité par simulation avec 24 μL d’échantillon traité au peroxyde d’hydrogène ou tué thermiquement 1000 mM.
  5. Divisez l’échantillon mixte de cellules vivantes et mortes dans trois tubes de 16 μL chacun. Teindre les trois tubes avec (1) 2 μL de SYTO 9 et 2 μL d’eau pendant 30 min ; (2) 2 μL d’IP et 2 μL d’eau pendant 30 min ; (3) 2 μL SYTO 9 et 2 μL PI pendant 30 min. Suivez le protocole de coloration de la section précédente.
    1. Après l’incubation, ajoutez 200 μL de tampon salin stérile à 0,85 % dans chaque tube. Ils sont maintenant prêts pour la cytométrie en flux.
  6. Tube de passage (1) pour ajuster la tension du canal de fluorescence verte (BL1) ; puis faire fonctionner le tube (2) pour ajuster la tension de la fluorescence rouge (BL3). L’objectif est d’avoir le mode de distribution de l’intensité de chaque canal ~104-10 5 afin d’utiliser toute la plage dynamique de l’instrument.
    REMARQUE : Veuillez suivre les instructions de votre cytomètre en flux spécifique lors du réglage des tensions. Certains cytomètres en flux ont des tensions fixes, et cette étape est omise.
  7. Faites fonctionner le tube (3) pour vérifier si les populations de cellules vivantes et mortes sont bien séparées. Ajustez les tensions des canaux BL1 ou BL3 si nécessaire.
    REMARQUE : Une tension de 200 mV a été utilisée pour les canaux BL1 et BL3 sur l’Attune NxT.
  8. Analysez l’échantillon non coloré traité fictif sous les réglages de tension établis pour garantir une autofluorescence minimale de l’échantillon dans les canaux d’intérêt (<102).

4. Analyse des échantillons sur le cytomètre en flux

  1. Appliquez les paramètres de cytomètre en flux établis ci-dessus et analysez d’abord l’échantillon non coloré pour vous assurer que les signaux d’autofluorescence sont inférieurs à 102 dans les canaux BL1 et BL3.
  2. Ajoutez 200 μL de tampon salin à 0,85 % à chaque échantillon coloré et faites-le fonctionner sur le cytomètre en flux.
    REMARQUE : Si plusieurs échantillons sont analysés, échelonnez l’étape de coloration de sorte que chaque échantillon soit coloré pendant 30 minutes avant d’être exécuté sur le cytomètre en flux.
  3. Exportez les résultats de la cytométrie en flux sous forme de fichiers .fcs (norme FCS 3.0 ou 3.1).

5. Analyse des données dans R

REMARQUE : Un exemple de script d’analyse est fourni en tant que fichier supplémentaire 1. Des exemples de stratégies de contrôle sont fournis dans la section Résultats représentatifs.

  1. Installez et chargez les paquets requis : (1) flowCore (2) ggplot2 (3) ggcyto.
  2. Importez des fichiers .fcs dans l’environnement R actuel.
  3. Ajustez les noms de fichiers et spécifiez les conditions de traitement.
  4. Faites un graphique de densité 2D pour tous les événements sur FSC. H contre SSC.H. Utilisez une porte polygonale pour exclure les événements non liés aux cellules. Nommez cette porte « cellules ».
    REMARQUE : Sur certains cytomètres en flux, le paramètre Surface est recommandé par rapport à la hauteur. Vérifiez les recommandations spécifiques à l’instrument.
  5. Pour la population « cellules » fermées, faites un graphique de densité 2D sur FSC. H contre FSC.W. En règle générale, deux groupes sont visibles avec des plages similaires de FSC. H mais différent FSC.W. Le cluster avec une FSC moyenne inférieure. Le niveau W contient les cellules simples (« singlets »). Dessinez une porte polygonale pour les sélectionner et nommez-la « singlets ».
  6. Pour la population fermée « singlets », faites un graphique de densité 2D sur BL1. H contre BL3.H. Dessinez des portes polygonales pour les populations vivantes, endommagées et mortes en fonction des contrôles de cellules vivantes et mortes. Un exemple est fourni dans la section Résultats représentatifs.
  7. Déterminez la survie à l’aide des pourcentages de chaque population et exportez les statistiques.

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Résultats

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La coloration SYTO 9/PI distingue les cellules de levure vivantes des cellules mortes en fonction de leurs signaux de fluorescence dans les canaux vert (500 nm-560 nm) et rouge (>600 nm). Les cellules vivantes, qui n’accumulent que SYTO 9, sont fortement fluorescentes dans le canal vert, avec un minimum de signaux rouges. Les cellules mortes accumulent à la fois SYTO 9 et PI et sont censées émettre une forte fluorescence dans le canal rouge, avec des sign...

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Discussion

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Ce protocole décrit un test LIVE/DEAD utilisant deux colorants fluorescents, SYTO 9 et PI, et utilisant la cytométrie en flux pour quantifier la survie post-stress chez la levure. Bien que ces deux colorants aient été appliqués pour évaluer la survie de diverses espèces de levures dans la littérature et soient disponibles sous forme de kit commercial, ni le manuel du fabricant ni la littérature ne fournissent suffisamment de détails sur le protocole de coloration ou les paramètres de cyt...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous tenons à remercier le Dr Michael Dailey et le Carver Center for Imaging pour leur formation et leur soutien à la microscopie. Nous tenons à remercier les membres passés et actuels du Laboratoire de régulation des gènes pour leurs précieux commentaires sur le protocole.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaque de puits profond à 96 puitsThermo Fisher278606NUNC 96
Cytomètre en flux Attune NxT avec lecteur de plaquesThermo Fisher A24858A24858Autoéchantillonneur (A42901)
Candida glabrataCG99, souche de laboratoire dérivée d’un isolat clinique (Cormack & Falkow, 1999)
FungaLight Yeast LIVE/DEAD KitThermo Fisher A24858L34952Contient SYTO 9 (3,34 mM) et du iodure de propidium (20 mM). Ces deux composants peuvent également être achetés séparément auprès de divers vendeurs.
Peroxyde d’hydrogèneSigma AldrichH1009
Leica Confocal SP8 MicroscopeLeicaTCS SP8 X
Chlorure de sodiumSigma AldrichS9888Utilisé pour fabriquer une solution stérilisée de NaCl à 0,85 %
Base azotée de levure sans acides aminésSigma AldrichY0626utilisé pour fabriquer le milieu synthétique complet avec un mélange à 2 % de glucose et d’acides aminés

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

Survie des levuresint grit de la membrane plasmiqueCandida glabratastress au peroxyde d hydrog nemarquage au SYTO 9iodure de propidiumunit formant colonie

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