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Extraction d'ARN optimisée à base de phénol chaud à partir de mycobactéries : une approche robuste pour une analyse fiable de l'expression génique

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11 septembre 2026

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1Amity Institute of Molecular Medicine and Stem Cell Research, Amity University Uttar Pradesh, 2Amity Institute of Genome Engineering, Amity University Uttar Pradesh

Dans cet article

Résumé

Cette étude optimise une méthode d'extraction d'ARN basée sur le phénol chaud pour Mycobacterium, produisant de l'ARN de haute qualité adapté aux analyses transcriptomiques. Comparée au TRIzol et au RNeasy dans des conditions identiques, cette méthode fournit un rendement plus élevé, une intégrité comparable et une meilleure efficacité économique, offrant ainsi une alternative pratique pour les études à grande échelle de l'expression génique.

Résumé

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) demeure une menace majeure pour la santé mondiale, soulignant la nécessité d'études transcriptomiques fiables afin de comprendre sa biologie et les mécanismes de résistance aux médicaments. Ces analyses dépendent de l'obtention d'ARN de haute qualité et à haut rendement. Bien que plusieurs méthodes d'extraction d'ARN soient disponibles, beaucoup nécessitent des réactifs coûteux, de grands volumes de culture ou un équipement spécialisé, ce qui limite leur pertinence pour des études à grande échelle, notamment dans les contextes à ressources limitées. Ici, une méthode optimisée d'extraction d'ARN basée sur le phénol chaud, spécifiquement adaptée aux mycobactéries, est présentée. Cette méthode utilise un volume minimal de culture et des réactifs couramment disponibles pour produire de manière reproductible de l'ARN de haute qualité, adapté à des applications transcriptomiques à haut débit. La quantité et l'intégrité de l'ARN ont été évaluées par électrophorèse sur gel et analyse de l'intégrité de l'ARN (RIN), et son aptitude aux applications en aval a été confirmée par qPCR et Qubit 4. Afin de comparer les performances de la méthode optimisée, une extraction d'ARN parallèle utilisant TRIzol et RNeasy a été réalisée dans des conditions expérimentales identiques, incluant la même espèce de Mycobacterium, le même volume de culture, la même phase de croissance (logarithmique et stationnaire) et les mêmes conditions de lyse. Cela a permis une comparaison directe du rendement, de la qualité, de la faisabilité et du coût. La méthode optimisée au phénol chaud a montré un rendement et une qualité d'ARN comparables, voire supérieurs, tout en réduisant significativement le coût des réactifs et la dépendance à l'égard d'équipements spécialisés. Grâce à son efficacité, sa reproductibilité et son accessibilité économique, ce protocole constitue une alternative pratique pour les études d'expression génique et transcriptomiques à grande échelle chez Mtb et d'autres espèces de mycobactéries.

Introduction

M. tuberculosis (Mtb), l'agent causal de la tuberculose (TB), reste la principale cause de décès due à un agent infectieux unique, dépassant le VIH/sida. En 2024, la TB a été responsable d'environ 1,3 million de décès dans le monde1. Ce fardeau est aggravé par la prévalence croissante des souches multirésistantes (MDR) et extrêmement résistantes aux médicaments (XDR). Il est donc urgent de comprendre la base moléculaire de la pathogenèse de la tuberculose et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques2.

Le profilage transcriptionnel de Mtb est devenu un outil important pour élucider les éléments fonctionnels impliqués dans les interactions hôte-pathogène3, l'adaptation au stress environnemental4, et les mécanismes sous-jacents à la résistance aux médicaments5. Des méthodologies avancées telles que la PCR en temps réel, les puces à ADN et le séquençage de l'ARN (ARN-séq) ont considérablement amélioré la capacité d'analyser le transcriptome mycobactérien6. Toutefois, la réussite de ces méthodes dépend fortement de la disponibilité d'ARN de haute qualité, ce qui, en retour, repose sur une lyse cellulaire efficace durant l'extraction. La paroi cellulaire complexe de Mtb, composée de mycolyl–arabinogalactane–peptidoglycane, rend l'extraction de l'ARN particulièrement difficile7. Les techniques de lyse existantes, notamment l'hydrolyse enzymatique8, la sonication9 et le broyage par billes10, nécessitent souvent des équipements coûteux et de grands volumes de culture, limitant ainsi leur praticabilité dans de nombreux laboratoires de niveau de sécurité biologique 3 (BSL-3). De plus, le taux de croissance lent de Mtb impose des durées de culture prolongées afin d'obtenir une biomasse suffisante11.

Pour surmonter ces limitations, une méthode optimisée d'extraction de l'ARN basée sur le phénol chaud, rapide et économique, a été mise au point. À partir de seulement 3 mL d'une culture en phase exponentielle, cette méthode permet d'obtenir entre 45 et 60 µg d'ARN de haute qualité, adapté à des analyses transcriptomiques en aval. La lyse cellulaire est réalisée à l'aide d'un broyeur tissulaire compact et manuel, ainsi que de réactifs facilement accessibles, éliminant ainsi le besoin d'instruments coûteux. Bien que la méthode au phénol chaud ait déjà été décrite précédemment11,12, la version optimisée améliore le confort d'utilisation, le rapport coût-efficacité et le rendement en ARN. L'optimisation a été effectuée avec M. smegmatis mc2155 (Msmeg) et validée avec succès sur Mtb H37Rv.

Protocole

Les réactifs et l'équipement utilisés sont listés dans le Tableau des matériaux.

1. Culture de Mycobacterium

  1. Inoculer 1 mL du stock de glycérol de Msmeg ou de Mtb dans 10 mL de milieu Middlebrook 7H9 supplémenté avec 0,2 % de glycérol, 0,05 % de Tween 80 et 10 % d'ADC à 37 °C sous agitation à 150 tr/min jusqu'à ce que l'OD atteigne 1–1,5.
  2. Faire croître la culture secondaire en ajoutant 1 % de la culture primaire dans 10 mL de milieu 7H9 jusqu'à la phase exponentielle moyenne, avec une OD600nm = 0,6–0,7.
  3. Répartir en aliquots de 3 mL et centrifuger les cultures à 2000 x g pendant 5 min à température ambiante (23–25 °C).
  4. Conserver les culots à -80 °C jusqu'à l'extraction de l'ARN.
    PRÉCAUTION : Pour les cultures de Mtb, respecter les consignes appropriées de niveau de sécurité biologique 3 (BSL3) et inactiver les culots par chaleur à 95 ˚C pendant 20–25 min.
    REMARQUE : Figure 1 montre le schéma des étapes de base suivies lors de l'extraction d'ARN par la méthode de phénol chaud.

Schéma de l'extraction d'ARN au phénol chaud ; le flux opératoire montre la centrifugation, la séparation des phases et l'analyse de l'intégrité de l'ARN.
Figure 1: Représentation schématique de la méthode au phénol chaud et de l'analyse. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

2. Extraction de l'ARN

  1. Méthode au phénol chaud (méthode HP)
    1. Ajouter 200 µL de tampon TES (100 mM Tris-HCl, pH 8,0 ; 5 mM EDTA, pH 8,0 ; 0,1 M NaCl ; % SDS ; 1 % β-mercaptoéthanol) au culot cellulaire et resuspendre le culot par vortexage.
    2. Ajouter environ 0,1 g de billes de silice de 0,1 mm à l'échantillon. Utiliser un homogénéisateur manuel pendant 10 à 15 s jusqu'à ce que le culot soit complètement décongelé sur glace. Répéter cette étape deux fois supplémentaires, en effectuant une congélation rapide dans l'azote liquide après chaque cycle.
    3. OU utiliser un rupteur à billes de table à haute vitesse pendant 1 min à la vitesse 5 (5,0 m/s) à température ambiante. Répéter cette étape trois fois et incuber l'échantillon sur glace pour éviter tout échauffement après chaque cycle.
      NOTE : Répéter la lyse des cellules de Mtb pendant 6 à 8 cycles (chaque cycle dure 1 min) avec un homogénéisateur manuel ou un rupteur à billes, en refroidissant intermittemment sur glace après chaque cycle. Utiliser de l'eau traitée au DEPC (diéthylpyrocarbonate) pour la préparation de tous les tampons et réactifs nécessaires à l'extraction de l'ARN.
    4. Ajouter 200 µL supplémentaires de tampon TES (préchauffé à 65 °C) à chaque échantillon afin d'obtenir un volume total de 400 µL. Ajouter à chaque échantillon 200 µL de phénol acide (phénol équilibré avec un tampon citrate 100 mM, pH 4,5) et 200 µL de chloroforme (mélanger le phénol acide et le chloroforme en proportions égales avant de les ajouter à l'échantillon).
    5. Incuber l'échantillon à 65 °C sur un bloc chauffant en agitant à 900 tr/min pendant 30 min, puis centrifuger à 12 000 x g pendant 15 min à température ambiante. Vérifier une séparation correcte des phases après centrifugation (on observera une phase aqueuse supérieure claire contenant l'ARN, une interphase bien définie contenant l'ADN et une phase organique inférieure contenant les protéines et les lipides).
    6. Prélever la phase aqueuse supérieure et la transférer dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 mL. Ajouter à nouveau un volume égal de phénol acide : chloroforme. Centrifuger à 12 000 x g pendant 15 min à température ambiante. Vérifier une séparation correcte des phases.
    7. Transférer la phase aqueuse supérieure dans un tube microcentrifuge propre de 1,5 mL, puis ajouter 30 µL de tampon acétate de sodium 3 M, pH 5,3, et 240 µL d'isopropanol glacé. Incuber à −80 °C pendant 30 min à 1 h.
      NOTE : Le tube microcentrifuge peut être conservé toute la nuit à −80 °C à cette étape. Sceller le tube microcentrifuge avec plusieurs couches de parafilm pour éviter qu'il ne s'ouvre à 65 °C pendant l'incubation.
      PRÉCAUTION : Le phénol et le chloroforme sont des produits chimiques dangereux ; par conséquent, il convient de porter des équipements de protection individuelle (EPI) appropriés, d'utiliser des dispositifs de protection collective tels que des hottes aspirantes et de suivre des procédures spécifiques de traitement des déchets.
    8. Centrifuger à 12 000 x g pendant 1 h à température ambiante. Vérifier la formation du culot et retirer soigneusement le surnageant sans perturber le culot.
    9. Resuspendre le culot dans 1 mL d'éthanol à 75 % et centrifuger à 12 000 x g pendant 1 min à température ambiante. Répéter cette étape deux fois et sécher le culot à l'air libre.
    10. Resuspendre le culot dans 50 µL d'eau sans nucléase.
      ​NOTE : Pour solubiliser l'ARN, l'incuber dans de l'eau sans RNase pendant 10 à 30 min à température ambiante.
  2. Méthode TRIzol
    1. Ajouter 200 µL de réactif TRIzol au culot cellulaire.
      PRÉCAUTION : Le TRIzol est un produit chimique dangereux ; par conséquent, il convient de porter des équipements de protection individuelle (EPI) appropriés, d'utiliser des dispositifs de protection collective tels que des hottes aspirantes et de suivre des procédures spécifiques de traitement des déchets.
    2. Suivre la méthode de lyse cellulaire décrite aux étapes 2.1.2 à 2.1.3.
    3. Ajouter 200 µL supplémentaires de réactif TRIzol, puis 200 µL de chloroforme, et vortexer pendant 1 min. Centrifuger à 13 400 x g pendant 15 min à 4 °C. Vérifier une séparation correcte des phases après centrifugation.
    4. Transférer soigneusement la phase aqueuse dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 mL.
    5. Précipiter l'ARN en ajoutant 500 µL d'isopropanol à la phase aqueuse et en incubant à −80 °C pendant 30 min à 1 h.
    6. Former un culot de l'ARN par centrifugation à 15 000 x g pendant 20 min à 4 °C. Observer attentivement le culot et retirer le surnageant sans perturber le culot.
    7. Resuspendre le culot dans 1 mL d'éthanol à 75 % et centrifuger à 13 400 x g pendant 1 min à 4 °C. Répéter cette étape deux fois, sécher le culot à l'air libre pendant 30 min à température ambiante, puis le resuspendre dans 50 µL d'eau sans nucléase.
  3. Méthode utilisant un kit d'extraction d'ARN disponible commercialement
    1. Resuspendre le culot cellulaire dans 200 µL de tampon de resuspension (fourni dans le kit).
    2. Suivre la méthode de lyse cellulaire décrite aux étapes 2.1.2 à 2.1.3.
    3. Effectuer les étapes suivantes conformément aux instructions du fabricant.

3. Traitement par la DNase, quantification et visualisation

  1. Pour éliminer la contamination par l'ADN génomique, ajouter 1 µL de DNase I (10 unités) et 5 µL de tampon RDD (1x) à chaque échantillon d'ARN et incuber à température ambiante pendant 30 min.
  2. Quantifier l'échantillon d'ARN par spectrophotométrie à l'aide d'un Nanodrop et évaluer l'intégrité de l'ARN à l'aide d'un Qubit4. La valeur acceptée de l'indice de qualité de l'ARN (RIN) se situe entre 7,5 et 10. Les valeurs acceptées du rapport A260/A280 et du rapport A260/A230 sont respectivement comprises entre 1,8 et 2,0, et entre 2,0 et 2,2.
  3. Visualiser l'ARN sur gel d'agarose à 1 % en utilisant un colorant de charge pour ARN à 1X.

4. Synthèse d'ADNc et PCR quantitative en temps réel

  1. Préparer une réaction de 20 µL pour la synthèse d'ADNc à l'aide du kit de transcription inverse d'ADNc et de 1 µg d'ARN, en suivant les instructions du fabricant dans un thermocycleur.
  2. Préparer une réaction de PCR en temps réel de 10 µL en utilisant 50 ng d'ADNc, 0,4 µM de chaque amorces et du SYBR selon les instructions du fabricant. Exécuter l'échantillon sur le thermocycleur PCR en temps réel.
    REMARQUE : Les amorces suivantes ont été utilisées pour l'analyse par qPCR :
    Mtb sigA Fw 5' cctcaaacagatcggcaagg 3', Mtb sigA Rv 5' cagatccacatcatgtcgcg 3'
    Mtb hsp70 Fw 5’ gctggtggacaagttcaagg 3', Mtb hsp70 Rv 5' ggtcagctgctcgtctaaga 3'
    Mtb16srRNA Fw 5' gcgatacgggcagactagag 3', Mtb16srRNA Rv 5' aaggaaggaaacccacacct 3'
    Ms. sigA Fw 5' gaagacaccgacctggaact 3', Ms.sigA ms Rv. 5' gactcttcctcgtcccacac 3'
    Ms. sigH Fw 5' gaagggttcccgtacaagg 3', Ms sigH Rv. 5' tcatgacgtcacctcctcg 3'
    Ms. sigE Fw 5' caccaccaaccttttcctcg 3', Ms. sigE Rv. 5' accctcgatgtcacacagg 3'

5. Analyse statistique

  1. Effectuer un test t de Student avec toutes les réplicats biologiques en utilisant Graph Pad Prism ; une valeur de P ≤ 0,05 a été considérée comme statistiquement significative. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard provenant d'au moins trois réplicats biologiques.

Résultats

Qualité et rendement de l'ARN

La qualité et la quantité d'ARN ont été évaluées par électrophorèse sur gel d'agarose (Figure 2). Des bandes distinctes et nettes correspondant aux ARNr 23S et 16S ont été observées pour toutes les méthodes d'extraction, confirmant l'isolement réussi d'ARN total. Les méthodes au phénol chaud et au TRIzol ont montré trois bandes claires représentant les ARNr 23S (~2900 pb), 16S (~1500 pb) et 5S (~120 pb), indiquant un ARN intact et de haute qualité. En revanche, la méthode utilisant un kit à colonne n'a montré que les bandes 23S et 16S, la bande d'ARNr 5S étant absente ou en dessous du seuil de détection, probablement en raison d'une perte préférentielle des petits ARN lors de la purification sur colonne. Sur le plan quantitatif, la méthode au phénol chaud a donné un rendement d'ARN supérieur de 1,5 à 2 fois par rapport aux méthodes TRIzol et RNeasy, respectivement (Figure 2A,C). Les rendements moyens étaient d'environ 60 µg pour le phénol chaud, environ 45 µg pour le TRIzol et environ 30 µg pour le RNeasy, ce dernier correspondant à un rendement inférieur d'environ 50 % par rapport au phénol chaud. Malgré ces différences de rendement, l'intégrité et la pureté de l'ARN étaient comparables entre les méthodes (Figure 2D,E).

Afin d'évaluer l'efficacité de l'approche de lyse, l'ARN a également été extrait à l'aide d'un rupteur à billes. Des rendements, une qualité et une intégrité comparables ont été obtenus, démontrant qu'une lyse efficace peut être réalisée à l'aide d'un broyeur manuel simple sans recourir à des équipements spécialisés tels qu'un rupteur/fragmentateur à billes (Figure 2B,F–H).

Étant donné que Mtb est plus résistant à la lyse que Msmeg, nous avons davantage validé la méthode optimisée au phénol chaud à l’aide de la souche Mtb H37Rv. La lyse cellulaire réalisée à l’aide du broyeur tissulaire et du rupteur à billes a permis d’obtenir de l’ARN avec un bon rendement, une bonne qualité et une bonne intégrité (Figure 3A–D), confirmant la robustesse de la méthode. Bien que l’extraction d’ARN à l’aide d’un broyeur tissulaire manuel ait donné un rendement inférieur (~35–45 µg/3 mL de culture) par rapport au rupteur à billes (50–60 µg/3 mL), cette différence n’a pas été statistiquement significative, et la quantité obtenue restait dans une plage acceptable, suffisante pour des études d’expression génique à grande échelle. Toutes les extractions d’ARN ont été répétées plusieurs fois, et tous les réplicats biologiques indépendants ont été présentés. Une analyse de densitométrie a été effectuée sur les images des gels, ce qui confirme davantage les différences statistiques dans le rendement d’ARN selon les différentes méthodes, la méthode au phénol chaud fournissant le rendement le plus élevé (Supplémentaire Figure 1A–D).

Pureté et intégrité de l'ARN

Toutes les méthodes ont produit de l'ARN avec des rapports A260/A280 acceptables d'environ 2,0, indiquant une contamination protéique minimale (Figure 2D). L'intégrité de l'ARN (RIN) était comparable entre toutes les méthodes, avec des valeurs variant de 7,5 à 10 (Figure 2D–H, supplémentaire Figure 2, panneau inférieur). Cela indique une bonne qualité, une intégrité élevée et une dégradation minimale.

Analyse par PCR quantitative pour vérifier la qualité de l'ARN

Afin d'évaluer l'aptitude de l'ARN extrait par chaque méthode à être utilisé dans des études ultérieures d'expression génique, une qRT-PCR a été réalisée. Nous avons étudié l'expression du gène ménageur Msmeg, mysA (MSMEG 2758) et deux régulateurs transcriptionnels, sigE (MSMEG 5072) et sigH (MSMEG 1914), en utilisant des quantités équivalentes d'ARN en entrée. Les valeurs de Ct (seuil de cycle) obtenues reflètent l'abondance relative d'ARN intact et amplifiable dans chaque échantillon. Comme indiqué dans (Figure 2I), les ARN extraits à l'aide de la méthode au phénol chaud et au TRIzol ont donné des valeurs de Ct comparables, comprises approximativement entre 22 et 25, reflétant une intégrité ARN plus élevée et une bonne compatibilité avec la transcription inverse et l'amplification. Bien que la méthode utilisant le kit ait présenté des valeurs de Ct légèrement plus élevées (~27–30), indiquant des niveaux inférieurs de transcrit détectable. L'analyse de la courbe de fusion a montré une amplification spécifique de mysA, sigE et sigH gènes, montrant la spécificité et l'efficacité de la qPCR (Figure supplémentaire 2, panneau supérieur). L'analyse par qPCR à l'aide de gènes de Mtb a également révélé des valeurs de Ct acceptables (~20–25), confirmant l'aptitude à des études ultérieures d'expression géniqueFigure 3E).

Comparaison de l'extraction d'ARN ; électrophorèse sur gel (28S, 18S, 5S) et histogrammes du rendement, du seuil de cycle (Ct) et de la pureté.
Figure 2: Comparaison des méthodes d'extraction d'ARN pour Mycobacterium. (AÉlectrophorèse sur gel d'agarose montrant l'ARN total extrait par les méthodes Hot Phenol, TRIzol et RNeasy. Des bandes distinctes d'ARNr 23S et 16S sont visibles dans tous les échantillons, indiquant un ARN intact.BÉlectrophorèse sur gel d'agarose montrant l'ARN total extrait par la méthode au phénol chaud via différentes méthodes de lyse, c'est-à-dire le rupteur à billes et le broyeur manuel de tissus. (CRendement total en ARN, montrant le rendement le plus élevé obtenu avec la méthode au phénol chaud, suivi de TRIzol et de la méthode par kit.DLa pureté de l'ARN a été évaluée par les rapports A260/A280, toutes les méthodes donnant des valeurs d'environ ~2,0, ce qui indique une contamination protéique minimale.E) nombre de réintégration de l'ARN (RIN) indiquant une intégrité comparable. (F–H) Comparaison du rendement en ARN, du ratio 260/280 et de l'intégrité de l'ARN entre des échantillons lysés à l'aide d'un homogénéisateur tissulaire manuel et d'un Bead Ruptor, puis purifiés par la méthode du phénol chaud.I) Valeurs de Ct issues de la qRT-PCR ciblant un gène de référence (par exemple, mysA) et facteurs transcriptionnels (sigE et sigHLes barres d'erreur représentent l'erreur standard de trois réplicats biologiques (n = 3). P-valeur calculée à l'aide du test t de Student test t. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Comparaison de l'extraction d'ARN de Mycobacterium, électrophorèse sur gel et graphiques en barres analysant le rendement et la pureté.
Figure 3 : Isolement d'ARN à partir de Mtb par la méthode au phénol chaud. (A) Électrophorèse sur gel d'agarose montrant l'ARN total extrait à l'aide d'un broyeur à billes et d'un homogénéisateur manuel de tissus, en utilisant la méthode optimisée au phénol chaud à partir de la souche Mtb H37Rv. (B–D) Comparaison des ARN isolés en termes de rendement, de rapport 260/280 et d'estimation de l'intégrité de l'ARN (RIN). (E) Valeurs de Ct obtenues par RT-qPCR ciblant les gènes sigA, l'ARNr 16s et hsp70. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard issue de trois réplicats biologiques (n = 3). La valeur P a été calculée à l'aide du test t de Student. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Phénol chaudTrizolKits RNeasy
Rendement60 -70 μg35 -50 μg30 - 45 μg
Durée2,5-3 h2-2,5 h30-45 min
Coût par réaction0,10 $ – 0,20 $1,50 $ – 2,00 $7,00 $ – 10,00 $
LimitationsLong, utilisation de dénaturants puissants (phénol/SDS)Long, réactifs hautement toxiques comme le Trizol, nécessité d'une centrifugeuse froide, 15 fois plus cher que la méthode au phénol chaudCoûteux (72 fois plus cher que la méthode au phénol chaud), rendement plus faible, colmatage des colonnes
AvantagesRendement plus élevé à partir d'un volume plus faible, faible coût, pas besoin d'homogénéisateur pour la lyse cellulaire, pas besoin de centrifugation froideRendement modéré et coût modéré, nécessité de centrifugation froideRendement modéré, très coûteux
Principaux facteurs de coûtRéactifs courants de laboratoire (composants du tampon TES, phénol acide, chloroforme, isopropanol, éthanol)Réactif commercial TRI Reagent®, chloroforme ou chloroforme : alcool isoamylique, isopropanol, éthanolColonnes tournantes et tampons propriétaires de Qiagen
RIN8-10 RIN7,5-10 RIN9-10 RIN

Tableau 1 : Comparaison des coûts, durées et limites de trois méthodes différentes d'extraction de l'ARN (méthodes Phénol chaud, TRIzol et RNeasy).

Figure supplémentaire 1 : Optimisation de l'extraction d'ARN. (A) Extraction d'ARN par la méthode au phénol chaud et lyse à l'aide d'un broyeur tissulaire manuel. (B) Extraction d'ARN à l'aide de TRIzol. (C) Extraction d'ARN selon la méthode RNeasy. (D) Analyse densitométrique des images de gel d'ARN extrait de Msmeg par différentes méthodes. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard calculée à l'aide de GraphPad Prism (n = 8). (E) Extraction d'ARN par la méthode au phénol chaud à partir de la souche Mtb. Toutes les images de gel correspondent à des réplicats biologiques indépendants. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : (panneau supérieur) Analyse des courbes de fusion de mysA, sigE, et sigH à partir de M. smeg, n = 3 ; (panneau inférieur) Analyse de l'intégrité de l'ARN. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Afin de développer une méthode simple et robuste d'extraction de l'ARN pour Mycobacterium, la méthode de la phénol chaud a été optimisée. Par la suite, l'ARN extrait a été comparé à deux approches largement utilisées : TRIzol et une méthode basée sur un kit à colonne12,13. Ces techniques ont été comparées selon le rendement, la pureté, l'intégrité de l'ARN, le coût et le temps de traitement afin d'évaluer leur praticabilité pour des applications moléculaires en aval. Les méthodes de la phénol chaud et de TRIzol, bien qu'elles soient relativement plus longues que la méthode basée sur un kit, ont produit un ARN intact et de haute qualité. Les trois méthodes ont fourni un ARN de pureté et d'intégrité comparables ; toutefois, la méthode de la phénol chaud a régulièrement donné un rendement d'ARN plus élevé. De plus, l'ARN extrait par la phénol chaud et par TRIzol a donné des valeurs de Ct similaires. Cependant, une différence statistiquement significative des valeurs de Ct a été observée entre les méthodes phénol chaud et RNeasy. Étant donné que des quantités égales d'ARN ont été utilisées dans l'expérience, des valeurs de Ct similaires étaient attendues pour toutes les méthodes. Les différences observées dans le cas de la méthode RNeasy pourraient être attribuées à des variations dans la chimie d'extraction de l'ARN. La phénol chaud et TRIzol sont des méthodes organiques qui sont souvent plus efficaces pour solubiliser des transcrits difficiles, tels que ceux codant des protéines membranaires intrinsèques ou des transcrits à forte teneur en GC. En revanche, RNeasy est une méthode basée sur des colonnes de silice et peut entraîner une récupération moindre de certains transcrits qui ne se lient pas efficacement à la membrane ou qui sont perdus lors des étapes de lavage, par rapport aux méthodes à base de phénol (Figure 2). De manière importante, des rendements d'ARN comparables ont été obtenus en utilisant soit un broyeur tissulaire manuel, soit un rupteur à billes pour la lyse cellulaire, permettant ainsi une flexibilité opérationnelle dans la réalisation de la lyse cellulaire. En outre, la méthode d'extraction a été optimisée pour fonctionner avec de faibles volumes de culture et sans nécessiter de centrifugation froide. Cette simplification améliore la facilité et l'efficacité globales du traitement des échantillons.

Un facteur important dans le choix d'une méthode d'extraction d'ARN est l'équilibre entre coût, temps et qualité du produit final (Tableau 1). La méthode au phénol chaud, bien qu'un peu longue, reste très rentable grâce à l'utilisation de réactifs courants en laboratoire et à sa capacité à produire de hauts rendements d'ARN (ARN de Msmeg : 60–70 µg et ARN de Mtb : 35–45 µg par 3 mL de culture en phase logarithmique intermédiaire), même à partir d'un faible volume de culture de 3 mL et sans recourir à un équipement sophistiqué de rupture par billes, comme cela est requis par la plupart des méthodes publiées jusqu'à présent. Cela la rend particulièrement avantageuse pour les laboratoires fonctionnant en conditions de ressources limitées. Les méthodes antérieures d'extraction d'ARN basées sur le phénol chaud diffèrent par plusieurs aspects essentiels. Par exemple, Mangan et al. ont utilisé M. bovis pour l'extraction d'ARN selon la méthode au phénol chaud, en obtenant un rendement d'environ 20 µg d'ARN par 109 cellules. Toutefois, des paramètres critiques tels que le volume de culture et la température d'extraction n'ont pas été clairement précisés. De plus, leur méthode inclut un lavage au détergent à l'aide de Divolab-1 avant la lyse mécanique des cellules, un réactif non facilement disponible, suivi d'une extraction au chloroforme et à l'alcool isoamylique11. Dans une autre méthode au phénol chaud, l'ARN a été extrait de cellules de Mtb, avec un rendement d'environ 39 µg d'ARN total, comparable à la méthode optimisée décrite ici. Toutefois, cette méthode nécessitait un volume de culture relativement élevé (25 mL), augmentant ainsi le temps de traitement et imposant l'utilisation de centrifugeuses plus grandes. En outre, l'extraction implique un mélange chloroforme–alcool isoamylique, et la température d'extraction n'est pas indiquée12,14. TRIzol est également largement utilisé pour obtenir un bon rendement et une bonne qualité d'ARN à un coût modéré15 ; toutefois, le rendement était comparativement faible. Le kit RNeasy offre un confort d'utilisation et une rapidité supérieurs, ce qui le rend adapté aux protocoles sensibles au temps ou aux utilisateurs moins expérimentés, mais à un coût nettement plus élevé que les deux autres méthodes, et le rendement était significativement faible. En résumé, la méthode décrite ici offre une flexibilité opérationnelle dans la lyse des cellules mycobactériennes et l'extraction subséquente d'ARN. Elle permet aux utilisateurs de choisir la méthode la plus adaptée à leurs priorités, qu'il s'agisse du coût et du rendement ou du temps de traitement, tout en maintenant une qualité et une intégrité comparables de l'ARN pour les trois méthodes.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêts. Tous les auteurs ont approuvé la soumission.

Remerciements

Je tiens à remercier le soutien fourni par le Département de la biotechnologie (DBT), le Conseil indien de la recherche médicale (ICMR) et le Conseil de recherche en sciences et ingénierie (SERB).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Billes de silice de 0,1 mmMP BiomedicalsMP116911050
2-propanolSigma278475
Bead Ruptor 4 revvity
ChloroformeSigma288306
Centrifugeuse froideThermoScientific42541217
DNase I qiagen79254
EDTAsigmaE02SS
HClSRL62889
Bloc chauffantMIULABMU-E02-1049
Kit de transcription inverse d'ADN complémentaire à haute capacité Thermo Fischer Scientific4368814
Moulinette tissulaire motorisée G10CoronG22616008
NaClsigmaS5886
Nanophotomètre N50 IMPLEMT51601
Phénol équilibré avec un tampon citrate 0,1 M, pH 4,5SigmaP4682
PowerUP SYBRApplied BiosystemsA25742
Fluoromètre Qubit 4 Invitrogen2.32262E+12
Cycleur thermique PCR en temps réelAnalytik Jena AG844-00503-2
Kit RNA easyQiagen74104
SDSSigmaS9888
Acétate de sodiumSigmaS2889
Cycleur thermique Biorad621BR29739
Réactif TRISigmaT9424
Base TrisHimediaMB029
β-mércaptoéthanolSigma516732

Références

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Extraction au ph nol chaudMycobacterium tuberculosistudes transcriptomiquesint grit de l ARNlectrophor se sur gelanalyse par qPCRcomparaison avec TRIzolcomparaison avec RNeasy
Extraction d'ARN optimisée à base de phénol chaud à partir de mycobactéries : une approche robuste pour une analyse fiable de l'expression génique
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