Extraction d'ARN optimisée à base de phénol chaud à partir de mycobactéries : une approche robuste pour une analyse fiable de l'expression génique

Résumé

Cette étude optimise une méthode d'extraction d'ARN basée sur le phénol chaud pour Mycobacterium, produisant de l'ARN de haute qualité adapté aux analyses transcriptomiques. Comparée au TRIzol et au RNeasy dans des conditions identiques, cette méthode fournit un rendement plus élevé, une intégrité comparable et une meilleure efficacité économique, offrant ainsi une alternative pratique pour les études à grande échelle de l'expression génique.

Résumé

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) demeure une menace majeure pour la santé mondiale, soulignant la nécessité d'études transcriptomiques fiables afin de comprendre sa biologie et les mécanismes de résistance aux médicaments. Ces analyses dépendent de l'obtention d'ARN de haute qualité et à haut rendement. Bien que plusieurs méthodes d'extraction d'ARN soient disponibles, beaucoup nécessitent des réactifs coûteux, de grands volumes de culture ou un équipement spécialisé, ce qui limite leur pertinence pour des études à grande échelle, notamment dans les contextes à ressources limitées. Ici, une méthode optimisée d'extraction d'ARN basée sur le phénol chaud, spécifiquement adaptée aux mycobactéries, est présentée. Cette méthode utilise un volume minimal de culture et des réactifs couramment disponibles pour produire de manière reproductible de l'ARN de haute qualité, adapté à des applications transcriptomiques à haut débit. La quantité et l'intégrité de l'ARN ont été évaluées par électrophorèse sur gel et analyse de l'intégrité de l'ARN (RIN), et son aptitude aux applications en aval a été confirmée par qPCR et Qubit 4. Afin de comparer les performances de la méthode optimisée, une extraction d'ARN parallèle utilisant TRIzol et RNeasy a été réalisée dans des conditions expérimentales identiques, incluant la même espèce de Mycobacterium, le même volume de culture, la même phase de croissance (logarithmique et stationnaire) et les mêmes conditions de lyse. Cela a permis une comparaison directe du rendement, de la qualité, de la faisabilité et du coût. La méthode optimisée au phénol chaud a montré un rendement et une qualité d'ARN comparables, voire supérieurs, tout en réduisant significativement le coût des réactifs et la dépendance à l'égard d'équipements spécialisés. Grâce à son efficacité, sa reproductibilité et son accessibilité économique, ce protocole constitue une alternative pratique pour les études d'expression génique et transcriptomiques à grande échelle chez Mtb et d'autres espèces de mycobactéries.

Introduction

M. tuberculosis (Mtb), l'agent causal de la tuberculose (TB), reste la principale cause de décès due à un agent infectieux unique, dépassant le VIH/sida. En 2024, la TB a été responsable d'environ 1,3 million de décès dans le monde¹. Ce fardeau est aggravé par la prévalence croissante des souches multirésistantes (MDR) et extrêmement résistantes aux médicaments (XDR). Il est donc urgent de comprendre la base moléculaire de la pathogenèse de la tuberculose et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques².

Le profilage transcriptionnel de Mtb est devenu un outil important pour élucider les éléments fonctionnels impliqués dans les interactions hôte-pathogène³, l'adaptation au stress environnemental⁴, et les mécanismes sous-jacents à la résistance aux médicaments⁵. Des méthodologies avancées telles que la PCR en temps réel, les puces à ADN et le séquençage de l'ARN (ARN-séq) ont considérablement amélioré la capacité d'analyser le transcriptome mycobactérien⁶. Toutefois, la réussite de ces méthodes dépend fortement de la disponibilité d'ARN de haute qualité, ce qui, en retour, repose sur une lyse cellulaire efficace durant l'extraction. La paroi cellulaire complexe de Mtb, composée de mycolyl–arabinogalactane–peptidoglycane, rend l'extraction de l'ARN particulièrement difficile⁷. Les techniques de lyse existantes, notamment l'hydrolyse enzymatique⁸, la sonication⁹ et le broyage par billes¹⁰, nécessitent souvent des équipements coûteux et de grands volumes de culture, limitant ainsi leur praticabilité dans de nombreux laboratoires de niveau de sécurité biologique 3 (BSL-3). De plus, le taux de croissance lent de Mtb impose des durées de culture prolongées afin d'obtenir une biomasse suffisante¹¹.

Pour surmonter ces limitations, une méthode optimisée d'extraction de l'ARN basée sur le phénol chaud, rapide et économique, a été mise au point. À partir de seulement 3 mL d'une culture en phase exponentielle, cette méthode permet d'obtenir entre 45 et 60 µg d'ARN de haute qualité, adapté à des analyses transcriptomiques en aval. La lyse cellulaire est réalisée à l'aide d'un broyeur tissulaire compact et manuel, ainsi que de réactifs facilement accessibles, éliminant ainsi le besoin d'instruments coûteux. Bien que la méthode au phénol chaud ait déjà été décrite précédemment^11,12, la version optimisée améliore le confort d'utilisation, le rapport coût-efficacité et le rendement en ARN. L'optimisation a été effectuée avec M. smegmatis mc²155 (Msmeg) et validée avec succès sur Mtb H37Rv.

Protocole

Les réactifs et l'équipement utilisés sont énumérés dans le Tableau des matériaux.

1. Culture de Mycobacterium

1. Inoculer 1 mL du stock de glycérol de Msmeg ou de Mtb dans 10 mL de milieu Middlebrook 7H9 supplémenté avec 0,2 % de glycérol, 0,05 % de Tween 80 et 10 % d'ADC à 37 °C sous agitation à 150 tr/min jusqu'à ce que l'OD atteigne 1–1,5.
2. Faire croître la culture secondaire en ajoutant 1 % de la culture primaire dans 10 mL de milieu 7H9 jusqu'à la phase exponentielle moyenne, avec un OD_600nm = 0,6–0,7.
3. Répartir en aliquots de 3 mL et centrifuger les cultures à 2000 x g pendant 5 min à température ambiante (23–25 °C).
4. Conserver les culots à -80 °C jusqu'à l'extraction de l'ARN.
   PRÉCAUTION : Pour les cultures de Mtb, respecter les consignes appropriées de niveau de sécurité biologique 3 (BSL3) et inactiver les culots par chaleur à 95 ˚C pendant 20–25 min.
   REMARQUE : Figure 1 montre le schéma des étapes de base suivies lors de l'extraction de l'ARN par la méthode de phénol chaud.

Figure 1 : Représentation schématique de la méthode au phénol chaud et de l'analyse. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

2. Extraction de l'ARN

1. Méthode au phénol chaud (méthode HP)
   1. Ajouter 200 µL de tampon TES (100 mM Tris-HCl, pH 8,0 ; 5 mM EDTA, pH 8,0 ; 0,1 M NaCl ; % SDS ; 1 % β-mercaptoéthanol) au culot cellulaire et resuspendre le culot par vortexage.
   2. Ajouter environ 0,1 g de billes de silice de 0,1 mm à l'échantillon. Utiliser un homogénéisateur manuel pendant 10 à 15 s jusqu'à ce que le culot soit complètement décongelé sur glace. Répéter cette étape deux fois supplémentaires, en effectuant une congélation rapide dans l'azote liquide après chaque cycle.
   3. OU utiliser un rupteur à billes de table à haute vitesse pendant 1 min à la vitesse 5 (5,0 m/s) à température ambiante. Répéter cette étape trois fois et incuber l'échantillon sur glace pour éviter tout échauffement après chaque cycle.
      NOTE : Répéter la lyse des cellules de Mtb pendant 6 à 8 cycles (chaque cycle dure 1 min) avec un homogénéisateur manuel ou un rupteur à billes, en refroidissant intermittemment sur glace après chaque cycle. Utiliser de l'eau traitée au DEPC (diéthylpyrocarbonate) pour la préparation de tous les tampons et réactifs nécessaires à l'extraction de l'ARN.
   4. Ajouter 200 µL supplémentaires de tampon TES (préchauffé à 65 °C) à chaque échantillon afin d'obtenir un volume total de 400 µL. Ajouter à chaque échantillon 200 µL de phénol acide (phénol équilibré avec un tampon citrate 100 mM, pH 4,5) et 200 µL de chloroforme (mélanger le phénol acide et le chloroforme en proportions égales avant de les ajouter à l'échantillon).
   5. Incuber l'échantillon à 65 °C sur un bloc chauffant en agitant à 900 tr/min pendant 30 min, puis centrifuger à 12 000 x g pendant 15 min à température ambiante. Vérifier une séparation correcte des phases après centrifugation (on observera une phase aqueuse supérieure claire contenant l'ARN, une interphase distincte contenant l'ADN et une phase organique inférieure contenant les protéines et les lipides).
   6. Prélever la phase aqueuse supérieure et la transférer dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 mL. Ajouter à nouveau un volume égal de mélange phénol acide : chloroforme. Centrifuger à 12 000 x g pendant 15 min à température ambiante. Vérifier une séparation correcte des phases.
   7. Transférer la phase aqueuse supérieure dans un tube microcentrifuge propre de 1,5 mL, puis ajouter 30 µL de tampon acétate de sodium 3 M, pH 5,3, et 240 µL d'isopropanol glacé. Incuber à −80 °C pendant 30 min à 1 h.
      NOTE : Le tube microcentrifuge peut être conservé toute la nuit à −80 °C à cette étape. Sceller le tube microcentrifuge avec plusieurs couches de parafilm pour éviter qu'il ne s'ouvre à 65 °C pendant l'incubation.
      PRÉCAUTION : Le phénol et le chloroforme sont des produits chimiques dangereux ; par conséquent, il convient de respecter les équipements de protection individuelle (EPI) appropriés, les mesures de contrôle techniques telles que les hottes aspirantes et les procédures spécifiques d'élimination des déchets.
   8. Centrifuger à 12 000 x g pendant 1 h à température ambiante. Vérifier la formation du culot et retirer soigneusement le surnageant sans perturber le culot.
   9. Resuspendre le culot dans 1 mL d'éthanol à 75 % et centrifuger à 12 000 x g pendant 1 min à température ambiante. Répéter cette étape deux fois et sécher le culot à l'air libre.
   10. Resuspendre le culot dans 50 µL d'eau sans nucléase.
       ​NOTE : Pour solubiliser l'ARN, l'incuber dans de l'eau sans RNase pendant 10 à 30 min à température ambiante.
2. Méthode TRIzol
   1. Ajouter 200 µL de réactif TRIzol au culot cellulaire.
      PRÉCAUTION : Le TRIzol est un produit chimique dangereux ; par conséquent, il convient de respecter les équipements de protection individuelle (EPI) appropriés, les mesures de contrôle techniques telles que les hottes aspirantes et les procédures spécifiques d'élimination des déchets.
   2. Suivre la méthode de lyse cellulaire décrite aux étapes 2.1.2 à 2.1.3.
   3. Ajouter 200 µL supplémentaires de réactif TRIzol, puis 200 µL de chloroforme, et vortexer pendant 1 min. Centrifuger à 13 400 x g pendant 15 min à 4 °C. Vérifier une séparation correcte des phases après centrifugation.
   4. Transférer soigneusement la phase aqueuse dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 mL.
   5. Précipiter l'ARN en ajoutant 500 µL d'isopropanol à la phase aqueuse et en incubant à −80 °C pendant 30 min à 1 h.
   6. Former le culot d'ARN par centrifugation à 15 000 x g pendant 20 min à 4 °C. Observer soigneusement le culot et retirer le surnageant sans le perturber.
   7. Resuspendre le culot dans 1 mL d'éthanol à 75 %, puis centrifuger à 13 400 x g pendant 1 min à 4 °C. Répéter cette étape deux fois, sécher le culot à l'air libre pendant 30 min à température ambiante, puis le resuspendre dans 50 µL d'eau sans nucléase.
3. Méthode utilisant un kit d'extraction d'ARN disponible commercialement
   1. Resuspendre le culot cellulaire dans 200 µL de tampon de resuspension (fourni dans le kit).
   2. Suivre la méthode de lyse cellulaire décrite aux étapes 2.1.2 à 2.1.3.
   3. Effectuer les étapes suivantes conformément aux instructions du fabricant.

3. Traitement par la DNase, quantification et visualisation

1. Pour éliminer la contamination par l'ADN génomique, ajouter 1 µL de DNase I (10 unités) et 5 µL de tampon RDD (1x) à chaque échantillon d'ARN et incuber à température ambiante pendant 30 min.
2. Quantifier l'échantillon d'ARN par spectrophotométrie à l'aide d'un Nanodrop et évaluer l'intégrité de l'ARN à l'aide d'un Qubit4. La valeur acceptée du RIN se situe entre 7,5 et 10. Les valeurs acceptées du rapport A₂₆₀/A₂₈₀ et du rapport A₂₆₀/A₂₃₀ se situent respectivement entre 1,8 et 2,0, et entre 2,0 et 2,2.
3. Visualiser l'ARN sur gel d'agarose à 1 % en utilisant un colorant de charge ARN 1X.

4. Synthèse d'ADNc et PCR quantitative en temps réel

1. Préparer une réaction de 20 µL pour la synthèse d'ADNc à l'aide du kit de transcription inverse d'ADNc et de 1 µg d'ARN, en suivant les instructions du fabricant dans un thermocycleur.
2. Préparer une réaction de PCR en temps réel de 10 µL en utilisant 50 ng d'ADNc, 0,4 µM de chaque amorces et du SYBR selon les instructions du fabricant. Exécuter l'échantillon sur le thermocycleur PCR en temps réel.
   REMARQUE : Les amorces suivantes ont été utilisées pour l'analyse par qPCR :
   Mtb sigA Fw 5' cctcaaacagatcggcaagg 3', Mtb sigA Rv 5' cagatccacatcatgtcgcg 3'
   Mtb hsp70 Fw 5’ gctggtggacaagttcaagg 3', Mtb hsp70 Rv 5' ggtcagctgctcgtctaaga 3'
   Mtb16srRNA Fw 5' gcgatacgggcagactagag 3', Mtb16srRNA Rv 5' aaggaaggaaacccacacct 3'
   Ms. sigA Fw 5' gaagacaccgacctggaact 3', Ms.sigA ms Rv. 5' gactcttcctcgtcccacac 3'
   Ms. sigH Fw 5' gaagggttcccgtacaagg 3', Ms sigH Rv. 5' tcatgacgtcacctcctcg 3'
   Ms. sigE Fw 5' caccaccaaccttttcctcg 3', Ms. sigE Rv. 5' accctcgatgtcacacagg 3'

5. Analyse statistique

1. Effectuer un test t de Student avec toutes les réplicats biologiques à l'aide de Graph Pad Prism ; une valeur de P ≤ 0,05 a été considérée comme statistiquement significative. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard provenant d'au moins trois réplicats biologiques.

Résultats

Qualité et rendement de l'ARN

La qualité et la quantité d'ARN ont été évaluées par électrophorèse sur gel d'agarose (Figure 2). Des bandes nettes et bien définies correspondant aux ARNr 23S et 16S ont été observées pour toutes les méthodes d'extraction, confirmant une isolation réussie d'ARN total. Les méthodes au phénol chaud et au TRIzol ont montré trois bandes claires représentant les ARNr 23S (~2900 pb), 16S (~1500 pb) et 5S (...

Discussion

Afin de développer une méthode simple et robuste d'extraction de l'ARN pour Mycobacterium, la méthode de la phénol chaud a été optimisée. Par la suite, l'ARN extrait a été comparé à deux approches largement utilisées : TRIzol et une méthode basée sur un kit à colonne^12,13. Ces techniques ont été comparées selon le rendement, la pureté, l'intégrité de l'ARN, le coût et le temps de traitement afin d'évaluer leur praticabilité pour des applications molécula...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Billes de silice de 0,1 mm	MP Biomedicals	MP116911050
2-propanol	Sigma	278475
Bead Ruptor 4	revvity
Chloroforme	Sigma	288306
Centrifugeuse froide	ThermoScientific	42541217
DNase I	qiagen	79254
EDTA	sigma	E02SS
HCl	SRL	62889
Bloc chauffant	MIULAB	MU-E02-1049
Kit de transcription inverse d'ADN complémentaire à haute capacité	Thermo Fischer Scientific	4368814
Moulinette tissulaire motorisée G10	Coron	G22616008
NaCl	sigma	S5886
Nanophotomètre N50	IMPLEM	T51601
Phénol équilibré avec un tampon citrate 0,1 M, pH 4,5	Sigma	P4682
PowerUP SYBR	Applied Biosystems	A25742
Fluoromètre Qubit 4	Invitrogen	2.32262E+12
Cycleur thermique PCR en temps réel	Analytik Jena AG	844-00503-2
Kit RNA easy	Qiagen	74104
SDS	Sigma	S9888
Acétate de sodium	Sigma	S2889
Cycleur thermique	Biorad	621BR29739
Réactif TRI	Sigma	T9424
Base Tris	Himedia	MB029
β-mércaptoéthanol	Sigma	516732