Ce protocole présente une méthode pour évaluer l’apoptose médiée par les espèces réactives de l’oxygène (ROS) induite par des composés naturels dans les cellules du cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC).
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Ce protocole présente une méthode pour évaluer l’apoptose médiée par les espèces réactives de l’oxygène (ROS) induite par des composés naturels dans les cellules du cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC).
Cette étude explore le potentiel anticancéreux de Pileostegia tomentella, en mettant l’accent sur sa capacité à induire l’apoptose classique dans les cellules H1299 du cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC) par des voies médiées par des espèces réactives de l’oxygène (ROS). À l’aide d’une approche d’isolement guidée par la bioactivité, deux composés actifs, l’ombelliférone (UMB) et l’épi-Vogeloside, ont été identifiés comme les principaux constituants cytotoxiques. Les deux composés ont montré des effets inhibiteurs significatifs sur la viabilité cellulaire et ont effectivement déclenché la mort cellulaire apoptotique dans les cellules H1299. Des études mécanistes ont démontré que le traitement par l’UMB et l’épi-Vogeloside entraînait une augmentation marquée des niveaux de ROS intracellulaires, impliquant le stress oxydatif comme médiateur clé. L’analyse par transfert Western a révélé une augmentation des niveaux de caspase-3 clivée et une diminution de l’expression de la protéine anti-apoptotique Bcl-2, indiquant l’activation de la voie apoptotique mitochondriale intrinsèque. De plus, le profilage transcriptomique a montré des altérations généralisées de l’expression des gènes, ce qui a renforcé la perturbation de l’homéostasie cellulaire. Ces résultats suggèrent que Pileostegia tomentella et ses constituants actifs sont prometteurs en tant qu’agents thérapeutiques potentiels pour le cancer du poumon.
Le cancer représente un formidable défi de santé publique à l’échelle mondiale, caractérisé par un taux de mortalité annuel important. Le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) est le principal facteur mondial de décès liés au cancer, représentant environ 85 % de l’incidence du cancer du poumon1. La cancérogenèse, une interaction intrinsèquement complexe de processus moléculaires et cellulaires, est influencée de manière critique par les perturbations de l’homéostasie des espèces réactives de l’oxygène (ROS). Les ROS, qui comprennent des oxydants instables tels que les anions superoxydes, les radicaux hydroxyles et le peroxyde d’hydrogène, sont des sous-produits du métabolisme cellulaire normal et exécutent des fonctions essentielles de signalisation, de prolifération, de différenciation et d’apoptose2. Un déséquilibre des concentrations de ROS peut précipiter le stress oxydatif, activant potentiellement les voies de mort cellulaire programmées, notamment l’autophagie et l’apoptose, entravant ainsi la prolifération et la survie des cellules cancéreuses3. Par conséquent, les ROS jouent un double rôle en oncologie, agissant à la fois comme promoteurs et suppresseurs de la progression tumorale. Au cours de la dernière décennie, les stratégies thérapeutiques pour le CPNPC ont considérablement progressé, le développement de nouveaux agents anticancéreux conçus pour exploiter cette nature dichotomique des ROS représentant un domaine d’investigation particulièrement dynamique4.
De nombreux agents anticancéreux synthétisés chimiquement, tels que l’adriamycine (doxorubicine), le cisplatine et le cyclophosphamide, sont connus pour induire l’apoptose dans les cellules cancéreuses en favorisant la production de ROS5. Malgré les progrès réalisés dans le domaine des thérapies ciblées et des anticorps immunothérapeutiques, la chimiothérapie à base de platine continue d’être la pierre angulaire du traitement des patients atteints de CPNPC. Néanmoins, l’émergence d’une résistance et d’effets secondaires indésirables de la chimiothérapie nécessite le développement de nouveaux médicaments anti-CPNPC. Par conséquent, l’exploration de sources naturelles de composés anticancéreux est de plus en plus reconnue pour son importance et son potentiel. Des recherches récentes ont mis en évidence que certains extraits de plantes et leurs composants actifs présentent de puissantes propriétés anticancéreuses, caractérisées par une faible toxicité, une spécificité élevée et la capacité de cibler plusieurs voies6. Notamment, certains de ces composés naturels peuvent moduler les niveaux de ROS et la signalisation7, induisant ainsi l’autophagie ou l’apoptose dans les cellules cancéreuses et exerçant des effets thérapeutiques 8,9.
Pileostegia tomentella Main. Le zucc, une plante herbacée vivace du genre Clematis de la famille des Buttercupaceae, se trouve principalement dans des régions comme le Japon, la Corée du Nord et la Chine. Les différents composants de la plante, y compris les racines, les tiges, les feuilles et les fleurs, sont connus pour leurs propriétés médicinales, offrant des avantages tels que l’évacuation de la chaleur, la détoxification, la réduction de l’enflure, le soulagement de la douleur et des effets antibactériens et anti-inflammatoires. Des recherches récentes ont mis en lumière les activités anticancéreuses des extraits ou des ingrédients actifs de Hoshi Hairy Vine, démontrant des effets suppresseurs de tumeurs sur une gamme de cancers, notamment le gliome, le cancer du sein, du côlon et du col de l’utérus10. Cependant, les mécanismes anticancéreux spécifiques de Pileostegia tomentella, en particulier son rôle potentiel dans la modulation des ROS pour induire l’autophagie ou l’apoptose dans les cellules cancéreuses, restent largement inexplorés.
Malgré l’intérêt croissant pour les composés naturels pour le traitement du cancer, les mécanismes pro-apoptotiques des constituants clés de Pileostegia tomentella dans le cancer du poumon restent inexplorés. Cette étude a été pionnière dans l’identification et la dissection mécaniste de l’ombelliférone et de l’épi-Vogeloside en tant qu’inducteurs sélectifs de l’apoptose dépendants des ROS dans le CPNPC.
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Les réactifs et l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.
1. Composition chimique de Pileostegia tomentella et prédiction de la cible du CPNPC
Les constituants chimiques de Pileostegia tomentella ont été analysés à l’aide d’une chromatographie liquide à haute performance combinée à une spectrométrie de masse Orbitrap (HPLC-LTQ/MS). Les extraits ont été dissous dans des solvants appropriés et filtrés avant l’injection. La séparation chromatographique a été réalisée à l’aide d’une colonne en phase inverse sous un programme d’élution par gradient adapté aux classes de composés. Les données de spectrométrie de masse ont été recueillies en mode d’ionisation positive par électronébulisation sur une gamme de masse de 100 à 1500 m/z. Les structures moléculaires des composés identifiés ont été dessinées à l’aide d’un logiciel générique de dessin chimique et enregistrées au format SDF. Ces fichiers structurels ont été soumis à un outil de prédiction de cibles en ligne afin d’identifier des cibles biologiques potentielles, les 20 principales cibles étant sélectionnées pour une validation plus approfondie. Les cibles associées au CPNPC ont été extraites d’une base de données de gènes accessible au public. Les cibles qui se chevauchent dans les deux ensembles de données ont été identifiées comme des cibles thérapeutiques potentielles de Pileostegia tomentella.
2. Construction d’un réseau composant-cible
Les données d’interaction protéine-protéine pour les cibles prédites ont été obtenues à partir d’une base de données d’interaction protéique en libre accès. Les données d’interaction ont été importées dans un logiciel général de visualisation de réseau pour construire le réseau d’interaction composé-cible. Les propriétés topologiques du réseau, y compris le degré de centralité, l’intermédiarité et la proximité, ont été analysées à l’aide d’outils analytiques intégrés pour identifier les principaux nœuds régulateurs.
3. Analyse de l’enrichissement de la voie KEGG
L’enrichissement fonctionnel des protéines cibles prédites a été réalisé à l’aide de l’analyse de la voie KEGG à l’aide d’outils d’enrichissement accessibles au public et de logiciels statistiques. Les trajectoires avec des valeurs p ajustées inférieures à 0,05 ont été considérées comme significatives. Des voies significatives ont été intégrées aux données composé-cible pour construire un réseau d’interaction « composé-cible-voie » à l’aide d’un logiciel générique de visualisation de réseau. L’analyse de la topologie du réseau a mis en évidence les principaux centres de régulation biologique, illustrant les mécanismes multi-composants et multi-cibles de Pileostegia tomentella.
4. Extraction des constituants de Pileostegia tomentella
Des tiges de vigne séchées de Corydalis spinosa ont été broyées en une fine poudre. Le matériau en poudre a été extrait avec de l’éthanol à 70 % sous traitement par ultrasons à température ambiante pendant une période définie. L’extrait brut a été filtré et concentré sous pression réduite. La répartition liquide-liquide a été effectuée à l’aide de solvants de polarité croissante, notamment l’éther de pétrole, l’acétate d’éthyle et le n-butanol. La fraction d’acétate d’éthyle, qui a montré la plus grande activité biologique dans les essais préliminaires, a été recueillie, concentrée, lyophilisée et stockée à -20 °C jusqu’à nouvel ordre.
5. Lignées cellulaires et conditions de traitement
La lignée cellulaire H1299 du cancer du poumon humain a été cultivée dans un milieu RPMI 1640 complété par 10 % de sérum fœtal bovin à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2. Les cellules ont été ensemencées à une densité appropriée et laissées adhérer toute la nuit avant le traitement. Les cellules ont été exposées à des concentrations variables (500 μg/mL, 750 μg/mL et 1 000 μg/mL) de deux composés d’essai, l’UMB et l’épi-Vogeloside, tels qu’énumérés dans le tableau 1. Après 24 h d’incubation dans des conditions de culture standard, les cellules ont été récoltées pour des analyses ultérieures afin d’évaluer les effets biologiques des composés.
6. Test MTT pour la viabilité cellulaire
Les effets cytotoxiques des composés ont été évalués à l’aide d’un test colorimétrique MTT. Les cellules H1299 ont été ensemencées dans des plaques de 96 puits à une densité définie et laissées adhérer pendant la nuit. Les cellules ont ensuite été traitées avec les composés d’essai pendant 72 h dans des conditions de culture standard. Après le traitement, une solution de MTT a été ajoutée à chaque puits et incubée pour permettre aux cellules viables de convertir le MTT en cristaux de formazan violet insolubles. Après l’incubation, le milieu a été retiré et les cristaux de formazan ont été dissous dans du diméthylsulfoxyde (DMSO). L’absorbance a été mesurée à 570 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques. Les valeurs d’absorbance correspondent à la viabilité cellulaire, fournissant une évaluation quantitative de la cytotoxicité des composés.
7. Évaluation de l’intégrité de la membrane par libération de LDH
L’intégrité de la membrane cellulaire a été évaluée en mesurant la libération de lactate déshydrogénase (LDH) comme indicateur de cytotoxicité. Les cellules H1299 ont été traitées avec les composés d’essai pendant 24 h, 48 h ou 72 h. À chaque point temporel, des surnageants de culture ont été collectés et soumis à un test d’activité LDH conformément au protocole du fabricant. Étant donné que la LDH n’est libérée que par les cellules dont les membranes sont endommagées, les valeurs d’absorbance mesurées reflètent l’étendue des dommages membranaires induits par les composés au fil du temps.
8. Analyse cytométrique en flux de l’apoptose
L’induction de l’apoptose a été évaluée par cytométrie en flux à l’aide de la coloration à l’annexine V et à la 7-aminoactinomycine D (7-AAD). Après le traitement avec les composés d’essai, les cellules H1299 ont été collectées par centrifugation, lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate froid et remises en suspension dans un tampon de liaison. Les cellules ont ensuite été incubées avec de l’Annexine V conjuguée à un colorant fluorescent et au 7-AAD selon le protocole de coloration. Les échantillons ont été immédiatement analysés par cytométrie en flux. Cette méthode a permis la différenciation entre les cellules viables (non colorées), les cellules apoptotiques précoces (annexine V positive, 7-AAD négative) et les cellules apoptotiques ou nécrotiques tardives (positives pour les deux colorations).
9. Quantification des ROS intracellulaires
Les niveaux d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) intracellulaires ont été mesurés à l’aide d’un test basé sur la fluorescence. Les cellules H1299 ont été ensemencées dans des plaques de 12 puits à une densité de 1 × 10 à5 cellules par puits et cultivées jusqu’à ce qu’elles atteignent environ 80 % de confluence. Les cellules ont ensuite été traitées avec les composés désignés pendant 72 h. Après le traitement, les cellules ont été incubées avec 1 μM de diacétate de diacétate de 2',7'-dichlorodihydrofluorescéine sensible aux ROS (DCFH-DA) à 37 °C pendant 30 min dans l’obscurité. Après l’incubation, les cellules ont été récoltées et l’intensité de la fluorescence a été mesurée à une longueur d’onde d’émission de 525 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques à fluorescence. L’intensité de fluorescence correspond aux niveaux de ROS intracellulaires.
10. PCR quantitative en temps réel (RT-qPCR)
Les cellules H1299 ont été ensemencées dans des plaques de 6 puits à une densité de 2 × 10 à5 cellules par puits et cultivées jusqu’à ce qu’elles atteignent environ 80 % de confluence. Les cellules ont ensuite été traitées avec les composés désignés pendant 72 h. L’ARN total a été extrait à l’aide d’une méthode phénol-chloroforme largement utilisée. La synthèse de l’ADN complémentaire (ADNc) a été réalisée à l’aide d’un kit de transcription inverse selon les instructions du fabricant. La PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) a été réalisée à l’aide d’un système de PCR en temps réel avec des amorces spécifiques (énumérées dans le tableau 2). Les niveaux relatifs d’expression génique ont été calculés à l’aide de la méthode Ct comparative, les gènes d’entretien étant utilisés comme contrôles internes.
11. Immunoblot pour l’expression des protéines
L’analyse par transfert Western a été effectuée sur des cellules H1299 cultivées et traitées. Les protéines totales ont été extraites à l’aide d’un tampon de lyse approprié, et les lysats ont été clarifiés par centrifugation à 10 000 × g pendant 15 min à 4 °C. Les concentrations en protéines ont été déterminées à l’aide d’un test spectrophotométrique. Des quantités égales de protéines de chaque échantillon ont été séparées par SDS-PAGE et transférées sur une membrane de difluorure de polyvinylidène (PVDF). Les membranes ont été bloquées avec du lait écrémé en poudre à 5 % pendant 2 h à température ambiante, puis incubées pendant la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires spécifiques de Bcl-2, caspase-3, PARP1, BAX, GAPDH et tubuline à des dilutions optimisées. Après le lavage, les membranes ont été incubées avec des anticorps secondaires appropriés pendant 2 h à température ambiante. Les bandes de protéines ont été visualisées et imagées à l’aide d’un substrat chimiluminescent. L’analyse densitométrique a été effectuée à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images, et les intensités de bande ont été normalisées en GAPDH et en tubuline comme contrôles de charge.
12. Microscopie d’immunofluorescence de la caspase-3
L’expression et la localisation subcellulaire de la caspase-3, une protéine apoptotique clé, ont été évaluées par coloration par immunofluorescence. Après le traitement, les cellules H1299 ont été fixées avec du paraformaldéhyde, perméabilisées avec une solution détergente douce et incubées avec un anticorps primaire contre la caspase-3. Un anticorps secondaire marqué par fluorescence a ensuite été appliqué pour détecter le signal de l’anticorps primaire. Les noyaux cellulaires ont été contre-colorés à l’aide d’un colorant fluorescent de liaison à l’ADN. Les cellules colorées ont été visualisées au microscope à fluorescence. L’intensité et la distribution cellulaire du signal de fluorescence ont fourni des informations qualitatives et spatiales sur l’activation de la caspase-3, soutenant son implication dans la réponse apoptotique induite par le composé.
13. Séquençage transcriptomique
Pour établir le profil de la réponse transcriptionnelle cellulaire aux composés testés, l’ARN total a été extrait des cellules H1299 traitées et évalué l’intégrité à l’aide de méthodes de contrôle de la qualité standard. Les banques de séquençage ont été préparées selon des protocoles établis et soumises à un séquençage à haut débit à l’aide d’une plate-forme de séquençage de nouvelle génération. Les données de séquençage brutes ont été traitées par un pipeline bio-informatique conventionnel, qui comprenait le filtrage de contrôle de la qualité, l’alignement sur le génome de référence et la quantification de l’abondance des transcrits. Une analyse différentielle de l’expression génique a été effectuée pour identifier les gènes présentant des changements statistiquement significatifs dans l’expression après le traitement. Des analyses d’enrichissement et de voie des gènes exprimés différentiellement ont été effectuées pour élucider les principaux processus biologiques affectés par les composés, fournissant ainsi un aperçu transcriptomique complet de leurs effets moléculaires.
14. Analyse statistique
Toutes les données sont exprimées en moyenne ± écart-type (ET) d’au moins trois expériences indépendantes. La signification statistique entre les groupes a été déterminée à l’aide de méthodes standard, y compris le test t de Student ou l’ANOVA à un facteur, le cas échéant. Les différences ont été considérées comme statistiquement significatives pour les valeurs P inférieures à 0,05.
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Dépistage des composants clés de Pileostegia tomentella contre le cancer du poumon
La figure 1 donne un aperçu de la conception expérimentale. La spectrométrie de masse HPLC-LTQ/Orbitrap a été utilisée pour caractériser sept principaux constituants bioactifs présents chez Pileostegia tomentella (tableau 3). Par la suite, une prédiction cible in silico a été réalisée sur ces composés à l’aide de la base d...
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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Ce travail a été soutenu par le Projet de construction de disciplines clés de haut niveau de la médecine traditionnelle chinoise - Pharmacie des minorités ethniques (Pharmacie Zhuang) de l’Administration d’État de la médecine traditionnelle chinoise (n° zyyzdxk-2023165) ; le programme de culture des talents « Projet jeunesse » de l’hôpital médical international Zhuang du Guangxi (n° 2022001) ; le projet d’équipe multidisciplinaire d’innovation croisée en médecine chinoise du Guangxi (No. GZKJ2309) ; le programme d’équipe d’innovation de culture des talents de haut niveau de l’Université de médecine traditionnelle chinoise du Guangxi (n° 2022A008) ; le projet clé de recherche et de développement du Département des sciences et de la technologie du Guangxi (n°. Gui Ke AB21196057) ; le plan d’action triennal 2023 pour la construction d’une équipe de talents de haut niveau de l’hôpital médical international Zhuang du Guangxi (n° GZCX20231203, GZCX20231202) ; le troisième lot du programme de culture d’équipe de talents de haut niveau « Projet Qihuang » de l’Université de médecine traditionnelle chinoise du Guangxi (n° 202414).
CONTRIBUTION DE L’AUTEUR :
Wen Zhong, Leimin Jiang et Bing Qing ont contribué à parts égales à ce travail et en partagent la première paternité. Ils étaient principalement responsables de la conception expérimentale, de l’acquisition des données et de l’interprétation des résultats. Xiumei Ma a effectué l’analyse des données et a contribué à la préparation du manuscrit. Shi Xianyi, Deng Qingmei et Zhou Guangyun ont participé à la conception de l’étude, à la collecte de données et à la recherche documentaire. Jiangcun Wei, l’auteur correspondant, a supervisé l’analyse et l’interprétation des données et a joué un rôle de premier plan dans la rédaction et la révision du manuscrit.
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| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Annexine V&ndash ; Kit de détection de l’apoptose PE / 7-AAD | BD Biosciences | 556547 | Détection de l’apoptose basée sur la cytométrie de flux |
| Anticorps : BAX | Abcam | AB32503 | Western blot pour protéine pro-apoptotique |
| Anticorps : Bcl-2 | Abcam | AB182858 | Western blot/immunofluorescence |
| Anticorps : Caspase-3 clivée | Abcam | AB32042 | Western blot / IF |
| Anticorps : GAPDH | Abcam | AB8245 | Contrôle interne dans le Western blot |
| Anticorps : PARP1 | Abcam | AB32064 | Western blot pour marqueur d’apoptose |
| Anticorps : tubuline | Abcam | AB78078 | Contrôle interne dans le Western blot |
| ChemDraw | PerkinElmer Informatics | CCG821391 | Dessin de la structure de petites molécules |
| Système d’imagerie par chimiluminescence | Tanon Science & Technologie | Tanon 5200 | Pour visualiser les bandes protéiques |
| Cytoscape | Cytoscape.org | https://cytoscape.org | Construction et analyse du réseau |
| Coloration nucléaire DAPI | Sigma ; | D9542 | Contre-coloration nucléaire bleue pour IF |
| DAVID | NIH | https://david.ncifcrf.gov | Annotation fonctionnelle et enrichissement de la voie KEGG |
| DMSO | Sigma ; | MFCD00002089 | Utilisé pour dissoudre les cristaux de formazan |
| Éthanol (pour l’extraction) | Sigma | MFCD00003568 | Solvant d’extraction assistée par ultrasons |
| Acétate d’éthyle | Sigma | MFCD00009171 | Utilisé pour le fractionnement bioactif |
| Anticorps secondaire conjugué à la FITC | Abcam | AB6785 | Utilisé en immunofluorescence |
| Cytomètre en flux | Thermo Scientific | A29001 | Utilisé pour l’apoptose et la détection des ROS |
| Fluorescence Microscope | Olympus Corporation | BX53F | Pour l’imagerie des lames d’immunofluorescence |
| Lyophilisateur | Société Labconco | 7670520 | Pour la lyophilisation et la conservation des échantillons |
| Cartes GeneCards | Institut Weizmann | https://www.genecards.org | Base de données génétiques pour la pertinence de la maladie |
| Spectrométrie de masse HPLC-LTQ-Orbitrap | Thermo Scientific | IQLAAEGAAVFACZMAIK | Identification des composés par MS |
| Plateforme de séquençage Illumina NovaSeq | Illumina Inc. | 20012850 | Utilisé pour le séquençage de l’ARN |
| Kit de dosage de cytotoxicité LDH | Beyotime | Réf. C0016 | Pour la mesure de la libération de LDH en tant qu’indicateur de cytotoxicité |
| Lecteur de microplaques | Thermo Scientific | VL0000D0 | Pour les mesures d’absorbance dans les dosages MTT et LDH |
| Kit de test de viabilité cellulaire MTT | Beyotime ; | C0009S | Utilisé pour le dosage MTT afin d’évaluer la viabilité cellulaire |
| Machine qPCR | Thermo Scientific | 4485701 | Pour l’analyse de l’expression génique |
| Logiciel R | Fondation R | https://www.r-project.org | Calcul statistique et traçage de trajectoires |
| Kit de transcription inverse (kit RT) | Vazyme | MR201 | Pour la synthèse de l’ADNc |
| Kit de préparation de bibliothèque RNA-seq | Illumina Inc. | 20020594 | Préparation de la bibliothèque pour le séquençage |
| SwissTargetPrediction | Institut suisse | http://www.swisstargetprediction.ch | Outil de prédiction de cibles composées |
| Mélange qPCR vert SYBR | Vazyme | Référence n° Q311-02 | Pour la PCR quantitative |
| Réactif TRIzol (extraction de l’ARN) | Sigma ; | Réf. T3934 | Pour l’extraction totale de l’ARN |
| Nettoyeur à ultrasons | Branson | M1800-CPXH | Pour l’extraction assistée par ultrasons |
| Appareil de Western Blot | Thermo Scientific | Réf. A56727 | Électrophorèse sur gel et transfert de protéines |
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