Article de méthode
Cet article étudie l’effet du muscone, le principal composant du musc, sur la prolifération et l’apoptose des cellules de Schwann. Les résultats préliminaires illustrent le mécanisme potentiel du musc réduisant l’activité de la voie NF-κB en inhibant l’IL-1R1 pour atténuer les lésions de stress oxydatif dans la paralysie de Bell.
Le mécanisme sous-jacent de la façon dont le musc naturel traite la paralysie de Bell n’est pas clair. Cette étude vise à révéler le mécanisme potentiel du musc dans le traitement des lésions nerveuses périphériques in vitro. Pour ce faire, un modèle de lésions dues au stress oxydatif a été établi dans des cellules de Schwann (SC) à l’aide de chlorure de cobalt (CoCl2). Afin d’évaluer les effets protecteurs de Muscone (Mus) sur cette lésion et d’explorer son mécanisme, des tests de viabilité cellulaire, de transfection de siRNA, d’immuno-absorption enzymatique (ELISA), d’amplification en chaîne par polymérase à transcription inverse quantitative (qRT-PCR), de western blot, de coloration par immunofluorescence et d’analyse ultrastructurale des cellules ont été utilisés. En conséquence, il est indiqué que l’intervention de Mus a amélioré la prolifération des cellules souches souches et de l’ARNm S-100b en cas d’hypoxie, tout en réduisant les espèces réactives de l’oxygène (ROS) et en augmentant les niveaux de superoxyde dismutase (SOD). Mus a amélioré le stress oxydatif et l’inflammation dans les SC hypoxiques en réduisant l’IL-1β et le TNF-α. De plus, Mus a modulé des indicateurs clés impliqués dans le métabolisme de l’oxygène, la réparation cellulaire et le neurométabolisme, y compris C-JUN et GDNF. L’IL-1R1, localisée à la membrane SC, a été régulée à la hausse par l’hypoxie, mais significativement à la baisse après l’intervention de Mus. Mus a également inhibé l’expression des composants de la voie NF-κB (IRAK1, IKK, p65, p50) et augmenté IκB-α. De manière critique, l’abolition de l’expression de l’IL-1R1 via l’inactivation de l’ARNi a montré un effet cohérent avec Mus. Il est conclu qu’en supprimant l’IL-1R1, Mus atténue l’inflammation dans les SC hypoxiques par l’inhibition de la voie NF-κB. Cette étude a indiqué le rôle de l’IL-1R1 dans le dysfonctionnement du CS induit par l’hypoxie. De plus, Mus pourrait être un médicament potentiellement efficace pour traiter la paralysie de Bell.
Le muscone (Mus), le 3-méthylcyclopentadécanone, a été isolé de l’extrait naturel de musc de cerf dès 19061. Le musc, une médecine traditionnelle chinoise (MTC) précieuse et efficace, a des effets curatifs étendus tels que la détumescence, l’anti-inflammation, la réanimation et la promotion de la circulation sanguine2. La MTC contenant du musc a été utilisée pour une variété de maladies courantes, notamment les maladies du système nerveux central3, la désintoxication4, les tumeurs gastro-intestinales5, l’hépatite virale6 et les maladies coronariennes7, etc. En tant qu’ingrédient pharmaceutique actif du musc, Mus a montré d’excellents effets biologiques impliquant l’anti-inflammation8, l’anti-oxydation 8,9, la réparation des dommages neuronaux et le soulagement de l’infarctus du myocarde10, etc. D’un point de vue mécaniste, des études ont montré que Mus peut réduire la libération de cytokines inflammatoires telles que l’interleukine (IL)-1β, l’IL-6, le facteur de nécrose tumorale (TNF)-α, les espèces réactives de l’oxygène (ROS)1,8, et réguler la protéine kinase activée par les mitogènes (MAPK), le facteur nucléaire kappa-light-chain-enhancer des cellules B activées (NF-κB), l’AKT/cible mécaniste de la rapamycine (mTOR) et la voie CaN/Erk1/21, 8, 11, etc.
En Chine, il a été rapporté que certains médecins ont traité avec succès la paralysie de Bell avec du musc naturel selon des documents antérieurs et l’expérience clinique 12,13,14,15. Mus n’est pas un médicament recommandé dans les directives de diagnostic et de traitement, mais dans les domaines médicaux sous-développés ou pour certaines personnes qui ne peuvent pas utiliser de stéroïdes ou de médicaments antiviraux, Mus peut être une autre option privilégiée. L’analyse de la littérature de ces dernières années montre également que le musc est la médecine chinoise la plus fréquemment utilisée dans les ordonnances de patchs de médecine chinoise publiées et les études ponctuelles d’acupuncture pour le traitement de la paralysie faciale périphérique16. Bien qu’il existe de nombreuses études pharmacologiques et médicales sur Mus, on ne sait toujours pas comment le musc a guéri exactement la paralysie de Bell et quels sont les mécanismes neurochimiques et biologiques cellulaires sous-jacents.
La paralysie de Bell, une paralysie faciale idiopathique aiguë, résulte d’un dysfonctionnement du nerf facial périphérique, qui innerve tous les muscles faciaux. Le signe le plus visible des symptômes de la paralysie de Bell est la faiblesse et l’affaissement des muscles faciaux d’un côté. Bien que la paralysie faciale de Bell ne mette pas la vie en danger, elle peut affecter la qualité de vie du patient et même provoquer de l’anxiété et de la dépression. Ce qui est particulièrement inquiétant, c’est que jusqu’à 30 % des patients souffrent de séquelles à long terme, notamment de synkinésie, de contracture, de parésie faciale permanente et d’asymétrie faciale, même avec un traitement approprié. Par conséquent, trouver la résolution de la paralysie de Bell et diminuer le risque de paralysie sont nos principaux objectifs. Les connaissances actuelles sur le mécanisme pathogène de la paralysie de Bell restent floues. Des recherches récentes ont démontré que la réactivation des virus peut être la principale cause de paralysie de Bell, et que ces virus peuvent provoquer un œdème neuronal et une inflammation pour déclencher l’attaque de la paralysie de Bell.
En nous appuyant sur des preuves récentes, nous avons émis l’hypothèse que Mus atténue les symptômes de la paralysie de Bell en améliorant les dommages causés par le stress oxydatif au nerf facial. Cette étude a indiqué expérimentalement les effets thérapeutiques de Mus, révélant que l’IL-1R1 régulée à la hausse dans les SC active la voie NF-κB, causant des dommages cellulaires. De manière cruciale, nous avons démontré que Mus inhibe la signalisation NF-κB en régulant à la baisse l’IL-1R1. Nos résultats ont identifié le rôle de la régulation positive de l’IL-1R1 chez les SC exposés au stress oxydatif in vitro et ont positionné l’administration de Mus comme une nouvelle stratégie thérapeutique.
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Cette recherche expérimentale a été menée avec l’approbation du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (numéro d’approbation : LL-240077).
Culture cellulaire et intervention médicamenteuse
Des cellules Schwann de rat ont été cultivées dans un milieu cellulaire Schwann, composé d’un milieu basal, de 5 % de sérum de veau fœtal, de 1 % de supplément de croissance cellulaire de Schwann, de 1 % de pénicilline et de 1 % de streptomycine. Toutes les cellules ont été conservées dans une atmosphère à 5 % de CO2 à 37 °C. Lorsqu’on les a laissés croître jusqu’à une densité de 70 à 80 %, les SC ont été divisés en quatre groupes (n = 5 par groupe) : (1) groupe NC ; (2) groupe NC+CoCl2 ; (3) groupe NC+CoCl2+Mus ; (4) Groupe NC+CoCl2+siIL-1R1+Mus.
Le chlorure de cobalt (CoCl2), un agent fréquemment utilisé pour imiter l’hypoxie, est connu pour déclencher des réponses similaires à celles de l’hypoxie, telles que l’obstruction de la dégradation et de la stabilisation des facteurs induits par l’hypoxie et l’accumulation de la protéine HIF-1α15. Selon la méthode modifiée basée sur Osuru et al.17, dans le groupe NC+CoCl2 et le groupe NC+CoCl2+Mus, des CS ont été cultivés dans un milieu cellulaire Schwann complété par 240 μM de CoCl2 pendant 8 h, dans des conditions atmosphériques de 95 % d’air et de 5 % de CO2 à 37 °C dans un incubateur humidifié (21 % O2). Ensuite, dans les groupes Mus, l’intervention de 1,25 μg/mL de Mus pendant 24 h supplémentaires a été appliquée. Pendant ce temps, dans le groupe NC+CoCl2+siIL-1R1+Mus, les SC ont d’abord été traités avec 24 h d’infection par siRNA, puis cultivés en continu avec 240 μM CoCl2 pendant 8 h, suivis de l’intervention de 1,25 μg/mL Mus pendant 24 h supplémentaires, comme dans les groupes précédents. L’organigramme du processus expérimental est illustré à la figure 1.
Essai de viabilité cellulaire
La viabilité des CS a été déterminée à l’aide du réactif de dosage du kit de comptage cellulaire-8 (CCK-8) conformément aux instructions du fabricant. Des CS cultivés à une densité de 5 × 105 cellules/puits ont été ensemencés dans une plaque de culture cellulaire de 96 puits avec 100 μL de milieu de croissance complet à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2 . Lorsque la confluence a atteint 70-80 %, 10 μL de solution de CCK-8 ont été ajoutés à chaque puits, et les plaques ont été incubées pendant 1 h à 37 °C. La densité optique (DO) des plaques de 96 puits a été mesurée à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques, et la viabilité de la cellule a été calculée. Les cellules ont été divisées en quatre groupes : groupe NC, groupe NC+CoCl2 , groupe NC+CoCl2+Mus et groupe NC+CoCl2+siIL-1R1+Mus. Les résultats expérimentaux ont été corrigés à l’aide d’un puits à blanc (solution milieu + CCK8). Taux de survie cellulaire = [(groupe expérimental - puits vide)/(groupe NC - puits vide)] × 100 %.
transfection de siRNA
La transfection a été effectuée conformément aux instructions du fabricant d’un réactif de transfection in vitro in vitro pour siRNA/miRNA à l’aide de duplex synthétiques de siIL-1R1 (AUAGUCUUGGAUUUUCUCCAA, GGAGAAAAUCCAAGACUAUGA) à une concentration de 100 ng/μL pendant 24 h. Après la transfection de siIL-1R1, les expressions de siIL-1R1 ont été évaluées en effectuant une analyse RT-qPCR après 24 h de transfection18, et l’efficacité doit être supérieure à 80 %
Dosage immuno-enzymatique (ELISA)
Les surnageants post-culture ont été collectés et centrifugés dans des conditions spécifiques au groupe (2950 g, 20 min, 25 °C). Les niveaux extracellulaires d’IL-1β, de TNF-α, de ROS et de SOD ont été dosés par ELISA conformément aux instructions du kit. Les lectures finales de l’absorbance à 450 nm ont été obtenues à l’aide d’un lecteur de microplaques.
Isolement de l’ARN et PCR quantitative en temps réel (RT-qPCR)
Conformément aux instructions du fabricant, l’ARN total a été extrait des cellules cultivées à l’aide du réactif TRizol. Les gènes cibles (IL-1β, TNF-α, S-100b, IL-1R1) ont été amplifiés dans 20 μL de réactions de mélange SYBR qPCR pendant 40 cycles sur un instrument de PCR. Normalisation des données utilisée β-actine, avec spécificité PCR vérifiée par analyse de la courbe de fusion. La méthode 2−ΔΔCt a quantifié l’expression relative à partir de cinq échantillons indépendants analysés en trois exemplaires. Les amorces sont énumérées dans le tableau 1.
Transfert Western
Après le traitement, les CS de tous les groupes expérimentaux ont été incubés pendant 24 heures et récoltés. Les protéines totales ont été extraites à l’aide d’un kit d’extraction de protéines totales. Les lysats de protéines ont été associés à un tampon de charge par électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE) dénaturé à 98 °C pendant 5 min et séparé (20 μg par voie) sur des gels de polyacrylamide SDS à 10-12 %. Les protéines résolues ont été transférées par électrophorèse sur des membranes de fluorure de polyvinylidène (PVDF). Les membranes ont été bloquées avec du lait écrémé en poudre à 5 % pendant 60 min à température ambiante, puis incubées pendant une nuit à 4 °C dans un volume de 6 mL avec les anticorps primaires suivants : anticorps anti-HIF-1α (1:1000), anticorps anti-GAPDH (1:1000), anticorps anti-IL-1R1 (1:1000), anticorps anti-C-JUN (1:1000), anticorps anti-GDNF (1:1000), anticorps anti-IRAK1 (1:1000), anticorps anti-IKK (1:1000), anticorps anti-p65 (1:800), anticorps anti-p50 (1:900), anticorps anti-IκB-α (1:900) et anticorps anti-β-actine (1:1000). Après le lavage, les membranes ont été sondées avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) pendant 60 min à 25 °C. Les signaux protéiques ont été détectés à l’aide d’Image Studio Digits Ver 4.0. Les intensités de bande ont été quantifiées à l’aide du logiciel ImageJ et normalisées en fonction de l’expression de la β-actine et du GAPDH. Trois expériences indépendantes ont été réalisées.
Immunofluorescence
La localisation de l’IL-1R1 dans les CS a été évaluée d’après Zhao et al.19. Récoltez les cellules pendant la phase de croissance logarithmique par trypsinisation, mettez-les en suspension dans un milieu complet frais et triturez-les soigneusement pour obtenir une suspension unicellulaire uniforme. Ensemencez les cellules sur des plaques de culture contenant des lamelles stériles. Une fois que les cellules ont atteint leur confluence complète, rincez-les 1 à 2 fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), retirez soigneusement les lamelles de couverture et fixez les cellules adhérentes avec 4 % de paraformaldéhyde dans du PBS pendant 10 min, perméabilisez avec 0,05 % de Triton X-100 (10 min) et bloquez avec 5 % de sérum de chèvre (1 h). Incubation primaire : utilisé lapin anti-rat IL-1R1 mAb. Après les lavages PBS, les échantillons ont été incubés avec des IgG anti-lapin de chèvre conjuguées au FITC pendant 2 h à température ambiante. Ajoutez des agents de montage solubles dans l’eau sur la lamelle de recouvrement pour le montage. Les cellules immunomarquées ont été visualisées et quantifiées à l’aide d’un microscope à fluorescence avec la longueur d’onde d’excitation 492 nm et la longueur d’onde d’émission 520 nm.
Analyse de l’ultrastructure
Selon le protocole19 de Zhao et al., les CS ont été fixés dans du glutaraldéhyde à 2,5 % et post-fixés pendant la nuit à 4 °C dans du tétroxyde d’osmium à 1 %. Les échantillons ont subi une série de déshydratation à l’éthanol et à l’acétone. Des coupes ultraminces (80 nm) ont été colorées à l’acétate d’uranyle et au citrate de plomb avant l’examen ultrastructurel à l’aide d’un microscope électronique à transmission.
Élimination des réactifs chimiques dangereux
Le milieu et les solutions contenant du CoCl2 sont collectés dans un conteneur de déchets de métaux lourds désigné. Tous les matériaux jetables qui ont été en contact avec les liquides susmentionnés, y compris les pointes de pipette, les tubes de centrifugation et les gants, sont classés comme déchets dangereux de métaux lourds et sont transférés à une société de gestion des déchets dangereux agréée et approuvée par les autorités compétentes pour une élimination appropriée. Jeter les déchets de solution de paraformaldéhyde dans un conteneur dédié aux déchets d’aldéhyde. Les consommables usagés doivent être collectés en tant que déchets d’aldéhyde et traités par la même entreprise de gestion de déchets dangereux agréée.
Analyse statistique
Les comparaisons multi-groupes ont été analysées par ANOVA à un facteur avec le test post-hoc de Tukey dans GraphPad Prism 8.0. La signification statistique a été définie comme étant P < 0,05. Les données sont présentées sous forme de moyenne ±± d’écart-type (ET).
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Effets protecteurs de Mus sur les lésions de stress oxydatif des cellules de Schwann in vitro
L’expression de HIF-1α a montré des changements en réponse aux variations des circonstances hypoxiques20. Pour modéliser l’hypoxie, les CS ont été exposés au CoCl2, qui a réussi à induire une hypoxie, comme le confirment les niveaux élevés de protéine HIF-1α, un marqueur canonique de l’hypoxie, par western blot (Figure 2A
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La paralysie de Bell est une paralysie idiopathique du nerf facial périphérique caractérisée par une faiblesse faciale unilatérale. La gaine de myéline remplit diverses fonctions cruciales dans le fonctionnement efficace des neurones23. Il assure la bonne conduction de l’influx nerveux, soutient les neurones en fournissant des facteurs nourrissants et aide au processus de régénération24 . Par conséquent, la perte de myéline dans le système ...
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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.
Tous les auteurs souhaitent adresser leurs remerciements aux organismes de financement qui sont le programme Talents (Excellent Academic Leaders) de la Commission de santé du district de Baoshan (BSWSYX-2024-02), le programme de budget des dépenses de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Shanghai (2021LK003), le programme d’excellence pour la jeunesse de la Commission de santé du district de Baoshan (Yucai) (BSWSYC-2024-02) et le projet de culture de classe B dans les disciplines médicales clés et les marques caractéristiques, Commission de la santé du district de Baoshan, Shanghai (BSZK-2023-BP07). Ces organismes de financement n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude ou dans la décision de soumettre le manuscrit pour publication.
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| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Solution de digestion de trypsine à 0,25 % (sans EDTA) | Servicebio | G4002 | |
| 10 fois plus de | Eubiotech | BF0153 | |
| 10-180 KDPrestained Marqueur de protéine de couleur | Eubiotech | Réf. P0069 | |
| 5 % de lait écrémé en poudre | Beyotime Biotechnology, Chine | Réf. P0216-300g | |
| anticorps anti-C-JUN | Signalisation cellulaire, États-Unis | #9165T | |
| anticorps anti-GAPDH | abcam, Royaume-Uni | AB245355 | |
| anticorps anti-GDNF | Signalisation cellulaire, États-Unis | #47808 | |
| anti-HIF-1&alpha ; anticorps | Signalisation cellulaire, États-Unis | #14179 | |
| anticorps anti-IKK | Signalisation cellulaire, États-Unis | #2682 | |
| anticorps anti-IL-1R1 | Signalisation cellulaire, États-Unis | #6775 | pour WB |
| anticorps anti-IL-1R1 | Proteintech | Référence 84094-6-RR | pour l’immunofluorescence |
| anticorps anti-IRAK1 | Signalisation cellulaire, États-Unis | #4395 | |
| anti-I&kappa ; B-&alpha ; anticorps | Signalisation cellulaire, États-Unis | #8943 | |
| Anticorps anti-P50 | abcam, Royaume-Uni | AB305263 | |
| anticorps anti-P65 ; | abcam, Royaume-Uni | AB16502 | |
| anti-rat IL-1R1 mAb ; | Beyotime Biotechnology, Chine | AF7212 | |
| Anticorps anti-&bêta ;-actine | ABCAM | AB179467 | |
| Kit de quantification des protéines BCA | Eubiotech | WB2123 | |
| Réactif de dosage du kit de comptage cellulaire-8 (CCK-8) | Beyotime Biotechnology, Chine | Réf. C0048M | |
| Chlorure de cobalt (CoCl2) | Macklin, Chine | C804815 | |
| EuECL Star | Eubiotech | WB2131 | |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | Bergolin, Chine | PWL001 | |
| IgG anti-lapin de chèvre labellisée FITC | Servicebio | GB22303 | |
| Microscope à fluorescence | Nikon·s ; | ||
| Réactif de transfection in vitro Hieff Trans siRNA/miRNA | YEASEN, Chine | Réf. 40806ES01 | |
| Anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) IgG anti-souris de chèvre marqués au HRP | Servicebio, Chine | GB23301 | |
| Kit ELISA IL-1&beta ;, TNF-&alpha ;, ROS et SOD | BOSTER, Chine | BES1762K, BES0481K, BES5018K, BES2920K | |
| Muscone (Mus) | Aladdin, Chine | M141496 | |
| Tampon PBS | Servicebio | Réf. G4202 | |
| Solution de pénicilline-streptomycine, 100x | Procell | PB180120 | |
| Membranes en fluorure de polyvinylidène (PVDF) | Millipore, États-Unis | IPFL00010 | |
| Cellules de Schwann (SC) de rat | Procell Life Science & Technologie Chine | CM-M111 | |
| Tampon de lyse RIPA | Eubiotech | WB2116 | |
| Milieu cellulaire Schwann | ScienCell, États-Unis | 1701 | |
| Tampon de chargement SDS-PAGE | Beyotime Biotechnology, Chine | Réf. P0015 | |
| SDS-PAGE Tampon de chargement de la protéine l, 5x | Eubiotech | WB2122 | |
| si-IL-1R1 | Gène universel | RX0114371 | |
| Électrophorèse du gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE) | Eubiotech | WB2118 | |
| Mélange qPCR SYBR | Beyotime Biotechnology, Chine | D7260 | |
| Kit d’extraction de protéines totales | Beyotime Biotechnology, Chine | N° PP123-01 | |
| Microscope électronique à transmission | Hitachi | HT7800° | |
| Le trizol | Beyotime Biotechnology, Chine | R0011 | |
| Préadolescent-20 | Eubiotech | WB2114 | |
| Agents d’enrobage solubles dans l’eau | Absin, Chine | ABS9240 | |
| Zone tampon de transfert ouest | Eubiotech | WB2129 |
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