Article de méthode

Visualisation du gardien : l’évaluation de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique par un colorant bleu d’Evan chez le poisson-zèbre adulte

DOI :

10.3791/69010

⸱

30 septembre 2025

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1Department of Basic Medical Sciences, Kulliyyah of Medicine, International Islamic University Malaysia (IIUM), 2Department of Biotechnology, Kulliyyah of Science, International Islamic University Malaysia (IIUM), 3Department of Physiology, Faculty of Medicine, Universiti Kebangsaan Malaysia, 4Clinical Pharmacology Department, Menoufia Medical School, Menoufia University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole présente une méthode fiable pour évaluer l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique (BHE) dans le modèle de poisson-zèbre adulte (Danio rerio) à l’aide de l’évaluation basée sur le colorant bleu d’Evan, permettant une analyse qualitative et quantitative de la perturbation neurovasculaire.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La barrière hémato-encéphalique (BHE) est une interface semi-perméable qui maintient l’homéostasie du système nerveux central (SNC) en régulant le mouvement des substances dans et hors du cerveau, protégeant ainsi le tissu neural des agents potentiellement nocifs. La perturbation de la BHE est une caractéristique bien établie dans de nombreuses maladies neurodégénératives, notamment la maladie de Parkinson (MP) et la maladie d’Alzheimer (MA), où une perméabilité accrue contribue à la progression de la maladie et l’exacerbe. Bien que le poisson-zèbre adulte (Danio rerio) soit de plus en plus reconnu comme un modèle précieux pour l’étude des maladies neurodégénératives, les méthodes standardisées d’évaluation de l’intégrité de la BHE chez cette espèce restent limitées. Ce protocole décrit une approche simple, reproductible et rentable pour évaluer la perméabilité de la BHE chez le poisson-zèbre adulte en analysant l’extravasation du colorant bleu d’Evan (EB) de la neurovascularisation dans le tissu cérébral. La méthode combine la visualisation qualitative avec l’analyse quantitative d’images de la distribution de l’EB pour détecter la perturbation de la BHE. Les étapes clés comprennent l’injection intrapéritonéale appropriée du colorant EB, la confirmation de la circulation systémique du colorant, une dissection cérébrale minutieuse, une imagerie cohérente et une mesure de l’intensité en niveaux de gris. Des contrôles positifs et négatifs sont incorporés pour valider la pénétration du colorant et permettre une interprétation précise. Des résultats représentatifs démontrent une plus grande extravasation de l’EB dans le cerveau des poissons-zèbres parkinsoniens par rapport aux témoins injectés de solution saline, ce qui indique une augmentation de la perméabilité de la BHE. Cette technique nécessite un minimum d’équipement spécialisé et convient aux laboratoires disposant de ressources limitées. Dans l’ensemble, ce protocole offre un outil pratique pour étudier l’intégrité de la BHE dans des modèles de poissons-zèbres adultes et peut être adapté à diverses applications, y compris l’étude des mécanismes de la maladie et l’évaluation d’interventions thérapeutiques ciblant la fonction neurovasculaire.

Introduction

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La barrière hémato-encéphalique (BHE) est une interface physiologique sélective et semi-perméable formée principalement par des cellules endothéliales cérébrales spécialisées, soutenues par des péricytes et des astrocytes, qui régule les échanges moléculaires entre la circulation sanguine et l’espace interstitiel du cerveau afin de préserver le microenvironnement du système nerveux central (SNC). Son intégrité est essentielle pour préserver l’homéostasie du SNC et protéger le tissu neural des substances nocives ou toxiques1. La perturbation de la BHE est une caractéristique pathologique bien connue dans diverses maladies neurodégénératives, notamment la maladie de Parkinson (MP), la maladie d’Alzheimer et la sclérose latérale amyotrophique 2,3. Une fonction de BHE compromise entraîne une augmentation de la perméabilité, ce qui permet aux composés neurotoxiques et aux médiateurs inflammatoires de s’infiltrer dans les tissus cérébraux, exacerbant ainsi la progression de la maladie4. En tant que tel, l’évaluation de l’intégrité de la BHE est essentielle pour mieux comprendre les mécanismes neurovasculaires et inflammatoires sous-jacents à ces troubles.

Alors que les modèles in vivo et in vitro restent les références pour la recherche sur la BHE5, le poisson-zèbre (Danio rerio) est devenu un modèle de vertébré précieux en neurosciences en raison de sa traductibilité génétique, de sa rentabilité, de sa facilité de manipulation et de ses caractéristiques neuroanatomiques et de la BHE conservées chez les mammifères6. Malgré leur utilisation croissante dans les études neurodégénératives, les méthodes d’évaluation de l’intégrité de la BHE chez le poisson-zèbre adulte sont encore limitées 7,8. Des techniques telles que les injections de traceurs fluorescents ou les rapporteurs transgéniques ont été largement utilisées chez les larves 9,10, mais posent des défis importants chez les adultes en raison de la pigmentation et de la diminution de la transparence. Par conséquent, l’objectif de la présente étude est d’établir un protocole simple, reproductible et visuellement démontrable pour évaluer la perméabilité de la BHE chez le poisson-zèbre adulte à l’aide de l’extravasation du colorant Evan’s Blue (EB). Cette méthode intègre à la fois l’observation qualitative et la mesure quantitative des fuites de colorant dans le tissu cérébral, fournissant un outil pratique pour évaluer l’intégrité neurovasculaire dans des conditions pathologiques.

Le colorant bleu d’Evan, qui se lie à l’albumine sérique et ne peut normalement pas traverser la BHE11 intacte, offre une alternative réalisable pour évaluer la rupture de la barrière12. L’extravasation de l’EB a été largement appliquée dans des modèles de rongeurs pour détecter les fuites de BHE dans des conditions telles que les lésions cérébrales traumatiques, les accidents vasculaires cérébraux et la neuroinflammation13. Cependant, son application chez le poisson-zèbre adulte est restée largement inexplorée. Cette étude présente une nouvelle adaptation de la technique de colorant EB optimisée pour le poisson-zèbre adulte, permettant une évaluation qualitative et quantitative fiable de la perméabilité de la BHE. La méthode est rentable, nécessite un minimum d’équipement spécialisé et peut être facilement adaptée à plusieurs animaux, ce qui offre un avantage pratique par rapport aux approches plus complexes basées sur l’imagerie généralement utilisées chez les larves.

À l’aide de ce protocole, nous avons évalué l’intégrité de la BHE chez les poissons-zèbres adultes sains et parkinsoniens. Pour induire le parkinsonisme chez le poisson-zèbre, la neurotoxine 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP) a été administrée par voie intrapéritonéale, selon une méthode décrite précédemment14. Les résultats ont révélé une extravasation significativement plus importante de l’EB dans le cerveau du poisson-zèbre parkinsonien, ce qui correspond à la perturbation bien documentée de la BHE observée dans la MP. Ces résultats valident la sensibilité et la fiabilité de la méthode, soutenant son utilité pour établir un lien entre la pathologie vasculaire et les résultats moléculaires et comportementaux. Cette technique représente donc un outil précieux pour les chercheurs qui étudient les contributions neurovasculaires aux maladies neurodégénératives et peut être appliquée à la fois dans des modèles de poissons-zèbres génétiques et induits par des toxines.

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Protocole

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Ce protocole a été suivi et autorisé par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université islamique internationale de Malaisie (IIUM), en référence à l’approbation de l’éthique animale (réf. n° : IIUM/504/14/2/IACUC).

1. Préparez la solution mère de colorant Evans Blue

  1. Dissoudre 0,1 g de colorant EB dans 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour préparer une solution mère à 1 % (p/v). Mélangez soigneusement jusqu’à ce que le colorant soit complètement dissous.
    ATTENTION : L’EB est classé dans la catégorie cancérogène 1B. Évitez tout contact direct avec la peau et les yeux. Utilisez des vêtements de protection, des gants, des lunettes de sécurité et un respirateur anti-poussière. Évitez d’inhaler de la poussière et suivez les instructions de manipulation du fabricant. Ne jetez pas le colorant Evans Blue (solide ou en solution) dans l’évier. Conservez les déchets dans les contenants d’origine étiquetés. Éliminez conformément aux réglementations nationales et locales en matière de déchets dangereux.
  2. Filtrez la solution à l’aide d’un filtre à seringue de 0,45 μm. Prélever le filtrat dans un tube à centrifuger stérile de 15 ml. Enveloppez le tube dans du papier d’aluminium et conservez-le à 4 °C.
    REMARQUE : Un filtre de taille de pores plus petit (par exemple, 0,2 μm) peut également être utilisé. La solution mère peut être conservée à 4 °C jusqu’à deux semaines, ou à -20 °C jusqu’à un mois, l’aliquotage étant recommandé pour minimiser les cycles répétés de congélation-décongélation lorsqu’il est stocké congelé.

2. Administrer le colorant Evans Blue au poisson-zèbre adulte

  1. Anesthésier le poisson-zèbre par choc hypothermique en abaissant progressivement la température de l’eau de 12 °C à 7 °C, jusqu’à ce que le poisson ne réponde plus aux stimuli tactiles.
    REMARQUE : Une réduction progressive de la température peut être obtenue en ajoutant lentement de petites quantités de glace pilée à l’eau pendant plusieurs minutes, permettant à la température de diminuer progressivement. L’immersion dans la tricaïne est également une méthode d’anesthésie alternative appropriée.
  2. Injecter 20 μL de colorant EB à 1 % dans la cavité intrapéritonéale (IP) à l’aide d’une seringue à insuline de 31 G. Appliquez une légère pression sur le site d’injection pendant 10 s pour éviter le reflux.
    REMARQUE : La cavité intrapéritonéale du poisson-zèbre est située à l’arrière de la ceinture pelvienne. Pour augmenter le taux de réussite de l’administration d’EB, faites jeûner le poisson pendant 24 heures avant l’injection. Cela permettra de vider la cavité abdominale pour offrir un meilleur accès et une meilleure précision à l’espace intrapéritonéal.
  3. Transférez les poissons dans un réservoir de récupération et laissez la récupération pendant 30 min. Surveiller l’apparition de blessures, de décès ou de changements de comportement.
    REMARQUE : Pour aider le poisson-zèbre à récupérer, utilisez une température de l’eau légèrement réduite (20-24 °C) pour le réservoir de récupération afin de fournir un effet anesthésique léger et d’aider à engourdir l’inconfort post-injection potentiel. Les poissons injectés présenteront une teinte bleue, indiquant une circulation réussie du colorant (figure 1).
  4. Après 30 min, euthanasier le poisson par choc hypothermique à 1 °C à 3 °C. Ensuite, décapitez le poisson à l’aide d’une lame stérile ou de ciseaux chirurgicaux.
    REMARQUE : Pour aider à la dissection du cerveau plus tard, laissez de la chair supplémentaire derrière la tête lors de la décapitation.
  5. Rincez la tête deux fois avec 1x PBS (rapport poisson/PBS de 1:20) pour éliminer l’excès de sang et de colorant EB.
    REMARQUE : Un lavage insuffisant peut entraîner des résultats faussement positifs et compromettre la précision de l’analyse. Pour éviter cela, lavez soigneusement le tissu cérébral au moins deux fois avec 1x PBS, en veillant à ce que tout le sang visible et le colorant qui s’écoule librement soient éliminés. S’il reste un colorant résiduel, un troisième lavage est fortement recommandé.
  6. Fixer la tête dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 °C pendant la nuit (rapport poisson/fixateur de 1:20). L’agitation n’est pas nécessaire pendant la fixation, car la petite taille de la tête du poisson-zèbre et le volume de fixateur suffisant permettent une pénétration efficace dans des conditions statiques.
    ATTENTION : Le PFA est nocif en cas d’ingestion, d’inhalation ou de contact avec la peau. Préparez la solution de PFA sous une hotte. Utilisez un équipement de protection individuelle approprié et évitez d’inhaler de la poussière. Suivez toutes les directives de sécurité du fabricant. Traiter les PFA comme des déchets dangereux. Évitez de le jeter dans les égouts. Collectez et étiquetez les déchets dans des conteneurs scellés et éliminez-les conformément aux réglementations locales et nationales.
  7. Disséquer le cerveau du poisson-zèbre
    1. Placez la tête fixe dans une boîte de Pétri propre et disséquez le cerveau comme décrit précédemment15, à l’aide d’une pince à épiler à bout pointu. Ajouter continuellement 1x PBS dropwise pendant la dissection pour garder le tissu hydraté et prévenir le dessèchement.
    2. Préparez la plaque d’agarose en dissolvant 1 g d’agarose dans 100 mL d’eau distillée. Passez-le au micro-ondes jusqu’à ce qu’il soit complètement fondu, versez-le dans une boîte de Pétri et laissez-le se solidifier.
    3. Rincez le cerveau disséqué deux fois dans deux bains séparés 1x PBS. Ensuite, placez le tissu sur une plaque d’agarose à 1 % pour retenir l’humidité et éviter le rétrécissement.
      REMARQUE : Un lavage insuffisant peut entraîner des résultats faussement positifs et compromettre la précision de l’analyse. Pour éviter cela, lavez soigneusement le tissu cérébral au moins deux fois avec 1× PBS, en vous assurant que tout le sang visible et le colorant qui s’écoule sont éliminés. S’il reste un colorant résiduel, un troisième lavage est fortement recommandé.

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Figure 1 : Comparaison de la coloration de la peau entre un poisson-zèbre normal et un poisson-zèbre injecté d’EB. (A) Poisson zèbre normal présentant un teint brunâtre typique. (B) Poisson-zèbre injecté d’EB présentant une teinte bleuâtre notable, indiquant une circulation systémique réussie du colorant. Barre d’échelle = 1 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Établir un contrôle positif par blessure par arme blanche (SWI)

REMARQUE : La blessure par arme blanche brise la BHE et permet l’extravasation de l’EB au site de la blessure.

  1. Anesthésier le poisson à l’aide de la méthode du choc hypothermique (voir étape 2.1). Une fois anesthésié, injecter 20 μL de colorant EB à 1 % et laisser le poisson récupérer pendant 30 minutes comme décrit aux étapes 2.2 et 2.3.
  2. Après une période de récupération de 30 minutes, préparez une aiguille stérile de 31 G attachée à une seringue à insuline et effectuez une procédure de blessure à l’arme blanche comme suit :
    1. Anesthésier à nouveau le poisson.
    2. Placez le poisson à la verticale sur une surface plane et froide (p. ex. un sac de glace). Insérez l’aiguille dans un côté du télencéphale à un angle de 90° jusqu’à une profondeur ne dépassant pas 1,5 mm (Figure 2).
      REMARQUE : Pour éviter tout contact direct de la peau avec le sac de glace et éviter d’endommager la peau, placez une couche de gaze ou d’essuie-tout entre le poisson et la surface froide (figure 2). Alternativement, le poisson peut être placé dans une boîte de Pétri peu profonde placée sur le dessus de la compresse froide pour maintenir le refroidissement sans contact direct. Marquez 1,5 mm sur l’aiguille pour éviter une pénétration excessive.
    3. Transférez le poisson dans un réservoir de récupération et laissez récupérer pendant 30 min.
    4. Euthanasier, décapiter, réparer et disséquer le cerveau comme décrit aux étapes 2.4 à 2.7.
    5. Pour un contrôle négatif, répétez les étapes 2.1 à 2.7 en utilisant 20 μL de 1x PBS au lieu du colorant EB.

figure-protocol-2
Figure 2 : Blessure par arme blanche pour un contrôle positif. (A) Insérez brièvement une aiguille 31G dans le télencéphale (cercle rouge) pour faciliter la pénétration du colorant EB dans le tissu cérébral ; Comparaison côte à côte d’un cerveau non blessé et d’un cerveau poignardé, (B) vue dorsale du site du coup de couteau (cercle rouge), (C) vue latérale du site du coup de couteau. Barre d’échelle = 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Analyse qualitative de l’extravasation de l’EB

  1. Observez des tissus cérébraux disséqués au microscope. Optimisez les paramètres de l’image (zoom, balance des blancs, exposition, contraste, etc.) pour assurer la cohérence.
  2. Capturez des images à l’aide d’une caméra montée sur microscope et enregistrez-les au format . format TIFF.
    REMARQUE : Utilisez des paramètres d’imagerie identiques pour tous les échantillons afin de garantir une validité comparative.

5. Analyse quantitative de l’extravasation de l’EB

  1. Téléchargez et installez Fidji (un lien pour télécharger le logiciel est disponible dans la table des matériaux). Ouvrez l’image aux Fidji.
  2. Effectuez la déconvolution des couleurs en cliquant sur : Image > Couleur > Déconvolution des couleurs > RVB, ce qui donne trois images distinctes représentant les teintes rouge, verte et bleue.
    REMARQUE : Cette étape permet d’isoler la teinte bleue des autres composants de la couleur, en s’assurant que seule l’intensité du colorant bleu est mesurée.
  3. Activez l’image du canal bleu (généralement étiquetée « Color_3 ») en cliquant sur l’image. Convertissez-le en niveaux de gris 8 bits en cliquant sur : Image > Type > 8 bits.
    REMARQUE : La conversion en niveaux de gris minimise les artefacts de couleur et améliore l’analyse basée sur l’intensité.
  4. Mesurez l’intensité du gris de l’image 8 bits.
    1. Réglez les mesures en sélectionnant : Analyser > Définir les mesures ; sélectionnez Zone et Valeur de gris moyenne.
    2. À l’aide de l’outil de sélection de rectangle, dessinez une région d’intérêt (ROI) de taille uniforme et mesurez l’intensité du gris en sélectionnant Analyser > mesure ou en appuyant sur Ctrl + M.
      REMARQUE : La même taille de retour sur investissement doit être utilisée pour tous les échantillons. Les dimensions absolues du retour sur investissement peuvent varier en fonction du grossissement et de la résolution de l’image acquise, de sorte que les chercheurs doivent normaliser la taille du retour sur investissement dans leur ensemble de données pour assurer la comparabilité. Chaque pixel de l’image en niveaux de gris 8 bits a une valeur d’intensité comprise entre 0 et 255, où 0 représente le noir pur, 255 représente le blanc pur et les valeurs intermédiaires représentent différentes nuances de gris.
    3. Pour réduire les biais, dessinez trois à cinq zones d’intérêt dans des régions anatomiquement cohérentes du cerveau sur tous les échantillons. Évitez les régions avec des artefacts ou des taches incohérentes.
      REMARQUE : La cohérence du placement peut être obtenue en se référant à des repères anatomiques et en s’assurant que le positionnement du retour sur investissement est symétrique entre les groupes expérimentaux.
    4. Faites la moyenne des valeurs moyennes de gris des ROI pour chaque image afin d’obtenir une seule valeur d’intensité par cerveau. Utilisez cette moyenne pour la comparaison statistique entre les groupes.

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Résultats

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Ce protocole a été testé sur un modèle de poisson-zèbre parkinsonien. La compromission de la BHE est un phénomène bien documenté chez les patients atteints de la MP 16,17,18 et chez divers modèles animaux parkinsoniens 19,20,21. Pour étudier l’intégrité de la BHE dans le modèle parkinsonien adulte de poisson-zèbre, l’extravasation du co...

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Discussion

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L’évaluation de l’intégrité de la BHE est essentielle pour comprendre la physiopathologie des maladies liées au cerveau, car une BHE compromise peut à la fois causer et aggraver la progression de la maladie4. Bien que le poisson-zèbre adulte soit apparu comme un modèle efficace pour l’étude des maladies neurodégénératives, les méthodes d’évaluation de l’intégrité de la BHE chez cette espèce restent sous-développées8. Le protocole présenté i...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

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Cette recherche a été financée par le ministère malaisien de l’Enseignement supérieur (MoHE) dans le cadre du programme de subventions pour la recherche fondamentale (FRGS), numéro de subvention FRGS19-125-0734. L’aide à la publication de cette étude a été financée par la Faculté de médecine de l’Universiti Kebangsaan Malaysia (UKM).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Poudre d’agaroseVivantisRéf. PC0701
Teinture bleue d’EvanSigma-AldrichE2129
Fidji ImageJInstituts nationaux de la santé, États-UnisLien pour télécharger : https://imagej.net/software/fiji/downloads
Caméra microscopeShenZhen Hayear Electronics Co., Ltd.HY-500M
Poudre de paraformaldéhyde (PFA)Sigma-Aldrich158127
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Sigma-AldrichRéf. P4417
Chlorure de sodium (NaCl)Produits chimiques HmbG7647-14-5
StéréomicroscopeOlympus CorporationSZ40
Unité de filtre à seringue, 0,45µ ; mMerck Millipore  ;SLHV004SL

Références

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