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Mutagénèse précise des phages avec des systèmes CRISPR-Cas assistés par NgTET

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DOI :

10.3791/69022

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14 octobre 2025

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1Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology, 2Kavli Institute of Nanoscience, Delft University of Technology, 3Department of Bionanoscience, Delft University of Technology, 4Philipps-Universität Marburg, Department of Chemistry, Center for Synthetic Microbiology (SYNMIKRO), 5Institute of Pharmaceutical Biology and Biotechnology, Department of Pharmacy, Marburg University

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour réduire les modifications de l’ADN dans les bactériophages à l’aide de l’enzyme NgTET, permettant une mutagenèse CRISPR-Cas efficace et sans cicatrice. Cette méthode facilite le génie génétique des phages pour des applications en biotechnologie et en phagothérapie.

Résumé

Les bactériophages, des virus qui ciblent spécifiquement leurs hôtes bactériens, présentent un potentiel important pour la biotechnologie et la médecine, en particulier dans la lutte contre les infections multirésistantes. Cependant, les mécanismes moléculaires sous-jacents à l’infection par les phages restent largement sous-explorés. La mutagénèse précise et spécifique au site des phages est un outil puissant pour élucider les fonctions des gènes et les interactions phage-hôte.

Cependant, un défi majeur dans la mutagenèse du génome des phages est la présence de modifications de l’ADN des phages qui interfèrent avec les outils conventionnels d’édition du génome comme CRISPR-Cas.

Bien que les systèmes CRISPR-Cas aient été utilisés avec succès pour la mutagénèse ciblée dans divers organismes, leur efficacité dans la mutagénèse par phage est souvent limitée par des modifications de l’ADN telles que la glycosylation de la cytosine. Pour surmonter cet obstacle, nous avons développé une méthode efficace qui réduit temporairement l’abondance des modifications de l’ADN des phages, permettant un ciblage efficace de CRISPR-Cas et une introduction précise des mutations dans les génomes des phages. Plus précisément, nous utilisons la méthylcytosine dioxygénase Ten Eleven Translocation (TET) de Naegleria gruberi (NgTET), qui démodifie de manière itérative les cytosines méthylées et hydroxyméthylées dans l’ADN. En oxydant les cytosines hydroxyméthylées dans l’ADN des phages, NgTET empêche la modification ultérieure de la cytosine comme la glycosylation et améliore considérablement l’efficacité du clivage de l’ADN médié par Cas.

En conclusion, l’approche d’édition du génome sans cicatrice et précise présentée ici permet l’introduction efficace de mutations ponctuelles tout en maintenant l’architecture des gènes natifs dans les génomes des phages. En préservant les cadres transcriptionnels et translationnels intacts, cette méthode minimise les perturbations involontaires des réseaux de régulation complexes. Ceci est particulièrement important pour l’étude des protéines de phage essentielles ou multifonctionnelles. La capacité de générer des modifications génétiques ciblées sans introduire de séquences étrangères élargit considérablement la boîte à outils expérimentale de la biologie des phages. Cette stratégie facilite non seulement les études fonctionnelles détaillées, mais améliore également le potentiel d’ingénierie rationnelle des phages pour des applications thérapeutiques et biotechnologiques.

Introduction

Les bactériophages sont des virus qui ciblent spécifiquement les bactéries. Ils ont suscité un intérêt considérable pour la recherche en raison de leur immense potentiel en biotechnologie et en médecine, en particulier dans la lutte contreles bactéries multirésistantes 1,2,3. Malgré cela, la biologie des phages reste relativement peu étudiée. Une compréhension plus approfondie de leurs mécanismes moléculaires de détournement de leurs hôtes bactériens est essentielle pour exploiter pleinement leur potentiel thérapeutique et biotechnologique4. Pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents à l’infection efficace par les phages et pour concevoir les phages pour des applications spécifiques, la capacité de modifier génétiquement les génomes des phages est essentielle. Pourtant, il reste l’un des défis les plus importants dans le domaine de la biologie des phages 3,5,6.

L’ADN des phages est souvent modifié par des altérations chimiques spécifiques des bases puriques et pyrimidines, par exemple, la glycosylation et la méthylation de la cytosine. Ces modifications protègent le matériel génétique des phages de la reconnaissance et de la dégradation par les nucléases de l’hôte6. Bien que ces modifications soient cruciales pour la valeur adaptative des phages, elles constituent un obstacle important pour les approches d’ingénierie du génome des phages qui reposent sur des systèmes de ciblage de l’ADN 2,3,7.

Les stratégies de mutagénèse existantes, y compris les systèmes de restriction-modification et les technologies basées sur les protéines CRISPR (CRISPR-associated (CRISPR-associated (Cas), sont confrontées à des défis importants lors de la modification de l’ADN des phages en raison de modifications épigénétiques protectrices telles que la glycosylationde la cytosine 8. L’édition du génome médiée par CRISPR-Cas, qui est très efficace dans les cellules bactériennes et eucaryotes, repose sur deux étapes clés : le clivage précis de l’ADN au niveau des loci génomiques ciblés par la nucléase Cas, suivi de la réparation de l’ADN par recombinaison homologue avec l’ADN du donneur porteur de la mutationsouhaitée 1. Cependant, dans les phages, les modifications de l’ADN empêchent souvent les nucléases Cas de se lier ou de cliver efficacement le génome. De plus, la nature rapide et transitoire de la réplication des phages peut limiter davantage l’efficacité de la recombinaison homologue. Ces barrières rendent particulièrement difficile l’application de la technologie CRISPR-Cas ciblant l’ADN pour la mutagenèse par phage. Il a été démontré que les modifications de l’ADN des phages altèrent le ciblage de l’ADN des phages avec CRISPR-Cas à la fois in vitro et in vivo 6,7.

Pour relever les défis posés par les modifications protectrices de l’ADN dans les phages, nous introduisons une stratégie de mutagenèse du génome qui exploite l’activité de la méthylcytosine dioxygénase de translocation dix-onze (TET), en particulier NgTET. Chez les eucaryotes, les enzymes TET catalysent l’oxydation progressive de la cytosine méthylée par des processus itératifs : la méthylcytosine (5mdC) est d’abord convertie en hydroxyméthylcytosine (5hmdC), puis en formylcytosine (5fdC), et enfin en carboxycytosine (5cadC) (Figure 1).

Dans notre approche de mutagénèse des phages, NgTET est utilisé pour réduire temporairement l’abondance des modifications protectrices de l’ADN, améliorant ainsi l’accessibilité de l’ADN des phages aux outils d’édition du génome tels que les enzymes Cas9. NgTET a été sélectionné pour moduler le génome du bactériophage en raison de rapports antérieurs faisant état de son expression réussie sous forme soluble active chez un hôte bactérien hétérologue, en particulier E. coli. Cette propriété est essentielle, car le NgTET doit rester actif pendant l’infection par les phages10.

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Figure 1 : Oxydation par étapes de la 5-méthylcytosine par la TET dioxygénase1. La dioxygénase TET catalyse l’oxydation successive de la 5-méthyl-2'-désoxycytidine (5mdC) en 5hmdC, en 5-formyl-2'-désoxycytidine (5fdC) et finalement en 5-carboxyl-2'-désoxycytidine (5cadC). Le produit final, le 5cadC, redevient spontanément ou enzymatiquement à la cytosine non modifiée (dC), contribuant ainsi à la régulation épigénétique dynamique. Ce processus en plusieurs étapes est essentiel à la méthylation active de l’ADN chez les eucaryotes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Étant donné que la méthylcytosine et l’hydroxyméthylcytosine sont des précurseurs communs des hypermodifications de l’ADN des phages, y compris les structures protectrices volumineuses comme les glycosylations, l’activité oxydative de la TET dioxygénase peut être exploitée pour empêcher la formation de ces hypermodifications de l’ADN9. Dans cette approche de mutagenèse du génome basée sur TET, nous exprimons de manière hétérologue NgTET de manière recombinante chez E. coli pour oxyder les cytosines hydroxyméthylées dans le génome du phage lors de l’infection, empêchant ainsi la formation de glycosylation volumineuse. En diminuant l’abondance de ces modifications volumineuses de l’ADN, notre approche peut augmenter l’accessibilité de l’ADN des phages aux nucléases CRISPR-Cas. Cette accessibilité accrue facilite la reconnaissance efficace des cibles, le clivage précis de l’ADN et l’introduction de mutations ponctuelles sans cicatrice dans le génome du phage, ce qui la distingue des méthodes traditionnelles de mutagénèse des phages qui reposent sur des délétions de gènes, des insertions de gènes rapporteurs ou l’intégration de jonctions artificielles pour la sélection de mutants basée sur la PCR 1,11. Ces stratégies conventionnelles ont jusqu’à présent été les seuls outils disponibles pour la mutagénèse ciblée dans les génomes de phages et représentent donc une base importante pour la méthode présentée ici. Cependant, les protéines d’un seul phage peuvent posséder plusieurs fonctions. La délétion de l’ensemble du gène codant pour une protéine d’intérêt perturbe toutes les fonctions associées. En revanche, l’introduction ciblée de mutations ponctuelles permet l’inactivation sélective de fonctions spécifiques, permettant une analyse détaillée de leurs rôles. À ce jour, les fonctions de nombreuses protéines de phages restent largement non caractérisées ; Ainsi, nous pouvons négliger des activités supplémentaires liées à un gène donné. Par conséquent, une approche minimaliste qui vise à supprimer une seule fonction tout en provoquant des changements minimes dans la protéine globale est préférée12,13. La méthode décrite ici permet des modifications génétiques précises sans perturber l’organisation ou la fonction génomique globale. Un autre défi majeur des méthodes précédentes de mutagénèse par phage était leur faible efficacité, qui produisait généralement des taux de mutation d’environ 0,1 %1,11. Avec cette technique, nous présentons la première stratégie de mutagénèse capable d’introduire des modifications d’un seul codon, ce qui permet de multiplier par sept l’efficacité du ciblage. En le combinant avec une méthode de criblage à haut débit basée sur l’ONT, la détection des mutations ponctuelles est simplifiée, éliminant ainsi la nécessité de cribler de grandes populations de phages pour isoler un mutant. La stratégie de mutagenèse basée sur TET décrite ici résout une limitation de longue date dans le domaine et permet une édition du génome plus fiable14.

Dans l’ensemble, cette méthode peut non seulement être appliquée pour faire progresser notre compréhension des mécanismes d’infection par les bactériophages, mais elle est également très prometteuse pour la biologie synthétique. En permettant une ingénierie précise et efficace du génome des phages, elle ouvre la voie à l’adaptation des phages à des applications spécifiques, augmentant ainsi leur potentiel pour des applications biotechnologiques et médicales.

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Protocole

La figure 2 montre un schéma démontrant la génération d’un phage T4 traité au NgTET.

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Figure 2 : Vue d’ensemble schématique du flux de travail établi pour la mutagenèse des phages T4 et le criblage des mutants. Le flux de travail comprend la génération du phage T4 hypomodifié à l’aide de NgTET, qui peut être validé soit par l’analyse LC-MS, soit par le test de clivage CRISPR-Cas. Par la suite, la mutation d’intérêt est introduite dans le génome du phage par mutagenèse dirigée par CRISPR-Cas et identifiée par contre-sélection. La présence de la mutation souhaitée peut ensuite être confirmée à l’aide du séquençage Nanopore. Après validation, le phage mutant peut être propagé pour restaurer les hypermodifications de l’ADN. Cela permet l’utilisation du phage modifié dans des applications en aval, y compris l’analyse des phénotypes d’infection par des tests de lyse et des mesures de taille de rafale. Chaque étape de la figure est annotée avec le numéro de protocole correspondant entre parenthèses afin de faciliter la liaison entre les étapes du protocole et les parties respectives de la figure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

1. Réduction des modifications de l’ADN des phages à l’aide du prétraitement NgTET (~2 jours)

REMARQUE : Cette étape est essentielle pour permettre un ciblage efficace des nucléases Cas pendant la mutagénèse en réduisant l’abondance des modifications de l’ADN des phages.

  1. Inoculer la souche d’E. coli BL21 (DE3) transformée avec pET28a_NgTET en transférant du matériel d’un stock de glycérol dans 10 mL de milieu LB complété par 30 μg/mL de kanamycine. Incuber toute la nuit à 37 °C en secouant à 160 tr/min.
  2. Le lendemain, utiliser la culture de nuit pour inoculer une culture principale à une DOinitiale de 600 de 0,1 dans 50 mL de milieu LB contenant 30 μg/mL de kanamycine. Induire la culture avec 50 μM IPTG lorsqu’une DO600 de 0,4 est atteinte.
  3. Cultivez la culture à 37 °C en secouant à 160 tr/min jusqu’à ce qu’elle atteigne une OD600 de 0,8.
  4. Infecter la culture avec le phage d’intérêt à une multiplicité d’infection (MOI) de 0,1 et incuber pendant 4 h à température ambiante en agitant à 120 tr/min.
  5. Récoltez les cellules par centrifugation à 4000 × g pendant 20 min à 4 °C.
  6. Passez le surnageant à travers un filtre de 0,45 μm pour obtenir des phages traités au NgTET avec de l’ADN hypomodifié. Conservez les phages filtrés à 4 °C pour une utilisation future.
    REMARQUE : (POINT DE PAUSE) Les phages filtrés sont stables pendant plusieurs mois à 4 °C, stockés dans un milieu LB dans une bouteille en verre.

2. Validation

REMARQUE : Le but de cette étape est de vérifier expérimentalement l’abondance réduite des modifications de l’ADN des phages.

  1. Validation du traitement par LC-MS (~ 2 jours)
    1. Purification des phages par gradient de saccharose
      1. Pour éliminer l’acide nucléique résiduel du lysat, traiter 500 μL de suspension de phage (>1010 PFU/mL) avec 20 μL de DNase I et 2 μL de RNase A/T1 Mix (4 μg de RNase A, 10 U de RNase T1).
      2. Incuber le mélange à 37 °C pendant 30 min.
      3. Préparer un gradient de 0 à 45 % de saccharose dans un tampon TM (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, pH 7,5). Préparez le dégradé à l’aide d’un mélangeur de dégradé ou manuellement.
        REMARQUE : Pour une préparation manuelle, commencez par pipeter 5 ml de tampon TM dans un tube dégradé. Ensuite, à l’aide d’une canule à bout émoussé, pipeter lentement 5 ml de la solution de saccharose à 45 % à partir du bas du tube, en laissant la solution à 0 % monter progressivement.
      4. Chargez 500 μL de la solution de phage traitée sur le gradient.
      5. Centrifugeuse à 70 000 × g pendant 20 min à 4 °C.
      6. Allumez le tube de centrifugation par le bas. Cela permettra de visualiser le phage, qui apparaît comme une bande trouble dans le gradient. Retirez soigneusement la fraction contenant des phages à l’aide d’une canule émoussée.
      7. Transférez la fraction de phage extraite dans un nouveau tube d’ultracentrifugation.
      8. Ajouter 30 mL de tampon TM glacé et centrifuger à 100 000 × g pendant 1 h à 4 °C.
      9. Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 500 μL de tampon TM.
      10. Conservez les phages remis en suspension dans un flacon en verre à 4 °C pendant la nuit.
    2. Isolement de l’ADN du phage
      1. Ajouter 1 μg de protéinase K aux phages remis en suspension.
      2. Incuber pendant 30 min à 37 °C.
      3. Ajouter 1 volume de mélange phénol/chloroforme/alcool isoamylique (P/C/I). Mixage par inversion. Séparer les phases par centrifugation à 15 000 x g pendant 1 min à 4 °C. Transférez la phase aqueuse dans un nouveau tube réactionnel. Répétez l’extraction trois fois.
        ATTENTION : L’alcool phénol/chloroforme/isoamylique (P/C/I) est hautement toxique, corrosif et volatil. Manipulez-le toujours à l’intérieur d’une hotte tout en portant un équipement de protection approprié, y compris une blouse de laboratoire, des lunettes de sécurité et des gants en nitrile double. Évitez tout contact avec la peau et les yeux et conservez-le dans un contenant hermétiquement fermé dans une armoire à produits chimiques désignée. Éliminer les déchets par des filières de gestion des déchets dangereux approuvées. En cas de contact, rincez immédiatement à l’eau et consultez un médecin.
      4. Pour éliminer le phénol résiduel, effectuez trois rétroextractions de chloroforme avec 1 volume de chloroforme.
      5. Précipiter l’ADN pendant la nuit avec 0,1 volume de 3 M de NaOAc (pH 5,5) et 2,5 volume d’éthanol à -20 °C.
      6. Le lendemain, granulez l’ADN par centrifugation à 15 000 × g pendant 1 h à 4 °C.
      7. Lavez la pastille d’ADN deux fois avec 200 μL d’éthanol à 70 %, en l’agitant doucement, en la centrifugeant à 15 000 × g pendant 15 minutes à 4 °C et en retirant soigneusement le surnageant.
      8. Remettez en suspension l’ADN purifié dans de l’eau ultrapure.
      9. Conservez l’ADN à -20 °C jusqu’à ce qu’il soit utilisé à nouveau.
        REMARQUE : (POINT DE PAUSE) L’ADN PRÉCIPITÉ peut être stocké à -20 °C pendant plusieurs mois.
    3. Préparation de l’ADN des phages pour l’analyse par LC-MS
      1. Digérez l’ADN purifié en nucléosides uniques à l’aide d’un mélange de digestion de nucléosidiques.
      2. Analyse de la composition de l’ADN par LC-MS.
        REMARQUE : Cette étape permet de valider l’efficacité du traitement NgTET. Le protocole est adapté à l’équipement et à la colonne spécifiques disponibles dans le laboratoire, mais peut être ajusté en fonction des ressources et des conditions disponibles.
      3. Utilisez de l’ADN digéré isolé d’un phage purifié (étape 2.1.10).
      4. Inclure les normes suivantes disponibles dans le commerce pour les mesures : dA, dT, dG, dC, 5hmdC, 5fdC, 5cadC. Si disponible, incluez l’étalon de l’hypermodification de la cytosine présente sur l’ADN du phage.
      5. Utilisez un système HPLC équipé d’une colonne C18 (150 × 2,1 mm, 100 Å, 3 μm) et d’une colonne de garde de 20 × 2,1 mm.
      6. Réglez la température de la colonne à 40 °C et le débit de l’éluant à 0,2 mL/min.
      7. Préparez les éluants comme suit :
        Eluent A : 10 mM d’acétate d’ammonium dans l’eau (pH 4,5).
        Eluent B : 0,1 % d’acide formique dans le méthanol.
        ATTENTION : L’acide formique à 0,1 % dans le méthanol est inflammable et peut irriter la peau, les yeux et les voies respiratoires. Utilisez toujours dans un endroit bien ventilé ou dans une hotte. Portez un équipement de protection approprié, y compris une blouse de laboratoire, des lunettes de sécurité et des gants en nitrile. Tenir à l’écart de la chaleur, des étincelles et des flammes nues. Conserver dans une armoire de stockage inflammable. Éliminez selon des protocoles de déchets dangereux approuvés.
      8. Appliquer le profil de phase mobile suivant : 0-1 min : Constante à 5 % B ; 1-5 min : Pente de 5 % à 90 % B ; 5-7 min : Constante à 90 % B ; 7-7,1 min : Pente de 90 % à 5 % B ; 7,1 à 12 min : Constante à 5 % B.
      9. Utiliser un spectromètre de masse en modes d’ionisation négative et positive (injections séparées) avec une source d’ionisation par électronébulisation à haute température (H-ESI) dans les conditions suivantes :
        Tension de pulvérisation H-ESI : 3400 V (+), 2400 V (-), Gaz de gaine : 35 unités arbitraires, Gaz auxiliaire : 7 unités arbitraires, Gaz de balayage : 0 unité arbitraire, Température du tube de transfert d’ions : 300 °C, Température du vaporisateur : 275 °C, Mode de détection : Balayage complet à l’aide de l’analyseur de masse Orbitrap, Résolution de masse : 120 000, Plage de masse : 200-450 (m/z).
      10. Chromatogrammes d’extraction des formes [M-H]- (dA, dT, dC, 5hmdC, 5fdC, 5cadC) et [M+H]+ (5ghmdC) à l’aide du logiciel Tracefinder.
      11. Calculez l’abondance relative de chaque modification en normalisant la surface de crête de chaque signal à la surface de crête dG dans l’échantillon, en utilisant dG comme étalon interne spécifique à l’échantillon.
  2. Validation avec le test de clivage CRISPR-Cas (~2,5 jours)
    REMARQUE : Cette étape permet l’évaluation phénotypique du succès du traitement NgTET et de son impact sur le clivage de CRISPR-Cas. Si NgTET est actif, aucune plaque ne doit se former à partir de l’ADN du phage traité, ou le titre de phage doit être réduit, car l’élimination des modifications protectrices de l’ADN rend le génome sensible au clivage de CRISPR-Cas12 ou 9. En revanche, si l’ADN du phage n’est pas traité, le nombre de plaques formées correspondra au titre des phages, indiquant que le génome du phage T4 hypermodifié est résistant au clivage CRISPR-Cas12 ou 9.
    1. Inoculer E. coli BL21 (DE3) à partir d’une culture nocturne, transformée à la fois avec le plasmide pET28a_NgTET et un plasmide d’expression Cas12 ou Cas9 (par exemple, DS-spCas ou pCpf1 sans espaceur). Tous les plasmides avec des informations supplémentaires se trouvent dans le tableau 1.
      1. Cultivez les cellules dans un milieu LB complété par les antibiotiques appropriés à 3 °C avec agitation, à partir d’une OD600 de 0,1. Une fois que la culture atteint une DO600 d’environ 0,4, induire l’expression de NgTET en ajoutant 0,05 mM d’IPTG et incuber pendant 2 h supplémentaires à 3 °C.
      2. À titre de contrôle, comparez les souches d’E. coli BL21 (DE3) avec et sans surexpression de NgTET. En l’absence d’activité NgTET, un nombre plus élevé d’unités formant des plaques est attendu, indiquant une efficacité réduite de CRISPR-Cas en raison de la présence de 5ghmdC glycosylée dans l’ADN du phage.
    2. Transvasez 300 μL de cultures d’E. coli dans un tube stérile.
    3. Infecter la culture avec un phage traité au T4 WT ou au NgTET avec un MOI de 0,01. Pour cette expérience, appliquez un faible moment d’inertie pour vous assurer que les bactéries ne sont infectées que par un seul phage à la fois. Cela maximise l’efficacité du dépistage du clivage CRISPR-Cas et simplifie l’interprétation des résultats. Mélangez doucement pour assurer une répartition uniforme des phages.
    4. Incuber la suspension de bactéries et de phages à 37 °C pendant 7 min.
    5. Ajouter le mélange bactéries-phages à 4 mL de gélose molle LB (0,75 %) complétée par des antibiotiques. Mélangez soigneusement mais doucement pour éviter d’introduire des bulles.
    6. Versez le mélange d’agar doux sur une plaque d’agar LB préchauffée.
    7. Laissez les plaques se solidifier brièvement à température ambiante. Incuber les plaques à 37 °C pendant la nuit.
    8. Le lendemain, comptez les plaques résultantes pour déterminer les unités formant la plaque (PFU).

3. Mutagénèse CRISPR-Cas (~ 1 semaine)

REMARQUE : La mutagenèse CRISPR-Cas est basée sur le principe qu’un site spécifique dans le génome du phage est ciblé par une nucléase Cas lors de l’infection par le phage, entraînant une rupture double brin. Cette rupture est réparée par recombinaison homologue à l’aide de l’ADN du donneur, qui est fourni sur un deuxième plasmide présent dans la souche hôte infectée lors de la mutagénèse. Le plasmide qui contient l’ADN du donneur code également pour le NgTET, qui est essentiel pour maintenir l’accessibilité de l’ADN du phage pour la nucléase Cas en réduisant l’abondance des cytosines modifiées, comme décrit précédemment. Dans cette étape, des mutations cibles sont introduites dans le génome des phages T4 traités par NgTET lors de l’infection par E. coli15. Pour garantir des niveaux constamment faibles de modifications de l’ADN dans le génome T4, la dioxygénase NgTET est exprimée par l’ajout de 50 μM IPTG (par analogie à l’étape 1.2) tout au long du processus de mutagénèse.

  1. Génération de plasmides d’ADN pET28a_NgTET_donor par clonage Golden Gate15
    1. Pour la génération de l’ADN du donneur, ordonnez la séquence souhaitée en tant que gène entier ou amplifiez à partir d’un génome, par exemple à partir du génome du phage, et introduisez la mutation souhaitée.
      REMARQUE : Pour la conception de l’ADN du donneur, incluez les régions homologues flanquant le site cible (≈200 pb de chaque côté pour les mutations ponctuelles ; régions plus longues pour les inserts plus grands). Le fragment donneur linéaire doit porter des sites de reconnaissance BsaI qui génèrent des surplombs compatibles avec le plasmide lors du clivage. Le clonage in silico est recommandé pour vérifier la conception de la construction. Dans les résultats représentatifs, tous les composants critiques pour l’ADN du donneur sont illustrés dans un exemple.
    2. Introduisez le fragment d’ADN du donneur en aval de la séquence codante NgTET et du terminateur dans le squelette pET28a_NgTET à l’aide de l’assemblage Golden Gate.
      1. Préparez les réactions d’assemblage en combinant 70 fmol de plasmide pET28a_NgTET, 140 fmol d’insert d’ADN donneur, 1 μL de BsaI (20 U/μL), 5 μL d’ADN ligase T4 et 2 μL de tampon 10× ligase, avec de l’eau sans nucléase ajoutée à un volume final de 20 μL.
      2. Exécutez les réactions en 25 cycles dans un cycleur PCR avec les paramètres suivants : 1) Restriction, 37 °C pendant 1,5 min, 2) Ligature, 16 °C pendant 3 min, 3) Restriction finale, 37 °C pendant 5 min, et 4) Dénaturation, 60 °C pendant 10 min.
    3. Ajouter 6 μL du mélange réactionnel (de l’étape 3.1.2) à 100 μL d’E. coli DH5α chimiquement compétent, incuber sur glace pendant 10 min et subir un choc thermique à 42 °C pendant 45 s. Placez immédiatement les cellules sur de la glace pendant 1 min, puis ajoutez 750 μL de fluide. Récupérer à 37 °C en secouant (500 tr/min) pendant 1 h. Déposer sur une gélose LB contenant de la kanamycine (30 μg/mL) et incuber toute la nuit à 37 °C.
    4. Choisissez une seule colonie et inoculez 20 mL de milieu LB complété par de la kanamycine (30 μg/mL). Incuber toute la nuit à 37 °C en secouant à 160 tr/min.
    5. À partir de 5 ml de culture de nuit, granulez les cellules et isolez l’ADN plasmidique à l’aide d’une méthode d’extraction plasmidique standard. Éluer le plasmide dans 40 μL d’eau exempte de nucléases.
    6. Confirmez le clonage correct en séquençant le site d’insertion du plasmide à l’aide du séquençage de Sanger.
  2. Construction de plasmides CRISPR-Cas contenant des espaceurs (pCpf1-sp comme modèle)15
    REMARQUE : Le plasmide décrit dans ce chapitre permet la première étape de la mutagénèse en introduisant une cassure double brin spécifique au site dans le génome du phage. Bien que la procédure soit démontrée ici avec le système CRISPR-Cas12 (plasmide pCpfl-sp), d’autres nucléases telles que CRISPR-Cas9 (plasmide DS-spCas) peuvent également être utilisées15 .
    1. Concevoir un espaceur de 20 nt ciblant le site de mutagénèse (PAM : TTTV). Identifier et concevoir des protospacers appropriés et des espaceurs correspondants à l’aide d’outils bioinformatiques.
    2. Synthétiser deux oligonucléotides 5′-phosphorylés. Assurez-vous que chacun porte 10 nt de la séquence d’espacement souhaitée (formant ensemble l’espaceur complet de 20 nt) et une région supplémentaire de 10 nt complémentaire au site d’insertion dans le plasmide pCpf1-sp.
    3. Insérez l’espaceur CRISPR-Cas conçu dans le plasmide pCpf1-sp par amplification PCR à l’aide des amorces de l’étape 2. Configurer la réaction comme suit (volume final 50 μL) : 5 μL 10× tampon GC, 1 μL 10 mM dNTPs, 1 μL d’amorce directe (10 μM), 1 μL d’amorce inverse (10 μM), 2,5 μL de DMSO, matrice plasmidique correspondant à 2 fmol, 1 μL d’ADN polymérase Phusion (2 U/μL) et eau sans nucléases à 50 μL.
    4. Placez les tubes de réaction dans un thermocycleur et exécutez le programme suivant : dénaturation initiale à 98 °C pendant 30 s ; 25 cycles à 98 °C pendant 10 s, recuit à la température appropriée (X °C) pendant 30 s et extension à 72 °C pendant 6 min ; suivi d’une extension finale à 72 °C pendant 10 min. Maintenez les échantillons à 4 °C jusqu’à la suite du traitement.
    5. Mélangez 5 μL de la réaction PCR avec un tampon de charge d’ADN (10×) et chargez-le sur un gel d’agarose à 1 %. Faites fonctionner le gel à 130 V pendant 20 min et visualisez les bandes d’ADN à l’aide d’un éclairage trans UV. Si l’amplification réussit, purifier le produit de PCR à l’aide d’un kit de nettoyage approprié et éluer dans 20 μL d’eau sans nucléases.
    6. Circulariser le plasmide par ligature en utilisant 100 ng du produit amplifié mélangé à 1× tampon d’ADN ligase T4 et 60 U d’ADN ligase T4 dans un volume de réaction total de 15 μL. Incuber pendant 1 h à température ambiante. Transformer 100 μL d’E. coli chimiquement compétent avec le produit de ligature comme décrit à l’étape 3.1.3. Plaquez les cellules sur une gélose LB contenant 50 μg/mL de streptomycine et incubez toute la nuit à 37 °C.
    7. Prélever une seule colonie dans la plaque et l’inoculer dans 20 mL de milieu LB complété par 50 μg/mL de streptomycine. Incuber toute la nuit à 37 °C en secouant à 160 tr/min. À partir de 5 mL de la culture de nuit, récolter les cellules par centrifugation et isoler l’ADN plasmidique à l’aide de la méthode d’extraction plasmidique de votre choix. Éluer le plasmide dans 40 μL d’eau exempte de nucléases.
    8. Confirmez la réussite du clonage en séquençant le plasmide au site d’insertion à l’aide du séquençage de Sanger.
  3. Mutagénèse des phages
    1. Transformez les cellules d’E. coli BL21 (DE3) avec deux plasmides : l’ADN-pET28a_NgTET_donor et l’espaceur pCpf1-sp (Cas12)/DS-SPcas (Cas9) (généré aux étapes 3.1 et 3.2). Mélangez 1 μL de chaque plasmide avec 100 μL d’E. coli BL21 (DE3) chimiquement compétent. Suivez le protocole décrit à l’étape 3.1.3. Plaquez les cellules transformées sur une gélose contenant 50 μg/mL de streptomycine et 30 μg/mL de kanamycine, et incubez toute la nuit à 37 °C.
    2. Inoculer la souche transformée d’E. coli (E. coli BL21 (DE3) pET28a_NgTET_donor-ADN et pCpf1-sp(Cas12)/DS-SPcas(Cas9)_spacer) dans 10 mL de milieu LB complété par 30 μg/mL de kanamycine et 50 μg/mL de streptomycine. Incuber toute la nuit à 37 °C en secouant à 160 tr/min.
    3. Le lendemain, diluer la culture de nuit jusqu’à une dose initiale de600 DO de 0,1 dans 50 mL de milieu LB contenant 30 μg/mL de kanamycine et 50 μg/mL de streptomycine.
    4. Cultivez la culture à 37 °C en agitant à 160 tr/min jusqu’à ce qu’une OD600 de 0,8 soit atteinte. Baissez la température à température ambiante (RT) et réduisez la vitesse d’agitation à 130 tr/min.
      1. Pour améliorer l’adsorption des phages et l’injection d’ADN, ajoutez du MgCl2 et du CaCl2 à des concentrations finales de 1 mM chacune, car ces cations divalents facilitent l’efficacité des interactions phage-hôte.
      2. Infecter la culture avec des phages T4 prétraités au NgTET et, en tant que témoin négatif, avec des phages T4 non traités au NgTET à un moment d’inertie de 0,1. Poursuivre l’incubation à RT pendant 4 h.
    5. Après l’incubation, transférez les cultures dans un tube conique de 50 mL et centrifugez-les à 4000 × g à 4 °C pendant 20 min pour granuler les cellules. Filtrez les surnageants à travers un filtre de 0,45 μm pour éliminer les cellules bactériennes résiduelles. Utilisez les surnageants filtrés pour les dosages de plaque (décrits à l’étape 2.2) pour déterminer la concentration de phages ou effectuer une contre-sélection.

4. Identification des mutants

REMARQUE : Le but de la contre-sélection est de diminuer la proportion de phages de type sauvage restant dans la population après la mutagénèse. Pour cela, des phages obtenus à partir de l’étape de mutagénèse (étape 3.3) sont utilisés pour infecter E. coli portant le même système CRISPR-Cas13, qui est codé par un autre plasmide pBA560 (informations supplémentaires dans le tableau 1) et la même séquence d’espacement appliquée lors de la mutagénèse. Dans cette configuration, les nucléases Cas reconnaissent et clivent sélectivement l’ADN des phages de type sauvage, tandis que les phages porteurs des mutations souhaitées ne sont pas affectés. Cette pression sélective supprime la réplication de type sauvage et enrichit la population de phages mutants14.

  1. Contre-sélection avec Cas13
    1. Infecter E. coli Cas13a_spacer (plasmide pBA560) avec les phages pour la contre-sélection. Cette étape facilite la contre-sélection en dégradant l’ARN du phage qui n’a pas subi la mutation prévue.
    2. Effectuez la contre-sélection dans les mêmes conditions que celles utilisées lors de la mutagénèse (voir étapes 3.3.1-3.3.5). Utiliser E. coli exprimant un espaceur Cas13a non ciblé comme témoin négatif pour confirmer que la réduction de la plaque est spécifique à l’espaceur.
    3. Après l’incubation, filtrer le surnageant contenant des phages contre-sélectionnés à travers un filtre de 0,45 μm pour éliminer les débris bactériens.
      REMARQUE : (POINT DE PAUSE) Les phages filtrés sont stables pendant plusieurs mois à 4 °C, stockés dans un milieu LB dans une bouteille en verre.
    4. Utilisez les phages contre-sélectionnés et filtrés pour un test de plaque sur une souche d’E. coli B afin d’isoler des plaques individuelles pour une validation en aval.
  2. Séquençage de nouvelle génération (~ 1 semaine)
    REMARQUE : La méthode de séquençage hautement multiplexé implique un processus de PCR en deux étapes pour générer de l’ADN d’amplicon multiplexé adapté au séquençage de nouvelle génération à lecture longue16.
    1. Séparez les phages de la mutagénèse en les enfonçant comme décrit à l’étape 2.2. Inclure des contrôles appropriés en utilisant des phages obtenus par mutagénèse réalisée en présence et en absence d’expression de NgTET. En tant que contrôle, le ciblage de CRISPR-Cas9 et Cas12 sans NgTET ne devrait pas entraîner l’introduction de mutations ponctuelles. En revanche, la co-expression de NgTET devrait permettre une édition réussie, conduisant à une efficacité de mutagénèse plus élevée.
    2. Pour isoler les phages individuels, prélevez des plaques individuelles dans la plaque et transférez-les dans un tube contenant 100 μL de tampon Pi-Mg (26 mM Na2PHO4, 68 mM NaCl, 22 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, pH 7,5) et 1 μL de CHCl3.
      ATTENTION : Le chloroforme est toxique, volatil et soupçonné d’être cancérigène, même en petites quantités. Manipulez uniquement dans une hotte et portez un équipement de protection complet, y compris une blouse de laboratoire, des lunettes de sécurité et des gants en nitrile. Évitez l’inhalation et le contact avec la peau. Conserver dans un récipient hermétiquement fermé dans une armoire chimique ventilée et inflammable. Éliminer les déchets de chloroforme par le biais de la collecte des déchets dangereux.
    3. Utilisez 1 μL de phage T4 isolé dans un tampon Pi-Mg comme matrice pour le dépistage.
    4. Préparez le mélange réactionnel avec 0,125 μM de chaque amorce (autour de la position d’insertion) et 1x master mix polymérase de haute précision, en ajustant le volume total de la réaction d’amplification à 10 μL. Exécutez une réaction PCR avec 30 cycles d’amplification.
    5. Effectuez une deuxième PCR pour fixer les codes-barres. Par conséquent, utilisez 1 μL d’une dilution de 1:10 du produit de la première PCR comme modèle.
    6. Préparez le mélange réactionnel avec des amorces de codage à barres de 0,3 μM et un mélange de polymérase à démarrage à chaud haute fidélité dans un volume total de 7 μL. Effectuez une PCR avec 20 cycles d’amplification.
      REMARQUE : (POINT DE PAUSE) Les produits PCR peuvent être stockés à -20 °C pendant plusieurs semaines.
    7. Regroupez tous les produits de PCR à code-barres et purifiez-les à l’aide d’un nettoyage à base de billes magnétiques conformément aux protocoles standard pour la préparation de banques de séquençage de nouvelle génération.
    8. Capturer l’ADN à l’aide de billes magnétiques, laver deux fois avec de l’éthanol à 80 % et éluer dans 100 μL de tampon d’élution (5 mM de Tris-HCl, pH 8,5).
    9. Mesurer la concentration d’ADN à l’aide de méthodes spectrophotométriques et fluorométriques, en appliquant un dosage à large gamme ou à haute sensibilité, selon le cas.
      REMARQUE : (POINT DE PAUSE) L’ADN peut être conservé à -20 °C pendant plusieurs semaines.
    10. Générez des banques de séquençage à l’aide d’un protocole basé sur la ligature selon les instructions du fabricant, en commençant par 1 μg d’ADN d’entrée.

5. Propagation mutante, récupération des modifications de l’ADN et preuve

REMARQUE : Une fois que le mutant de phage souhaité est identifié, il se propage chez E. coli de type sauvage pour rétablir des niveaux de modification de l’ADN similaires à ceux du phage WT. Cela garantit que le phage mutant peut être utilisé dans des expériences biologiques ultérieures sans aucun compromis, à l’exception de la mutation introduite.

  1. Préparez une culture de 10 mL de la souche E . coli B dans un milieu LB et incubez toute la nuit à 37 °C en agitant à 160 tr/min.
  2. Le lendemain, inoculer un milieu frais de 50 mL LB avec la culture de nuit pour obtenir une DO initiale de600 de 0,1.
  3. Laisser pousser la culture à 37 °C en l’agitant à 160 tr/min jusqu’à ce qu’elle atteigne une OD600 de 0,8.
  4. Ajouter 50 μL du stock de phages mutants (4.2.2) à la culture. Retirez la phase avec précaution pour éviter de transférer CHCl3.
  5. Incuber la culture infectée pendant la nuit à température ambiante en secouant doucement à 120 tr/min.
  6. Après l’incubation, centrifuger la culture à 4000 × g pour éliminer les cellules bactériennes. Filtrez le surnageant à travers un filtre de 0,45 μm pour recueillir le phage.
  7. Transférez le phage mutant filtré dans un récipient en verre et conservez-le à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit utilisé ultérieurement.
    REMARQUE : (POINT DE PAUSE) Les phages filtrés sont stables pendant plusieurs mois à 4 °C, stockés dans un milieu LB dans une bouteille en verre.
  8. En tant que validation facultative de la régénération des modifications de l’ADN, en particulier des cytosines glycosylées, effectuez une analyse LC-MS comme décrit à l’étape 2.1.
    1. À cette fin, purifier l’ADN du phage récupéré de la descendance du phage comme indiqué à l’étape 2.1.1, isoler comme à l’étape 2.1.2, puis préparer l’analyse par LC-MS comme décrit à l’étape 2.1.3.
    2. Analysez les chromatogrammes ioniques et calculez l’abondance relative de chaque modification en normalisant la surface du pic de chaque signal à la surface du pic dG dans l’échantillon, en utilisant dG comme étalon interne spécifique à l’échantillon, comme décrit aux étapes 2.1.3.
      REMARQUE : Il est recommandé d’inclure le phage de type sauvage T4, le phage T4 traité avec NgTET et le phage T4 traité avec le variant inactif NgTET D234A comme témoins, afin de valider et de comparer directement l’abondance de 5ghmdC10.

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Résultats

Identification de la bande lysologique dans le gradient.
La visibilité de la bande phage dans le gradient dépend de la concentration de phages dans l’échantillon initial chargé sur le gradient. Lorsque le phage est suffisamment concentré (~>1 × 1011 PFU/mL), la bande peut être clairement visible en éclairant le gradient par le bas avec une source lumineuse (voir Figure 3).

Cependant, à de faibles concentrations de phages, la bande...

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Discussion

Cette étude présente une stratégie robuste et adaptable pour introduire des mutations ponctuelles précises dans les génomes des bactériophages, y compris des modifications mononucléotidiques. Un élément central du flux de travail est l’intégration d’étapes de validation strictes à chaque étape, ce qui est essentiel pour garantir à la fois la précision et l’efficacité de l’édition du génome. Ceci est particulièrement critique compte tenu de la nature en plusieurs étapes du flux de travail...

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Déclarations de divulgation

KH et NP ont déposé une demande de brevet européen pour « Ingénierie des phages », demande de brevet européen n° 23 175 257.7. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

Ce projet a reçu un financement du Conseil allemand de la recherche (DFG ; SPP 2330 numéro de projet 464500427, RTG 2355 projet 11 et RTG 2937 (numéro de projet 505997786) de la Société Max Planck (financement du chef de groupe de recherche Max Planck à K.H.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes de réaction de 1,5 mLSarstedt72.690.001
Tubes canociaux de 15 mLSarstedt62.554.502
Tubes en polypropylène à paroi mince ouverts de 15 mlBeckman Coulter Sciences de la vie36170616 mm x 95 mm (pour l’ultracentrifugation)
Tubes canoniques de 50 mLSarstedt62.547.254
5x tampon GCThermo Fisher Scientific  ;F519L
6x Colorant de chargement d’ADN TriTrack  ;Thermo Fisher Scientific  ;Réf. R1161
AgaroseBIOSCIENCE des méridiensBIO-41025Qualité moléculaire
Centrifugeuse Avanti J-30IBeckman Coulter Sciences de la viepas de catalogue  ; nombreSerien-Nr. JKY14M01, https://www.beckman.de/centrifuges/ultracentrifuges/optima-xe
Acide borique  ;Merck10043-35-3
BsaI-HF v2ONÉR3733S
Chlorure de calciumhexahydratACROS ORGANIQUES7774-34-797 %, extra pur  ;
Densimètre de celluleBiochrom de Harvard  ;80211630
ChemiDoc MP  ;Biorad12003154
ChloroformeVWR650498
CuvettesSarstedt67.742
Diméthylsulfoxyde (DMSO)  ;Sigma AldrichD4540
Hydrogénophosphate disodiqueneoFroxx GmbH7558-79-4Qualité pharmaceutique
Pipettes Pasteur jetables en verreVWR612-1702230 millimètre
DNase I  ;Roche471672800110 U/µ ; L
Mixage dNTP (10 mM chacun)Sigma-Aldrich72004
DS_SPcas_ModAProduit maison.https://github.com/MaikTungsten/CRISPRT4/tree/main/Plasmid_mapsConstruction plasmidique contenant de l’ARNsg CRISPR-Cas12/ModA
DS-spCas (système CRISPR-Cas9)Addgene  ;48645 (numéro d’accessoire addgene)Plasmide pour la construction de plasmides CRISPR-Cas contenant des espaceurs (système CRISPR-Cas9) pour la mutagénèse des phages (étape 3.2)
La souche B d’E. coli a été utilisée pour l’infection à la T4DSMZpas de catalogue  ; nombreEscherichia coli (Migula 1895) Castellani et Chalmers 1919 (DSM 613, ATCC 11303)
E. coli BL21 (DE3) Souche d’expression, cellule compétenteInvitrogenC600003Expression souche, cellules compétentes.
E. coli DH5 et alpha ; Souche de clonage, cellules compétentesInvitrogen18265017Clonage de la souche, cellules compétentes.
EDTARoth8043.2
Éthanol (absolu)  ;VWR200-578-6
Cellule d’écoulement FlongleOxford Nanopore Technologiespas de catalogue  ; nombreR10.4.1. Chimie, https://nanoporetech.com/document/flongle
Kit de mini-préparation du plasmide Gene JET  ;Thermo Fisher Scientific  ;10242490
GeneRuler 1 kb Plus Échelle d’ADNThermo Fisher Scientific  ;Référence SM1331
Échelle d’ADN GeneRuler ULR  ;Thermo Fisher Scientific  ;Référence SM1213
Maître du dégradé 108BIOCOMPpas de catalogue  ; nombrehttps://biocompinstruments.com/our-approach/gradient-forming
Centrifugeuse Heraeus Pico 17Thermo Scientific75002410
Infors HT Incubateur MinitronInfors AGpas de catalogue  ; nombrehttps://infors-ht.com/de/produkte/inkubationsschuettler/minitron#productspecs
Isopropyl-&bêta ;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)Sigma-Aldrich367-93-1
KanamycineCarl RothRéf. T832.1
LB-AgarCarl-RothX969.1
LB-medium (Luria/Miller)  ;Carl-RothPoste 968.1
Chlorure de magnésium hexahydratéSigma-Aldrich7791-18-6
Sulfate de magnésiumSigma-Aldrich7487-88-9
Appareil MinION  ;Oxfrod Nanopore Technologiespas de catalogue  ; nombrehttps://store.nanoporetech.com/eu/minion.html
ModA E165A_fwIDTGAATTAGTTTCAGATGA
ACAAGCGGTAATGATAC
CAGCT		Introduction directe pour l’introduction de la mutation ponctuelle pour ModA E165A et pour l’introduction d’extrémités collantes pour le clonage Golden Gate (étape 3.1)
ModA E165A_revIDTCATATTACGATAACGA
TGACTATCCGGAAAC		Amorce inverse pour l’introduction de la mutation ponctuelle pour ModA E165A et pour l’introduction d’extrémités collantes pour le clonage Golden Gate (étape 3.1)
ModA_sgRNA_Cas12_fwIDTTCTTGTTCATCTACAAC
AGTAGAAATTAATTTAAA
GTTCTTAGACCCG		Amorce avant pour générer un espaceur pour les systèmes CRISPR-Cas12/ CRISPR-Cas9/ CRISPR-Cas13 pour la mutagenèse et la contre-sélection des phages (étapes 3.2 et 4.1)
ModA_sgRNA_Cas12_revIDTAGTAATGATAAAGAACT
TTAAATAATTTCTACTGT
TGTAGATGCTAC		Amorce inverse pour générer un espaceur pour les systèmes CRISPR-Cas12/ CRISPR-Cas9/ CRISPR-Cas13 pour la mutagenèse et la contre-sélection des phages (étapes 3.2 et 4.1)
Spectrophotomètre NanoDrop ND-1000  ;Thermo Fisher ScientificAZY2019944
Kit NucleoMag  ;Machery NagelRÉF 744970.50
Mélange de digestion nucléosidique  ;Biolabs de la Nouvelle-AngleterreM0649S
pBA560 (système CRISPR-Cas13)Addgene186236 (numéro d’accessoire addgene)Système CRISPR-Cas13 codant pour la contre-sélection (étape 4.1)
Plasmide pCpfl-sp (système CRISPR-Cas12)Addgene122186
Plasmide pCpfl-sp (système CRISPR-Cas12)Addgene122186 (numéro d’accessoire addgene)Plasmide pour la construction de plasmides CRISPR-Cas contenant des espaceurs (système CRISPR-Cas12) pour la mutagénèse des phages (étape 3.2)
Récipients de réaction PCRSarstedt72.991.002
PeqGREENVWR732-3196
pET28a_NgTETProduit maison.pas de catalogue  ; nombreplasmide est disponible sur demande, la carte plasmidique peut être trouvée aux https://zenodo.org/records/10615143  suivants ;
pET28a_NgTETProduit maison.pas de catalogue  ; nombrePlasmide pour la construction de pET28a_NgTET_donor ADN via le clonage Golden Gate (étape 3.1), plasmide  ; est disponible sur demande, la carte plasmidique peut être trouvée aux https://zenodo.org/records/10615143  suivants ;
Plaques de PétriSarstedt82.1473.00192 x 16 mm avec cames
Phusion ADN polymérase  ;Thermo Fisher Scientific  ;F-530XL2 U/µ ; L
Potassium PhosphateSigma Aldrich7778-77-0Monobasique
Bloc d’alimentation universel PowerPacBio Rad1645070
Protéinase K  ;Carl Roth  ;7528.1100 mg/mL
Kit de purification QIAquick PCR  ;QIAGEN28506
Fluormètre Quantus, système dsDNA QuantiFluorPromegaE2670
RNase A/T1  ;Thermo Fisher ScientificLa norme EN0551mélanger 2 mg/mL de RNase A 5000 U/mL de RNase T1  ;
Roti-Aqua P/C/I pour l’extraction de l’ADN  ;Carl RothPoste X985.1
Acétate de sodium  ;Sigma-Aldrich127-09-3
Chlorure de sodium  ;Sigma-Aldrich7647-14-5
SQK-LSK109 Kit de séquençage de ligatureOxford Nanopore Technologiespas de catalogue  ; nombrehttps://nanoporetech.com/document/gDNA-q-sqk-lsk109
Filtres Steritop, 0,22 & micro ; M Taille des poresMilliporeS2GPT05RE250 mL et 500 mL
Streptomycine 50 mg/LCarl RothHP66.1
SuccroseNeoFroxx GmbH57-50-1pour la biologie moléculaire  ;
Rotor oscillant en aluminium  ;Beckman Coulter Sciences de la vieJS[1]24.15
T4 ADN Ligase 5 U/µ ; LThermo Fisher Scientific  ;EL0011
Tampon d’ADN ligase T4Thermo Fisher Scientific  ;B69
Tubes à essai, paroi épaisse, sans rebordKarl Hecht GmbH42775054100 mm x 18 mm
Thermocycleur, T100Biorad1861096
Thermomixeur confort  ;Eppendorf5382000015
Trizma BaseSigma Aldrich77-86-1
Baignoire d’eau, VWB2  ;VWR462-0557Volume de 12 L

Références

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Dioxyg nase NgTETdition du g nome de phagesmodifications de l ADNmutagen se dirig eing nierie des bact riophagesclonage Golden Gateessai par plaquesphage T4 d Ecoli

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