Évaluation des réponses foliaires aux métabolites secondaires microbiens en utilisant un format à haut débit

Résumé

Ce protocole décrit une approche à haut débit pour évaluer la fuite d’ions de la plante, l’activité de la peroxydase et la production de callose dans le même échantillon.

Résumé

Les microbes sécrètent des métabolites secondaires structurellement divers lors de l’infection végétale, dont certains sont détectés par les cellules végétales, qui déclenchent des réponses au stress. Dans cette méthode, l’induction de fuite ionique, d’activité de peroxydase et de production de callose est mesurée dans le même échantillon de disque foliaire. Premièrement, Arabidopsis ou disques de feuilles d’orge sont infiltrés sous vide dans une plaque à 96 puits. Après 4 à 6 heures, la conductivité est mesurée, suivie de l’activité de la peroxydase et du dépôt de callose à 24 heures. Le peptide FLG22 déclenche les trois réponses et constitue un contrôle positif abordable. Les lipopeptides cycliques surfactine et gramilline induisent respectivement l’activité de la peroxydase et la fuite d’ions, tandis que le trichothène phytotoxique T-2 supprime l’activité de la peroxydase. Dans l’ensemble, cette approche permet de multiples comparaisons entre les génotypes des plantes ou les traitements de métabolites. Cette approche peut être appliquée à la génétique chimique ou à la bioprotection pour identifier les composés modulant le stress à des études ultérieures. En génétique végétale, cette approche peut être utilisée pour comparer les réponses entre populations végétales pour la cartographie génétique et pour améliorer notre compréhension des interactions plante-microbe.

Introduction

Les plantes réagissent à diverses molécules microbiennes pour activer les réponses cellulaires au stress, ce qui peut aboutir à une résistance aux maladies. Les motifs moléculaires associés aux microbes (MAMP), tels que le peptide flg22 issu de la flagelline bactérienne, sont détectés par les protéines réceptrices végétales pour initier un certain nombre de réponses de signalisation cellulaire. Cela inclut des réponses précoces telles que les cascades de kinases, la production d’espèces réactives d’oxygène (ROS), les pics de calcium, la dépolarisation membranaire, et des réponses tardives comme le dépôt de callose et l’induction d’activité^{peroxydase 1}. Les métabolites secondaires microbiens (MSM) sont de petites molécules (50 à 1 500 Daltons), structurellement diverses, indispensables à la croissance et au développement, mais favorisant la survie du microbe. Certains HSH induisent des réponses de stress cellulaire chez les plantes, bien que les mécanismes impliqués dans l’initiation de ces réponses restent non^{résolus 2,3}. Les mécanismes proposés pour la reconnaissance des MSM par les plantes incluent la mécanosension, les modifications protéiques induites par des redox, ou la signalisation à base de^{lipides 4,5}. Dans certains cas, le MSM induit des réponses au stress ou cause des dommages cellulaires selon la concentration. Par exemple, la toxine T-2 induit la production de callose et de ROS à 1 μM et provoque la mort cellulaire à 10 μM, et est généralement décrite comme une^{phytotoxine 4}. Les MSM influencent la pathogenèse dans certaines interactions plante-microbe et peuvent déclencher soit la susceptibilité des plantes, soit la résistance. Par exemple, le lipopeptide cyclique gramilline induit la production de ROS, la fuite d’ions et la production de callose tout en augmentant la susceptibilité de l’orge à Fusarium^{graminearum 2}. Les lipopeptides cyclics syringomycine et syringopepitine induisent la production de ROS des plantes et favorisent la résistance de l’hôte contre la bactérie Pseudomonas fluorescens ³. D’autres MSM, tels que la surfactine et l’iturine, sont produits par des microbes non pathogènes et favorisent la résistance contre une infection pathogène ultérieure en induisant des réponses de stress chez les plantes ^6,7. Ces MSM bioprotecteurs induisent des réponses cellulaires, notamment les flux d’ions, la production de ROS, les changements transcriptionnels et la production de^{callose 8}. Comprendre les interactions entre les MSH et les plantes pourrait aider à déterminer le rôle des MSM dans la résistance aux maladies et à identifier les gènes de l’hôte qui pourraient être exploités pour améliorer la résistance des cultures.

Les méthodes actuelles pour évaluer les réponses au stress des plantes induites par le MSM consistent généralement à tester une réponse au stress à^{la fois 8}. Étant donné que le MSM secondaire peut être difficile à extraire et qu’une quantité limitée de métabolites peut être disponible, tester plusieurs réponses au sein d’un même échantillon peut rassurer que le MSM a un effet sur les cellules végétales. Une méthode à haut débit pour évaluer les poussées ROS apoplasiques consiste à détecter la luminescence générée par le luminol oxydé en présence de peroxydase de raifort⁹. Malheureusement, la luminescence à base de luminol est atténuée par des cations et certains solvants, limitant l’utilisation de ce test pour les extraits contenant des sels ou pour les molécules non polaires qui doivent être dissoutes dans le DMSO, nécessitant une méthode efficace avec ces^{contaminants 9}. Pour répondre à ces problèmes, nous avons étendu les méthodes actuelles pour évaluer trois réponses au stress (fuite ionique, activité peroxydase et callose) à partir d’un même échantillon foliaire dans un test à haut débit (Figure 1)10,11,12. Notre approche consiste à traiter les disques foliaires avec des MSM en utilisant une infiltration sous vide dans une plaque à 96 puits. Ensuite, des mesures de conductivité sont effectuées 4 à 6 heures après le traitement pour évaluer la fuite ionique, suivies de mesures de l’activité peroxydase et des dépôts de callose à 24 heures. Notre approche a été optimisée pour Arabidopsis et l’orge, mais pourrait être étendue à d’autres espèces végétales avec validation expérimentale. Par exemple, l’activité induite de la peroxydase d’orge n’est pas détectable avec cette méthode, mais la suppression de l’activité par des composés toxiques peut être détectée. Ainsi, les caractéristiques foliaires ou l’amplitude de la réponse induite varient selon les espèces, ce qui limite l’applicabilité de cette approche à certaines espèces végétales.

La conception expérimentale utilisant cette méthode doit prendre en compte les témoins, la réplication et la concentration de MSM utilisés afin d’obtenir les meilleurs résultats. Un contrôle négatif est essentiel pour identifier les HSH qui induisent des niveaux statistiquement différents de réponse au stress par rapport aux effets des blessures. Idéalement, le témoin négatif devrait contenir le même solvant que le MSM mais sans le MSM. Les solvants typiques pour les MSM hydrophobes incluent le DMSO et le méthanol, qui induisent des réponses cellulaires telles que la production de ROS à haute^{concentration 13,14}. Dans cet essai, nous observons un impact sur l’activité de la peroxydase, où 10 % ou plus de DMSO et de méthanol bloquent l’activité de la peroxydase induite par FLG22 (Figure 2). Dans le cas des extraits complexes, il peut être difficile de développer un contrôle négatif dépourvu de MSM lorsque les métabolites d’intérêt sont inconnus. Au lieu de cela, fractionner les extraits en fonction de la taille, de la polarité ou de la charge permettrait de comparer les fractions relatives pour identifier la fraction la plus stressante pour une analyse ultérieure. De plus, inclure un témoin positif, tel que 1 μM flg22 ou 10 μM T-2, permet au chercheur d’évaluer que le test fonctionne. Nous recommandons d’inclure quatre réplications techniques par traitement et d’inclure des témoins positifs et négatifs sur chaque plaque lorsque plusieurs plaques sont mesurées dans une expérience.

Dans l’ensemble, cette approche capture trois réponses au stress des plantes induites par le MSM, offrant une méthode accessible et économique pour étudier les interactions plante-MSM. Le format à haut débit permet aux chercheurs de capter des différences subtiles entre les génotypes végétaux ou les extraits microbiens au sein d’une même unité expérimentale. Cela permet des approches systémiques pour comprendre les familles de gènes végétaux ou pour sonder les populations végétales en vue d’une cartographie génétique. Du côté des microbes, cette approche pourrait être utilisée pour dépister d’éventuels composés bioprotecteurs ou, en génomique chimique, pour identifier des composés qui améliorent ou suppriment des réponses spécifiques au stress.

Protocole

1. Préparation et traitement de l’échantillon

REMARQUE : Toutes les précautions de sécurité appropriées et les pratiques d’élimination doivent être prises afin de minimiser les risques pour l’expérimentateur et l’environnement.

1. Culture des plantes
   1. Faites pousser Arabidopsis jusqu’au stade de 4-5 semaines sur un mélange de sol Cornell (300 tourbe : 630 vermiculite : 1 engrais à libération lente : 4,2 chaux) avec deux plants par pot dans 24 pots par plateau. Arrosez les plantes par en dessous en ajoutant de l’eau au plateau. Réglez les conditions de la chambre de croissance à 21 ^{°C en}continu avec 16 h de lumière et 8 h d’obscurité, et maintenez une humidité d’environ 30-50 %. Utilisez les feuilles^entièrement dilatées de 5 à 9 pour expérimenter et récolter le matin.
   2. Cultivez de l’orge jusqu’à ce que les première et deuxième vraies feuilles soient complètement dilatées dans 75 terreau : 24 terre noire : 1 mélange de terreau calcaire. Plantez une graine par pot dans 24 parcelles par plateau, en arrosant au besoin. Réglez les conditions de la chambre de croissance à 21 ^°C avec 16 h de lumière et 8 h d’obscurité à environ 30-50 % d’humidité. Échantillonnez les première et deuxième feuilles complètement dilatées et récoltez le matin.
2. Collectez trois disques foliaires par plante à l’aide d’un foreur de liège de 4 mm de diamètre, en évitant la nervure centrale. Évitez de macérer le tissu en utilisant un foreur tranchant avec un mouvement de torsion.
3. Placez immédiatement et doucement les disques foliaires dans un puits d’une plaque à 96 puits dans 196 μL de Milli-Q_{H 2O}stérile. Continuez à collecter les disques jusqu’à ce que le nombre requis d’échantillons soit collecté.
4. Ajouter des métabolites secondaires ou des traitements à solvant à la concentration souhaitée à un volume final de 200 μL dans chaque puits.
5. Placez la plaque à 96 puits avec le couvercle fermé dans un clochon avec une buse sous vide.
6. Fixez le tuyau de vide à la buse de la cloche et activez la pression sous vide jusqu’à ce que le vide atteigne 9,8 livres/pouce carré (généralement 10 secondes). Répétez ce processus une fois de plus.
7. Placez le couvercle sur la plaque et incubez sur un vibreur orbital (55 tr/min) sous une lampe (13 W, 50 μmol∙^m-2∙^s-1) placée à 23 cm au-dessus du shaker pendant 4 heures.

2. Mesures de fuite ionique

1. Lavez la sonde dans de l’eau Milli-Q et tamponnez légèrement sur Kimwipe pour sécher. Notez la lecture de conductivité de l’eau pour référence.
2. À 4 à 6 heures après le traitement, prélever et enregistrer la conductivité des puits individuels en immergeant la sonde dans le liquide entourant le disque foliaire. Maintenez la plaque à un angle de 45° pour vous assurer que la sonde est bien imerse.
3. Rincez la sonde entre les échantillons en l’immergeant dans de l’eau Milli-Q et en tamponnant la sonde jusqu’à la sécher sur un Kimwipe. Parfois, testez la conductivité de l’eau pour vous assurer que les relevés de la sonde restent stables.
4. Placez un film plastique de scellement sur la plaque et revenez au shaker orbital pour incubation toute la nuit.

3. Mesures de l’activité de la peroxydase

1. Préparez le substrat de peroxydase chaque jour en solution de 50 mL. Chauffez 40 mL d’eau stérile distillée à 70 ^°C dans un bécher avec une barre de brassage et dissoudez 50 mg d’acide 5-aminosalalicylique (1 mg/mL) dans l’eau chauffée. Ajoutez de l’eau jusqu’à 50 mL et ajustez le pH à 6 avec le NaOH. La solution est photosensible, donc couvrez-le de papier aluminium ou utilisez un tube ambré.
2. Dans un tube conique ambré de 50 mL, préparez une solution à 1 % H₂O₂ en ajoutant 1,7 mL de 30 % d’H₂O₂ à 48,3 mL de Milli-Q_{H 2}O.
3. Juste avant le test, ajoutez 10 μL de la solution à 1 % H_2O2 par millilitre de solution 5-aminosalicylique nécessaire à la génération du milieu du test.
4. Pour prélever les disques de feuilles traités, prélever 50 μL de chaque puits au moment désiré. Transférez sur une plaque claire à fond plat de 96 puits et ajoutez 50 μL du milieu de dosage, en mélangeant en pipettant 5 fois.
5. Incubez la réaction à température ambiante pendant 3 minutes et arrêtez la réaction en ajoutant 20 μL de NaOH 2 N, en tapotant doucement pour mélanger.
6. Mesurez l’absorption des puits à 595 nm dans un lecteur de plaques.

4. Imagerie et analyse de la calleuse

1. Après avoir échantillonné les puits pour le test de peroxydase, retirez le liquide restant des puits et ajoutez 100 μL d’une solution d’acide acétique et d’éthanol (1:3) pour fixation et décoloration. Placez un couvercle sur la plaque et faites couver-la sur un shaker (60 tr/min) dans une hotte pendant 24 heures à température ambiante.
2. Remplacez la solution anti-coloration par une solution fraîche et faites couver encore 24 heures à température ambiante.
3. On pipete la solution décolorante et on ajoute 100 μL de 150 mM_{K 2HPO 4} à chaque puits. Placez l’assiette sur le shaker et faites couver pendant 30 minutes à température ambiante.
4. Retirez la solution de lavage K_{2HPO 4} et ajoutez 100 μL de 150 mM K₂HPO₄ avec 0,1 mg/mL de bleu d’aniline. Couvrez la plaque de 96 puits avec un couvercle et du papier aluminium, puis faites éclore sur un shaker pendant au moins 2 h (Arabidopsis) ou toute la nuit (orge).
   REMARQUE : Le bleu d’aniline est sensible à la lumière et doit être produit frais pour chaque réplique technique.
5. Retirez la solution de bleu d’aniline et remplacez par du glycérol à 50 %. Couvrir les plaques à 96 puits de papier aluminium et les conserver à 4 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à l’image.
6. Placez une goutte de solution de glycérol à 50 % sur une lame en verre propre. Prenez doucement un disque de feuille avec une pince à épiler et placez-le côté abaxial vers le haut sur la lame. Couvrez avec une housse de 1,5 %, minimisant les bulles d’air, et ajoutez 50 % de glycérol supplémentaire si nécessaire pour remplir sous la couche.
7. Mettez au point le matériau feuillu en utilisant une lumière blanche transmise (champ clair) sous un objectif à sec 20x.
8. Sélectionnez la longueur d’onde d’excitation à 370 nm et la longueur d’onde d’émission à 509 nm pour l’imagerie bleue d’aniline, puis fixez un temps d’exposition. Optimisez le temps d’exposition pour permettre un signal suffisant tout en évitant la sursaturation des pixels. Pour une comparaison quantitative des images, assurez-vous que l’intensité du laser et le temps d’exposition sont cohérents pour tous les réplicats biologiques, traitements et réplications techniques.
9. Pour chaque disque feuille, sélectionnez trois champs de vision différents et acquérez des images pour chacun en utilisant les paramètres définis à l’étape 4.8. Acquérir toutes les images avec du matériel végétal remplissant complètement le champ de vision avec un minimum de régions de fond (matière non végétale). Acquiers des images sur un seul plan z à la surface de la feuille.
   REMARQUE : Avoir un peu de fond peut être inévitable et peut être corrigé lors des étapes ultérieures de quantification de l’image. Dans cet exemple, les images sont prises à l’aide d’un microscope à épifluorescence vertical avec une lampe au mercure et le cube filtre DAPI (excitation 360/40 nm, émission 460/50 nm). Dans les cas où une lampe au mercure n’est pas disponible, une source lumineuse LED multi-longueur d’onde peut être utilisée.
10. Pour quantifier les taches de calce à partir d’images, téléchargez et installez le logiciel de traitement d’image FIJI disponible gratuitement en utilisant les instructions en ligne sur https://imagej.net/Fiji/Downloads. Ouvrez FIJI et importez les images bleu aniline pour analyse. Pour cette analyse, utilisez .tiff fichiers avec une résolution d’au moins 300 dpi. Exportez les fichiers image dans .tiff format à l’aide du logiciel de microscope avant l’analyse, ou laissez FIJI ouvrir les fichiers.
    REMARQUE : Fiji peut ouvrir la plupart des types de fichiers propriétaires (par exemple, .czi, .nd2, .lif, .vsi).
11. Réglez l’échelle de l’image (cliquez sur Analyser | Définir l’échelle), en utilisant les valeurs de distance issues du microscope.
12. Convertir l’image en une image en niveaux de gris 32 bits (cliquez sur Image | Type | 32 bits).
13. Ajustez le seuil (cliquez sur Image | Ajuster | Seuil) pour n’inclure que le signal de fluorescence représentant la coloration bleue d’aniline en cliquant sur Auto puis en ajustant manuellement les valeurs minimales et maximales sur la courbe seuil. Une fois le seuil finalisé, cliquez sur Appliquer | Convertir en Masque. En utilisant un logiciel de tableur, écrivez les paramètres seuils sélectionnés pour chaque image.
    REMARQUE : En raison de l’autofluorescence inhérente des échantillons de plantes et du déblaiement des tissus végétaux, le seuil peut varier selon les échantillons. Pour la reproductibilité, il est essentiel d’enregistrer le seuil de chaque image et d’être cohérent dans l’ajustement des valeurs de seuil entre les échantillons.
14. Quantifiez le nombre et la taille des puncta bleus d’aniline en utilisant Analyser les particules (cliquez sur Analyser | Analyser les particules) en utilisant les réglages par défaut. Pour les valeurs moyennes de tous les points dans l’image, sélectionnez Résumé dans la fenêtre contextuelle, puis cliquez sur OK.
15. Copiez-collez ces résultats depuis la case Résumé dans le tableau avec les paramètres seuils pour une analyse ultérieure. Les valeurs incluses dans cette quantification incluent le Count (nombre de points bleu d’aniline), la surface totale (surface totale en^{unités 2} de puncta bleu d’aniline), la taille moyenne (taille moyenne en^{unités 2} de puncta bleu d’aniline), %Surface (pourcentage de couverture moyenne dans les unités² de fluorescence bleu d’aniline par rapport à la surface totale), Périmètre (périmètre moyen de puncta) et IntDen (indication de l’intensité de fluorescence de la coloration bleu d’aniline).
16. Répétez les étapes 4.11-4.15 pour toutes les images acquises pendant l’expérience. Lors de la fermeture d’une image à seuil depuis FIJI, sélectionnez Ne pas sauvegarder pour éviter de changer l’image brute en utilisant le masque seuil.
17. Si des images contiennent une surface avec un fond non végétal, mesurez la surface du tissu végétal en délimitant manuellement la région du tissu végétal à l’aide des outils de sélection polygonale ou à main levée , puis en mesurant la surface (cliquez sur Analyser | Mesure). Copiez cette valeur dans le tableur pour chaque image.
18. Dans un tableur, faites la moyenne des valeurs des trois images de champ de vision d’une réplication biologique. Si certaines images de l’expérience contiennent une surface non végétale (voir étape 4.17), corrigez toutes les valeurs en fonction de la surface de tissu végétal dans chaque image. Par exemple, divisez la valeur de comptage par la surface de tissu végétal pour chaque image avant de faire des graphiques et des comparaisons statistiques.

5. Analyse des données

1. Évaluer la qualité de l’expérience en comparant les témoins positifs aux témoins négatifs dans la même plaque à l’aide d’un test t. Si les témoins positifs n’ont pas produit de changements significatifs dans les réponses au stress, réévaluer les conditions expérimentales telles que la santé des plantes, le moment du traitement, le contrôle négatif et la détérioration potentielle des MSU.
2. Tests de signification
   1. Si toutes les répliques techniques d’un traitement sont évaluées sur la même plaque, analysez les différences entre les traitements individuels et le témoin négatif en utilisant des approches statistiques standard telles qu’une ANOVA unidirectionnelle avec un test de Tukey.
   2. Si des répliques techniques d’un traitement ont été évaluées sur plusieurs plaques, normaliser chaque échantillon par rapport au témoin négatif afin de minimiser l’influence de l’erreur plaque à plaque. Divisez chaque valeur par la moyenne des échantillons témoins négatifs provenant de la même plaque. Soumettez les valeurs normalisées à des méthodes statistiques standard.

Résultats

Grâce à cette méthode, on peut déterminer si un MSM active un sous-ensemble des réponses au stress cellulaire des plantes. Les résultats de ce test permettent de quantifier l’activité de la peroxydase, la fuite d’ions et la production de callose afin de déterminer si un MSM provoque des réponses différentielles par rapport à un témoin négatif. Un résultat positif pour un composé serait indiqué par une différence significative avec le témoin négatif, comme montré pour l’ionophore gramilline, qui induit la fuite d’ions et la production de callose (Figure 3)². Inclure un témoin positif, tel que 1 μM flg22, qui induce les trois réponses, garantit une performance intacte de la plante et des conditions expérimentales (Figure 3)^11,15. Gramillin et FLG22 sont dissous dans l’eau, tandis que la surfactine hydrophobe et la toxine T-2 sont dissoutes dans le DMSO. Pour préparer des molécules hydrophobes, nous préparons d’abord un stock de 10 mM dans le DMSO. Ce stock est utilisé pour obtenir une concentration finale de 10 μM dans de l’eau Milli-Q pour le traitement des feuilles, qui contient 0,1 % de DMSO. La surfactine (10 μM) induit l’activité de la peroxydase et la callose, tandis que la toxine T-2 (10 μM) supprime l’activité de la peroxydase et induit la production de calloses, probablement due à la mort cellulaire ^2,6,16. Utiliser soit de l’eau soit un DMSO à 0,1 % comme témoins négatifs est approprié pour les traitements indiqués, car les deux contrôles produisent des résultats similaires (Figure 2).

Dans nos criblages préliminaires de 100 MSM disponibles commercialement, nous observons une induction de callose pour la plupart des composés que nous avons étudiés (>70 %), tandis que la fuite d’ions et l’activité de la peroxydase sont déclenchées par moins de composés (30 % et 35 %). La majorité de ces composés sont produits par des espèces de Fusarium , y compris sept trichothènes différents tels que le désoxynivalénol (DON) et la toxine T-2. Bien que la réplication soit en cours pour confirmer ces résultats, elle indique des tendances similaires à celles observées pour nos témoins positifs (Figure 3) où la callose a été induite par tous les traitements et la fuite ionique ou la peroxydase a été déclenchée par certains, mais pas tous, des traitements.

Figure 1 : Aperçu de la procédure d’évaluation des réponses cellulaires induites par le MSM dans les feuilles. Les disques foliaires sont placés dans une plaque à 96 puits contenant les traitements d’intérêt, et les disques sont infiltrés sous vide. Chaque plaque contient quatre répliques d’un témoin négatif (eau avec solvant) et d’un témoin positif (toxine flg22 ou T-2). Après 4 à 6 heures, la conductivité du liquide entourant le disque foliaire est mesurée comme une quantification de la fuite ionique. Après 24 heures, l’activité de la peroxydase est quantifiée à l’aide d’un test colorimétrique utilisant le liquide entourant le disque foliaire, puis le disque foliaire est décoloré et traité pour la quantification de la calose. Abréviation : MSM = métabolite secondaire microbien. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : L’effet du solvant sur la fuite d’ions induite par FLG22 ou sur l’activité de la peroxydase. Quatre échantillons réplicés d’Arabidopsis ont été traités avec 1 μM flg22 combiné à DMSO ou méthanol (0, 0,01, 0,1, 1, 10 %). Les graphiques à barres montrent la conductivité moyenne de l’échantillon après 4 h ou l’activité de la peroxydase (_{DO 600}) à 24 h après un traitement d’une seule expérience (n = 4, DS). L’expérience a été répétée deux fois avec des résultats similaires. La différence significative par rapport au contrôle de l’eau a été déterminée par le test t et indiquée par un astérisque (p < 0,05). Abréviations : DMSO = sulfoxyde de diméthyle ; MeOH = méthanol. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Induction de fuite ionique, d’activité de peroxydase ou dépôt de callose dans les disques foliaires d’Arabidopsis par des molécules d’origine microbienne. Les traitements comprenaient le peptide immunogène non toxique flg22 (1 μM), les lipopeptides cycliques gramilline et surfactine (10 μM), ainsi que la toxine T-2 (10 μM^)2,6. Toutes les données ont été normalisées à l’eau + 0,1 % DMSO témoin. Les graphiques en boîte et moustache montrent la conductivité de l’échantillon après 4 heures, l’activité de peroxydase (OD₆₀₀) après 24 heures, ou le nombre de dépôts de callose après 24 heures d’une seule expérience (n = 4-16 plants). Les boîtes indiquent un « x » pour indiquer la valeur de la moyenne, et les cases indiquent le premier quartile, la médiane et le troisième quartile de traitement. Les observations les plus élevées et les plus basses qui ne sont pas des valeurs aberrantes sont indiquées par les moustaches (>intervalle interquartile de 1,5x, indiquées par des cercles). La différence significative avec le contrôle de l’eau est indiquée par un astérisque et a été déterminée par ANOVA unidirectionnelle avec un test de Tukey (p < 0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Discussion

Les communautés microbiennes colonisatrices de plantes sécrètent divers MSM pour faciliter la formation de biofilms, supprimer les microbes concurrents et influencer l’hôte^{végétal 17}. Alors que certains HSH n’ont aucun impact sur la plante, d’autres induisent une mort cellulaire rapide, suppriment la fonction cellulaire ou induisent une résistance des plantes¹⁷. Certains HSH influencent la résistance des plantes au microbe producteur de MSM, et les génotypes résistants peuvent être sélectionnés en fonction de l’insensibilité aux^{MSM 2,3,18}. D’autres HSH induisent une résistance systémique et offrent une protection contre les pathogènes microbiens, ce qui a été utilisé en agriculture pour développer des produits bioprotecteurs afin de supprimer la^{maladie 8}. Pour développer des stratégies d’amélioration des cultures efficaces et durables, il est essentiel d’identifier les MSM bénéfiques et les gènes des plantes qui permettent une réactivité optimale aux MSM.

La recherche de MSM bénéfiques est compliquée par le fait que ces composés sont produits enzymatiquement, où plusieurs enzymes sont nécessaires pour le produit^{fini 2}. Cela rend difficile la détermination du gène à cibler pour abolir la production de MSM dans le cadre des études génétiques. La biosynthèse enzymatique entraîne de multiples variations structurales du même MSM avec des bioactivités potentiellement différentes¹⁹. Séparer et purifier ces MSM pour trouver les molécules bioactives peut être long voire impossible. Dans certains cas, seules de faibles concentrations de MSH individuels peuvent être purifiées, nécessitant plusieurs cycles de^{purification 2}. Une fois qu’un composé ou un extrait bioactif est obtenu, plusieurs approches peuvent être utilisées pour comprendre comment le microbe pourrait affecter la plante.

Les efforts passés se sont concentrés sur la surveillance de l’impact des MSM sur la reprogrammation transcriptionnelle ou la bioprotection dans les plantes^{modèles 20}. Pour évaluer les réponses des MSM au-delà des plantes modèles, des tests à haut débit qui capturent les réponses à divers HSH et nécessitent un minimum de MSH sont potentiellement utiles. Des travaux récents indiquent que les poussées ROS sont une réponse précoce courante aux HSH, notamment la gramilline, la surfactine, la syringomycine et la syringopéptine ^2,3,7. Un test à base de luminol détecte l’explosion apoplasique de ROS générée par les peroxydases et les oxydases de NADPH et est adapté à des tests à haut débit²¹. Malheureusement, les ROS intracellulaires induits par les HSH, comme la surfactine, ne sont pas détectables avec cette^{méthode 7}. La quantification de l’activité de la peroxydase offre une alternative plus sensible que le test à base de luminol pour détecter l’activation transitoire des enzymes productrices de ROS lors du stress¹¹. Notre observation selon laquelle la surfactine induit l’activité de la peroxydase est conforme à des travaux récents montrant que l’activité de la peroxydase est déclenchée par la surfactine et la beauvericine chez Arabidopsis (Figure 3)². De plus, nous avons montré que flg22 et l’ionophores gramilline induisaient une fuite d’ions, et que tous les composés testés, y compris flg22, la toxine T-2, la surfactine et la gramilline, induisent la callose comme prévu (Figure 3^)2,4,7.

En évaluant plusieurs réponses au sein d’un même échantillon, nous minimisons la variation expérimentale dans l’évaluation séparée de chacun de ces caractères et permettons une corrélation entre les traits pour des études systémiques sur les réponses au stress des plantes. L’évaluation de plusieurs traitements ou génotypes au sein d’une même unité expérimentale permet également un phénotypage au niveau des populations pour la génétique des populations. Par exemple, une approche similaire a été utilisée pour identifier un QTL sous-jacent à la production de ROS induite par FLG22 dans^{l’orge 22}. Ce test peut également être utilisé pour des criblages de génétique chimique afin de détecter des modulateurs des réponses au stress des plantes ou pour identifier des MSM bioprotecteurs potentiels à partir d’extraits microbiens.

Pour s’assurer que la méthode expérimentale fonctionne dans le système d’intérêt, les chercheurs doivent prendre en compte les facteurs et limites suivants :

Qualité du tissu foliaire
Veillez à ce que le tissu foliaire ne soit pas stressé avant la récolte. Les signes de stress des plantes varient selon les espèces mais incluent généralement un flétriment, un jaunissement, des rougeurs, des taches, un enroulement excessif des feuilles ou un roulement. Prélever les tissus foliaires provoque des blessures, donc éviter une macération excessive du tissu réduira l’erreur de fond due à la manipulation.

Espèces végétales
Ce protocole est optimisé pour une utilisation avec des feuilles d’orge et d’Arabidopsis. Les feuilles d’orge nécessitent un temps de coloration plus long pour la callose qu’Arabidopsis, probablement en raison de la cire cuticulaire plus épaisse des graminées, ce qui augmente l’hydrophobie et limite la diffusion des traitements dans la^{feuille 23}. Cela pourrait aussi expliquer en partie l’absence d’induction d’activité de la peroxydase avec notre méthode, bien que nous ayons pu observer une suppression de l’activité de la peroxydase par des composés toxiques similaire à ce que nous avons présenté dans Arabidopsis (Figure 3). Nous avons essayé d’augmenter le nombre de disques foliaires par échantillon à 5, d’ajuster le pH à 5, 6 ou 7, d’augmenter le nombre d’infiltrations sous vide à 10, et de modifier la concentration du substrat ou de changer le substrat en guaiacol²⁴. Bien que nous ayons observé une augmentation de l’activité de la peroxydase avec plus de disques foliaires et des cycles d’infiltration, les différences entre le témoin négatif et le flg22 sont restées faibles (augmentation de 10 % avec flg22) ou non significatives entre les expériences. Nous savons que l’orge répond à FLG22 en induisant la production de ROS, la production de callose et l’expression^{de peroxydase 25,26}. Dans les racines de maïs, les extraits protéiques présentaient une activité de peroxydase induite par le MAMP, ce qui suggère qu’il pourrait être nécessaire d’extraire une protéine pour observer l’induction, plutôt que de détecter l’activité protéique qui s’échappe des disques foliaires, comme c’est fait dans notre test²⁴. Dans notre analyse, la blessure induit clairement une activité de peroxydase dans l’échantillon témoin négatif, car cette activité disparaît lorsque les cellules meurent à cause de l’exposition à la toxine. Il est possible que le traitement FLG22 induise les mêmes peroxydases que la blessure, de sorte qu’il semble qu’aucune induction n’a eu lieu. Alternativement, notre test peut ne pas être suffisamment sensible pour détecter des changements subtils, ou les peroxydases peuvent ne pas bien diffuser en solution.

Pour appliquer ce protocole à d’autres espèces végétales, nous suggérerions d’utiliser la méthode telle que décrite et d’inclure Arabidopsis en parallèle comme témoin afin de garantir que le protocole fonctionne. Si l’activité de la peroxydase semble faible, alors augmenter le nombre de disques foliaires par échantillon, augmenter le nombre d’infiltrations sous vide à 5 ou 10, et essayer différents traitements, incluant d’autres MAMPs, ionophores ou la toxine T-2, pourrait donner un résultat positif.

Traitements témoins négatifs
Cette méthode dépend d’un contrôle négatif efficace et approprié pour les comparaisons. Idéalement, un témoin négatif contiendrait le même solvant de fond que le traitement MSM d’intérêt mais sans MSM. Le solvant de fond serait de l’eau ou aurait le même impact sur les contraintes mesurées que l’eau. C’est une approche pratique dans les cas où le MSM est déjà purifié et peut être dissous dans un solvant de son choix. Lors de la comparaison des extraits microbiens, un témoin négatif peut être le sous-produit d’une purification partielle du MSM, contenant le même milieu de fond mais avec une concentration réduite de MSM après fractionnement. Ou l’expérimentateur pourrait utiliser le milieu de culture utilisé pour générer l’extrait contenant le MSM comme témoin négatif. Dans ces échantillons plus complexes, le témoin négatif pourrait contenir des sels qui gonflent la mesure de conductivité, ou des solvants peuvent supprimer l’activité de la peroxydase (Figure 2). Pour déterminer si les sels influencent les résultats de fuite d’ions, l’expérimentateur pourrait tester la conductivité du témoin négatif et de l’échantillon en l’absence de disque foliaire afin de déterminer si l’échantillon ou la feuille génère des changements de conductivité. Pour déterminer si les solvants influencent les réponses à la peroxydase, l’expérimentateur peut ajouter flg22 au témoin négatif et comparer le résultat à flg22 dissous dans l’eau afin de déterminer s’il y a une différence. Il est possible que des solvants, des composés teintés ou des sels excessifs dans un contrôle négatif obscurcissent les effets du MSM sur les réponses au stress des plantes décrites, et par conséquent, cette approche ne sera pas adaptée dans tous les scénarios.

Temps d’échantillonnage
Il est important d’initier les traitements le matin, car les réponses de défense inductibles suivent un cycle circadien et ont la plus grande amplitude tôt le^{matin 27}. D’après notre expérience, Arabidopsis produit des fuites d’ions en réponse à la gramilline plus rapidement (4 h) que l’orge et le maïs (4-7 h), et ainsi, un parcours temporel peut être nécessaire pour établir les paramètres^{expérimentaux 2,28}. La réactivité cellulaire diminue avec le temps, et nous ne recommanderions pas de tester les réponses au stress au-delà de 30+ heures après le traitement.

Concentration
La concentration de MSM peut avoir un impact non linéaire sur l’induction des réponses au stress des plantes, un phénomène appelé^{hormésis 20}. Selon la disponibilité et la solubilité du MSM, les expérimentateurs devraient idéalement tester les réponses au stress des plantes sur une gamme de concentrations de MSM. Les concentrations typiques varient entre 100 nM et 1 000 μM comme point de^{départ 2, 11, 20}.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acide 5-aminosalalicylique	Millipore Sigma & nbsp ;	A79809
Pompe à vide Barnart	Groupe de technologie artisanale	400-3910
Sonde de microconductivité COND-905	Lazar Research Laboratories Inc.
Peptide FLG22	AnaSpec	AS-62633
Infinite 200PRO F	TeCan Group Ltd.	30190086
Surfactine	Sigma-Aldrich	S3523
Toxine T-2	Cayman Chemical Company Inc	20433