Etablissement et évaluation d’un modèle murin d’artérite coronaire associée à la maladie de Kawasaki induite par un extrait hydrosoluble de Candida albicans

La maladie de Kawasaki (KD), une forme de syndrome des ganglions lymphatiques cutanéo-muqueux, est une maladie auto-immune qui survient chez les enfants de moins de 5 ans et s’accompagne d’une vascularite fébrile ^1,2,3. Des études indiquent que les traitements non traités ou de plus de 10 jours de MK sévère sont susceptibles d’induire de graves complications cardiovasculaires, notamment des anévrismes coronariens et une sténose de l’artère coronaire ^4,5. La rupture d’anévrismes coronaires peut entraîner un choc cardiogénique ou même une mort subite, qui est la principale cause de maladie cardiaque acquise chez les enfants ^6,7. Bien que l’application d’immunoglobulines intraveineuses ait considérablement amélioré le pronostic, son étiologie et sa pathogenèse restent incertaines, ce qui limite le développement de stratégies thérapeutiques ciblées ^8,9. Par conséquent, l’établissement de modèles animaux capables de simuler avec précision les caractéristiques des maladies humaines est devenu un besoin urgent pour la recherche actuelle.

À l’heure actuelle, un obstacle majeur dans la recherche sur la maladie de Kawasaki est l’absence de modèles animaux bien caractérisés qui récapitulent entièrement la pathologie de la maladie humaine. Parmi les différents modèles développés actuellement, le modèle de vascularite induit par l’extrait de paroi cellulaire de Lactobacillus casei (LCWE) est un système relativement mature, et ce modèle peut provoquer une artérite coronaire. Il est largement utilisé pour étudier le mécanisme de la dérégulation immunitaire et des cytokines spécifiques dans les vascularites de type KD^10,11. Le modèle de vascularite induit par l’extrait hydrosoluble de Candida albicans (CAWS) a également attiré beaucoup d’attention en raison de sa grande similitude avec les caractéristiques pathologiques de la maladie de Kawasaki humaine^12,13. Après une optimisation et une amélioration systématiques par plusieurs équipes de recherche, le modèle induit par le CAWS est devenu un outil important pour la recherche sur la maladie de Kawasaki¹⁴. Bien que le CAWS puisse induire une inflammation de l’artère coronaire par injection intrapéritonéale, il a des limites en ce sens qu’il ne peut pas reproduire complètement le processus pathologique exact de la vascularite humaine KD. Par exemple, aucun neutrophile n’a été trouvé dans la pathologie tardive du KD¹⁵ humain, mais une infiltration de neutrophiles s’est tout de même produite dans ce modèle jusqu’à 16 semaines après l’injection de CAWS¹⁶. De plus, le mécanisme de la vascularite causée par le CAWS n’a pas été entièrement clarifié à l’heure actuelle, ce qui limite la compréhension et l’application approfondies du modèle⁹. Cette étude vise à établir un modèle animal standardisé de KD en optimisant le protocole d’induction du CAWS, en élucidant le mécanisme de la maladie et en facilitant le développement de thérapies ciblées.

Cette étude a utilisé le CAWS pour établir un modèle animal plus standardisé de la maladie de Kawasaki. Grâce à des expériences systématiques d’optimisation de la dose, il a été déterminé que l’injection intrapéritonéale de 8 mg par jour pendant cinq jours consécutifs était le régime d’administration optimal. Ce régime peut induire de manière stable des lésions de l’artère coronaire tout en maintenant un taux de survie élevé chez les animaux. De plus, nous avons exploré le rôle du dysfonctionnement mitochondrial dans la formation de la fibrose au cours de la phase chronique de la MK, en mettant l’accent sur le mécanisme possible du canal anionique voltage-dépendant 1 (VDAC1), une protéine clé régulant l’apoptose mitochondriale, pendant la transition de l’inflammation à la fibrose¹⁷. Il convient de noter que, grâce à l’analyse de colocalisation des autophagosomes et des lysosomes dans cette étude, une fonction anormale de l’autophagie a été observée dans ce modèle. Ce modèle optimisé constitue un outil important pour étudier systématiquement la pathogenèse des lésions de l’artère coronaire dans la maladie de Kawasaki et évaluer de nouvelles stratégies de traitement.

Toutes les expériences de recherche impliquant des données animales ont été approuvées par le comité d’éthique de l’hôpital populaire Huai’an n° 1 affilié à l’Université de médecine de Nanjing (KY-2024-250-01). Les réactifs et l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Préparation du CAWS

1. Inoculer Candida albicans dans un bouillon de dextrose Sabouraud selon le protocole établi par Duong et ^al.18. Ensuite, cultivez le bouillon inoculé en anaérobie à 37 °C pendant 48 h dans une chambre anaérobie scellée avec un mélange gazeux.
   REMARQUE : Pour garantir la stérilité du milieu de culture, les conditions de culture anaérobie à 37 °C doivent être strictement contrôlées afin d’éviter toute contamination par diverses bactéries.
2. Rincer à plusieurs reprises avec un milieu limitant le carbone et incuber à 37 °C pendant 48 h à une vitesse de rotation de 4,5 x g.
3. Ajoutez un volume égal d’éthanol anhydre et laissez reposer toute la nuit à 4 °C.
4. Centrifuger à 4,5 x g pendant 15 min à 4 °C, retirer le surnageant, ajouter un volume égal d’éthanol anhydre au précipité et le laisser reposer toute la nuit à 4 °C.
5. Après la centrifugation, jeter le surnageant, ajouter 50 mL d’acétone dans le précipité, centrifuger et sécher le précipité. Dissoudre le précipité dans une solution saline normale stérile pour une utilisation ultérieure.

2. Construction d’un modèle murin de la maladie de Kawasaki

1. Sélectionnez quatre-vingts souris mâles C57BL/6 âgées de 4 à 6 semaines et hébergez-les dans des conditions contrôlées avec un accès libre à la nourriture et à l’eau.
   REMARQUE : Afin de minimiser l’interférence potentielle des fluctuations du taux d’œstrogène sur les réponses immunitaires et inflammatoires, seules des souris mâles ont été utilisées dans cette étude préliminaire d’établissement et de caractérisation^{du modèle 19}.
2. Répartissez les souris en 4 groupes uniformément par la méthode de la table de nombres aléatoires, y compris 3 groupes d’injection de CAWS à doses différentes (4 mg, 8 mg, 12 mg) et 1 groupe témoin de solution saline normale, avec 20 souris dans chaque groupe.
3. Préparer la poudre de CAWS en trois concentrations de 40 mg/mL, 80 mg/mL et 120 mg/mL à l’aide d’une solution saline normale stérile (0,9 % de NaCl). Injectez dans le groupe expérimental 0,1 mL de CAWS le matin du 1er au 5e jour de l’expérience, et administrez un volume égal de solution saline normale au groupe témoin selon le même calendrier.
   REMARQUE : L’injection intrapéritonéale a été effectuée à l’aide d’une seringue à insuline de 1 ml. Lors de l’utilisation, positionnez la souris avec la tête plus basse et la queue plus haute pour éviter d’endommager des organes tels que le gros et l’intestin grêle lorsque la seringue est insérée.
4. À l’aide d’une balance électronique à 9 h tous les jours, pesez simultanément la nourriture restante dans la mangeoire et calculez la consommation de nourriture sur 24 heures pour chaque cage de souris.
5. Les 3e, 7e, 14e et 28e jours après la dernière injection, choisissez et sacrifiez au hasard 3 souris de chaque groupe à chaque point temporel.
6. Placez les souris dans une chambre fermée préremplie d’air ambiant. Introduire du CO₂ comprimé à un débit de 30 % du volume de la chambre par minute. Après 5 minutes, une luxation cervicale a été pratiquée pour confirmer le décès.
7. Prélever et peser des échantillons cardiaques. Observer les lésions inflammatoires du cœur et des vaisseaux sanguins par coloration HE.

3. Normes de coloration et de classement HE

1. Le cœur et l’arc aortique (environ 3 mm × 3 mm) ont été rapidement isolés. Effectuer une sternotomie médiane selon la méthode décrite²⁰. Séparez rapidement le cœur de l’arc aortique (environ 3 mm × 3 mm). Les tissus collectés ont été fixés dans du formol tamponné neutre à 10 % pendant 24 h.
2. Après la fixation, déshydratez les tissus à l’aide d’une série d’éthanol gradué (70 % d’éthanol pendant 1 h, 80 % d’éthanol pendant 1 h, 95 % d’éthanol pendant 1 h et 100 % d’éthanol pendant 1 h), transparent dans du xylène et incorporé dans de la paraffine. Enfin, coupez les blocs en tranches continues de 5 μm.
3. Pour la coloration H&E, colorez les sections avec de l’hématoxyline pendant 5 min, rincez à l’eau courante pendant 10 min, contre-colorez avec de l’éosine pendant 2 min, puis procédez à la déshydratation et au montage²¹.
   REMARQUE : Selon le degré de lésion intimale vasculaire, il est classé en trois grades : Le grade I est principalement caractérisé par un gonflement endothélial et une agrégation de neutrophiles ; Le grade II se manifeste par une dégénérescence des muscles lisses, une infiltration de cellules inflammatoires et des lésions des organites ; Le grade III se caractérise par des lésions sévères telles qu’une nécrose et une excrétion endothéliales, ainsi qu’un dépôt de fibrine.

4. Coloration trichrome Masson

1. Après la fixation, déshydratez les échantillons de tissus à travers une série d’éthanol gradué, clair dans du xylène et incorporé dans de la paraffine.
2. Après le déparaffinage, hydratez les sections à travers une série d’éthanol gradué à de l’eau distillée en préparation de la coloration.
3. Teindre les noyaux avec de l’hématoxyline de fer de Weigert pendant 5 min, rincer abondamment à l’eau courante, puis colorer le cytoplasme avec de l’acide Lichun Red fuchsin pendant 5 min.
4. Différencier avec de l’acide phosphomolybdique à 1 % pendant 1 min, puis colorer directement les fibres de collagène avec du bleu d’aniline pendant 3 min. Rincer rapidement avec de l’acide acétique glacial à 1 %.
   REMARQUE : Contrôlez strictement le moment de l’étape de différenciation pour assurer la spécificité de la coloration.
5. Après déshydratation avec de l’éthanol et du xylène, devenant transparent, scellez le film neutre.
6. Rincez les sections tachées à l’eau courante pour éliminer l’excès de colorant.
7. Déshydratez les sections à travers une série d’éthanol gradué, transparent dans du xylène, et montez avec de la gomme neutre.
8. Observez les coupes au microscope optique à un grossissement constant. Les fibres de collagène doivent apparaître bleues, les fibres musculaires et le cytoplasme rouges, et les noyaux bleu foncé.

5. Coloration par immunofluorescence

1. Fixez des sections de cellules ou de tissus et bloquez avec 5 % de BSA pendant 1 h pour réduire la liaison non spécifique.
2. Utilisez du sérum normal de la même espèce que l’anticorps secondaire, diluez-le avec du PBS dans un rapport de 1:10 et déposez-le sur l’échantillon. Fermez-le à température ambiante pendant 30 min. Après le scellement, rincez doucement deux fois avec du PBS.
3. Incuber les sections avec l’anticorps primaire pendant la nuit à 4 °C. Après le lavage avec du PBS, ajoutez l’anticorps secondaire fluorescent et incubez dans l’obscurité pendant 1 h.
4. Coloration du noyau avec du DAPI, scellement avec un agent d’enrobage anti-trempe et observation sous microscopie confocale.

6. Immunohistochimie

1. Après le déparaffinage et l’hydratation des sections de paraffine, effectuer la réparation de l’antigène et bloquer la peroxydase endogène.
2. Incubation d’anticorps et développement de la couleur : Tout d’abord, bloquez avec du sérum normal, puis incubez l’anticorps primaire et l’anticorps secondaire marqué HRP en séquence, et enfin, développement de la couleur DAB. Contrôlez le degré de réaction au microscope.
3. Recolorez les noyaux cellulaires avec de l’hématoxyline. Après déshydratation et transparence, scellez les plaques et observez le signal positif jaune brunâtre au microscope.
   REMARQUE : L’expérience doit mettre en place des contrôles et contrôler strictement les conditions de restauration et de développement des couleurs.

7. Détection d’autolysosome

1. Co-cultiver les macrophages RAW264.7 avec des spores de Candida albicans dans une proportion appropriée (10:1), et incuber à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 4 h, 8 h, 12 h, 16 h, 20 h, 24 h, 28 h, 32 h, 36 h, 40 h, 44 h et 48 h pour établir un modèle phagocytaire.
2. Lavez trois fois avec du PBS pré-refroidi pour éliminer les spores non phagocytaires.
3. Tout d’abord, bloquez les échantillons avec 5 % de BSA pendant 30 min. Ensuite, incuber successivement avec l’anticorps primaire contre LC3 (dilution 1:200) à température ambiante pendant 1 h, puis avec l’anticorps secondaire marqué à l’Alexa Fluor 488 à température ambiante pendant 30 min.
4. Ajoutez la sonde de lysosome Lyso-Tracker Red directement dans les cellules pour visualiser la localisation lysosomale. Enfin, colorez les noyaux avec du DAPI (1 μg/mL) pendant 5 min.
   REMARQUE : L’ensemble du processus d’opération doit être effectué dans l’obscurité pour s’assurer que le temps d’incubation et la concentration de l’anticorps sont contrôlés avec précision.

Dans un premier temps, nous avons systématiquement évalué les modifications pathologiques myocardiques induites par différentes doses de CAWS chez la souris. Aucun décès n’a été observé dans le groupe témoin PBS, le groupe CAWS 4 mg et le groupe CAWS 8 mg (n = 20 dans chaque groupe). En revanche, la réponse inflammatoire dans le groupe 4 mg était légère et ne répondait pas aux exigences de modélisation. Le taux de mortalité était plus élevé dans le groupe 12 mg CAWS (9/20, 45 %), et les décès sont survenus entre le 3e et le 10e jour après l’injection. Ces résultats suggèrent qu’une dose de 12 mg peut causer des dommages inflammatoires locaux excessifs et une toxicité systémique. Par conséquent, cette dose a été exclue des études subséquentes. La dose de 8 mg a finalement été choisie comme schéma posologique optimal, car elle pouvait induire efficacement une artérite coronarienne importante tout en maintenant un taux de survie acceptable et des effets indésirables locaux minimes. (Figure 1A). Finalement, il a été déterminé que l’injection intrapéritonéale de 8 mg de CAWS était la dose de modélisation optimale. Les résultats de coloration HE du groupe expérimental ont montré un processus dynamique typique d’inflammation et de fibrose. Le troisième jour, une infiltration inflammatoire focale, principalement composée de neutrophiles et de monocytes périvasculaires, s’est produite. Au septième jour, la gamme inflammatoire s’est étendue à l’interstitium myocardique, accompagnée d’un gonflement important des cellules myocardiques et d’un œdème interstitiel. Le 14e jour, l’inflammation a atteint son apogée, et un trouble de l’arrangement des fibres myocardiques et une nécrose focale sont apparus. Le 28e jour, bien que l’inflammation ait été atténuée, une fibrose précoce s’était formée (Figure 1B et Figure 2A). En revanche, la structure myocardique est restée normale à tous les points temporels dans le groupe témoin. Tous les résultats ont été confirmés par une évaluation en double aveugle, qui a permis de vérifier qu’une dose de 8 mg de CAWS pouvait induire de manière stable un modèle de lésion myocardique compatible avec les caractéristiques de la maladie de Kawasaki.

Par la suite, la méthode de coloration Masson tricolor a été utilisée pour déterminer si une vascularite semblable à la maladie de Kawasaki induite par le CAWS entraînerait une fibrose persistante autour des artères coronaires (AC). Les résultats expérimentaux ont montré que dans le groupe d’injection CAWS de souris, des dépôts évidents de fibres de collagène ont été détectés autour des parois des artères coronaires et de l’aorte enflammées, et que ces zones fibrotiques coïncidaient fortement avec les lieux de distribution de l’infiltration des cellules inflammatoires. En revanche, les souris du groupe témoin PBS n’ont montré qu’une faible coloration du collagène, qui était confinée dans la plage structurelle normale de la paroi vasculaire (Figure 2A). L’analyse quantitative a montré qu’un dépôt significatif de fibres de collagène s’est produit à 14 jours et que le degré de fibrose était statistiquement différent de celui du groupe témoin (figure 2C).

Étant donné que le changement pathologique central de la maladie de Kawasaki est la réponse immuno-inflammatoire de la paroi vasculaire, qui implique l’action coordonnée de plusieurs cellules immunitaires22,23, nous avons ensuite exploré les changements caractéristiques du microenvironnement immunitaire dans le modèle CAWS par coloration par immunofluorescence (IF). Le 14e jour après l’injection de CAWS, une coloration IF des marqueurs des cellules immunitaires a été effectuée sur les tissus cardiaques de souris ayant reçu une injection de CAWS. Les résultats expérimentaux ont montré qu’au 14e jour de modélisation chez les souris du groupe de traitement CAWS, l’infiltration des lymphocytes T CD3+, des lymphocytes T cytotoxiques CD8+, des macrophages de type CD86+ M1, des macrophages F4/80+ et des cellules tueuses naturelles NK1.1+ dans les artères coronaires et les tissus myocardiques était significativement augmentée par rapport au groupe témoin PBS (Figure 2B,D). En analysant systématiquement les changements d’expression de ces marqueurs immunitaires, il a non seulement vérifié que le modèle CAWS pouvait simuler avec précision les caractéristiques immunologiques de la maladie de Kawasaki humaine, mais plus important encore, il a révélé le mécanisme possible de différents sous-ensembles de cellules immunitaires dans l’apparition et le développement de la maladie, fournissant une base théorique pour le développement ultérieur de stratégies d’intervention immunitaire ciblées.

La recherche a établi que le dysfonctionnement mitochondrial est un mécanisme clé sous-jacent à la fibrose myocardique 24,25,26. Il est reconnu qu’en cas de stress inflammatoire, le canal anionique voltage-dépendant 1 (VDAC1), une protéine critique pour le contrôle de la qualité mitochondriale, peut déclencher une ouverture anormale des pores de transition de perméabilité mitochondriale (mPTP) lorsque son expression est régulée à la hausse. Ceci, à son tour, induit l’apoptose et active les fibroblastes17,27. Pour explorer ce mécanisme, nous avons évalué l’expression de VDAC1 dans la phase chronique à l’aide de l’immunohistochimie. Nos résultats ont révélé que, par rapport au groupe témoin PBS, l’expression de la protéine VDAC1 dans le tissu myocardique des souris du groupe traité par CAWS était significativement élevée 28 jours après la modélisation (Figure 3). Les signaux positifs étaient principalement localisés dans les zones fibrotiques et autour des vaisseaux sanguins, indiquant que le dysfonctionnement mitochondrial médié par VDAC1 peut contribuer à la fibrose myocardique dans le modèle de la maladie de Kawasaki. Ces données fournissent des preuves expérimentales concernant les mécanismes moléculaires des lésions myocardiques induites par le CAWS.

Des études antérieures ont montré que le dysfonctionnement mitochondrial médié par VDAC1 est impliqué dans le processus de fibrose myocardique de la maladie de Kawasaki, mais son mécanisme spécifique n’a pas encore été clarifié. Étant donné que le maintien de l’homéostasie mitochondriale dépend du fonctionnement normal du système autophagie-lysosomale. Nous supposons que VDAC1 peut exacerber la fibrose en influençant la formation ou la fonction des autophagolysosomes, conduisant à une accumulation mitochondriale anormale. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons d’abord établi un modèle d’infection par spores de Candida albicans dans les macrophages (RAW264.7) (Figure 4) et détecté les changements dynamiques du flux autophagique et de l’activité lysosomale dans le modèle. Les résultats expérimentaux montrent que la formation de lysosomes d’autophagie augmente au stade précoce (dans les 2 à 3 heures suivant l’infection cellulaire), tandis que le flux autophagique est bloqué au stade ultérieur (3 à 4 heures après l’infection cellulaire). Le changement de flux d’autophagie peut être évalué par le changement de coloration de fusion après la co-localisation de l’autophagosome et du lysosome. Ce résultat confirme que le dysfonctionnement des autophagolysosomes peut effectivement entraîner une altération de la clairance cellulaire.

Figure 1 : Analyse histopathologique du cœur et des artères coronaires. (A) Courbes de survie de souris ayant reçu une injection de PBS ou différentes doses de CAWS (4 mg, 8 mg et 12 mg ; n = 20 par groupe). (B) Les résultats de coloration de l’EH du cœur dans le groupe de traitement CAWS (8 mg) à différents moments (3 j, 7 j, 14 j, 28 j) ont été présentés. Barres d’échelle : 1500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Analyse de la fibrose du collagène et de l’infiltration des cellules immunitaires. (A) Les résultats de coloration Masson du groupe CAWS 8 mg et du groupe témoin. Les fibres de collagène présentent une couleur bleue caractéristique, les fibres musculaires et le cytoplasme sont rouges et le noyau cellulaire est bleu foncé. Les flèches indiquent la présence de spores fongiques. Barres d’échelle : 1500 μm. (B) Résultats de coloration par immunofluorescence du groupe CAWS 8 mg et du groupe témoin (lymphocytes T CD3+ marqués CD3, lymphocytes T cytotoxiques CD8+ marqués CD86, macrophages de type M1 CD86+ marqués, macrophages F4/80+ marqués F4/80+ et cellules tueuses naturelles NK1.1+ marquées NK1.1). Barres d’échelle : 200 μm. (C) Évaluer le degré de fibrose cardiaque. Le degré de fibrose cardiaque a été évalué sur la base du pourcentage de zone de coloration trichromatique dans le tissu cardiaque du champ visuel à un grossissement de 800x. La méthode spécifique est la suivante : Parce que les fibres de collagène sont teintes en vert vif avec des colorants anioniques macromoléculaires, 100 champs visuels à un grossissement de 800 fois (toutes les tranches d’une épaisseur de 5 μm) ont été observés, et le degré de fibrose cardiaque a été déterminé par le pourcentage de surface verte dans la surface totale. Plus le pourcentage est élevé, plus la fibrose est grave. (D) Le pourcentage de cellules immunitaires a été analysé statistiquement en fonction des résultats de la coloration par immunofluorescence, ***p < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Analyse immunohistochimique de l’expression de VDAC1 dans le groupe PBS et le groupe CAWS au jour 28. (A) Analyse immunohistochimique de l’expression de VDAC1. Barre d’échelle : 800 μm. Les particules noires brunes sont des résultats positifs. (B) Analyse statistique du pourcentage de cellules immunohistochimiquement positives VDAC1, p < 0,001. (C) Analyse statistique du score H de l’immunohistochimie VDAC1. Les données ont été dérivées de plusieurs réplicats biologiques (n = 20 souris par groupe), et les résultats ont été exprimés en moyenne ± écart-type et analysés statistiquement (***p < 0,001). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Détection de l’autolysosome après la phagocytose de Candida albicans par des cellules de souris RAW264.7. (A) Les flèches indiquent la présence de spores fongiques. Barres d’échelle : 25 μm. Le changement de flux d’autophagie peut être évalué par le changement de coloration de fusion après la co-localisation de l’autophagosome et du lysosome. (B) Une analyse temporelle du taux de formation des autolysosomes quantifie les paramètres pertinents. Les résultats ont été exprimés en moyenne ± écart-type et analysés statistiquement (***p < 0,001). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.