Mesurer le vieillissement monocellulaire avec un biomarqueur de chromatine et de vieillissement épigénétique basé sur l’imagerie

Résumé

Le protocole présente le flux de travail d’imagerie et de calcul pour extraire et valider la chromatine et l’âge épigénétique (ImAge) basés sur l’imagerie.

Résumé

Pour faire progresser des soins de santé personnalisés et évaluer les stratégies de rajeunissement potentielles, les biomarqueurs reflétant l’âge biologique sont essentiels. Nous avons introduit la chromatine et l’âge épigénétique (ImAge) basés sur l’imagerie, un biomarqueur basé sur l’imagerie dérivé de l’organisation spatiale de la chromatine et des marques épigénétiques au sein d’un seul noyau, capturant les changements intrinsèques liés à l’âge. ImAge capture et quantifie efficacement les effets des interventions modulant l’âge biologique, montrant une sensibilité par des diminutions significatives après des stratégies de rajeunissement (telles que la restriction calorique et la reprogrammation partielle via l’expression transitoire d’Oct4, Sox2, Klf4 et Myc (OSKM)) et des augmentations après des traitements comme la chimiothérapie. De plus, une ImAge plus faible est corrélée à une activité locomotrice plus élevée, suggérant qu’elle capture des améliorations fonctionnelles parallèlement à l’inversion biologique de l’âge, offrant un outil prometteur pour une seule cellule pour évaluer les interventions de longévité. Comme ImAge est une méthode intégrative nécessitant une imagerie de bonne qualité et une analyse computationnelle méticuleuse, nous visons à fournir des conseils approfondis pour l’extraire et la valider. Ce protocole complet détaillera le flux de travail pour les procédures de laboratoire humide (préparation et imagerie de l’échantillon) et l’utilisation appropriée de notre pipeline informatique open source (configuration de l’environnement et traitement des données d’imagerie) pour extraire et valider ImAge.

Introduction

L’espérance de vie moyenne croissante et le vieillissement de la population mondiale soulignent le besoin crucial de biomarqueurs efficaces d’âge fonctionnel^{ou biologique 1,2,3}. Ces biomarqueurs sont essentiels pour prédire avec précision le risque de maladie et la durée de vie, ce qui peut considérablement améliorer les soins gériatriques et réduire les coûts associés. Bien que les horloges de méthylation de l’ADN (ADN) aient fait des avancées notables dans la quantification du vieillissement biologique ^4,5,6, elles reposent souvent sur une régression linéaire et nécessitent de larges cohortes, pouvant négliger des composants biologiques nuancés et dépendants du contexte spécifiques aux^{individus 7,8}. De plus, ces techniques basées sur le séquençage nécessitent la lyse cellulaire, la préparation complexe des échantillons et des réactifs coûteux pour chaque cellule, ce qui les rend plus coûteuses et plus complexes pour les études à grande échelle, à grande échelle ou à grande échelle où la destruction de l’échantillon est un inconvénient⁹.

Pour surmonter ces limites, nous avons développé la chromatine et l’âge épigénétique (ImAge) basés sur l’imagerie, une technique novatrice conçue pour quantifier le vieillissement et le rajeunissement à résolution monocellulaire. Cette technique a été appliquée et validée dans le sang périphérique de la souris et dans divers organes solides, comme décrit par Alvarez-Kuglen et ^al.1. Cette publication décrit en détail les protocoles optimisés afin qu’ils puissent être adaptés et adoptés par d’autres chercheurs pour diverses applications.

Cette approche diffère fondamentalement des horloges ADN traditionnelles en capturant des trajectoires intrinsèques liées à l’âge en se basant sur l’organisation spatiale de la chromatine et des marques épigénétiques au sein d’un seul^{noyau 1}. Les méthodes basées sur l’imagerie offrent des avantages distincts : elles sont intrinsèquement non destructrices, ce qui signifie que les cellules ne sont pas détruites lors du traitement, contrairement aux méthodes basées sur le séquençage. Cette nature non destructive permet crucialement de préserver la structure spatiale de la chromatine et des marques épigénétiques au niveau de la cellule unique, en maintenant le contexte spatial des cellules au sein des tissus — une perspective souvent perdue dans les flux de travail de séquençage conventionnels. De plus, les techniques d’imagerie sont généralement plus économiques pour les études à grande échelle ou longitudinales, car elles ne nécessitent pas de réactifs coûteux ni de préparation complexe de bibliothèque par cellule, ce qui les rend adaptées à des observations répétées dans le^{temps 10,11}.

Un avantage clé d’ImAge est sa capacité à révéler les trajectoires liées à l’âge comme caractéristiques principales intrinsèques des données elles-mêmes, sans nécessiter de régression sur l’âge chronologique. ImAge a démontré une forte corrélation avec l’âge chronologique dans les cellules mononucléaires du sang périphérique de la souris et divers organes^{solides 1}. De manière cruciale, ImAge capture efficacement les perturbations attendues de l’âge biologique, montrant une augmentation après un traitement de chimiothérapie et une diminution avec restriction calorique et reprogrammation partielle par expression transitoire d’OSKM dans le foie et le muscle squelettique. De plus, les relevés ImAge ont été observés comme étant inversement corrélés à l’activité locomotrice chez des souris chronologiquement identiques, indiquant leur utilité pour mesurer des aspects de l’âge biologique et fonctionnel.

La mise en œuvre de la méthodologie ImAge nécessite une expertise à la fois dans les procédures expérimentales en laboratoire^{humide 12} et les analyses^{computationnelles 1} (Figure 1) ; Par conséquent, cet article propose des protocoles complets, étape par étape, pour les deux aspects. Ce protocole optimisé vise à faciliter l’adoption généralisée d’ImAge, permettant aux chercheurs d’étudier les changements liés à l’âge dans la chromatine et l’organisation épigénétique à résolution unicellulaire à travers divers types cellulaires et tissus. Dans ce protocole, H3K27ac et H3K27me3, deux marqueurs fournissant un contraste et une résolution suffisants pour déterminer l’ImAge, ont été sélectionnés comme marques représentatives. Les chercheurs peuvent reproduire ce protocole pour quantifier le vieillissement biologique, évaluer l’impact des interventions de longévité et explorer l’hétérogénéité inhérente aux processus de vieillissement et de rajeunissement au niveau de l’organisme individuel.

Protocole

Toutes les expériences animales sont menées selon des directives et protocoles approuvés par le Comité Institutionnel de Soins et d’Utilisation des Animaux (IACUC) de l’Institut de Recherche Scripps (Protocole 09-0004-6). Les données présentées dans ce manuscrit ont été obtenues à partir de souris mâles i4F, âgés de 2 à 14 mois. Des organes d’intérêt (foie et muscle squelettique) ont été prélevés sur des souris i4F de 13,8 mois et des souris témoins de portée traitées pendant 1 semaine avec une faible dose de doxycycline (0,2 mg/ml⁾¹⁴. Les noyaux ont été isolés à partir d’échantillons de jeunes (3,2 mois), âgés (13,8 mois) et âgés traités avec de la doxycycline afin de surexprimer des facteurs OSKM (aged-OSKM).

1. Imagerie des échantillons

1. Préparation de l’échantillon
   1. Collecter des organes d’intérêt (foie et muscle squelettique) sur des souris fraîchement disséquées (ou autres espèces d’intérêt) et les congeler instantanément par de l’azote liquide. Conservez les échantillons à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être utilisés.
   2. Transférez les organes et tissus dans un mortier pré-refroidi et posez sur de la glace sèche. Versez de l’azote liquide sur le tissu gelé et broyez à l’aide d’un pilon pré-refroidi. Pulvériser l’échantillon à l’aide du mortier et pilon pré-refroidis jusqu’à obtenir une poudre uniformément fine.
   3. Aliquot broie le tissu à l’aide d’une spatule métallique pré-refroidie dans plusieurs tubes et stocke des échantillons inutilisés à -80 °C.
      REMARQUE : Les échantillons de tissu broyé dans les tubes peuvent être stockés à -80 °C ou procéder à l’isolement des noyaux.
   4. Extraire les noyaux d’aliquotes congelées, à l’aide d’un kit tampon de lyse des nuclés disponible dans le commerce conformément aux instructions du fabricant.
   5. Comptez les noyaux avec le bleu de Trypan. Mélangez les noyaux et le bleu de Trypan en un ratio égal dans un tube séparé. Transférez 10 μl de la solution de noyaus-Trypan Blue à un hémocytomètre ou à un compteur cellulaire automatisé.
   6. Diluer des échantillons dans PBS + 0,5 % de BSA de sorte que 10 000 noyaux puissent être placés dans un volume de 20 à 30 μL/puits.
2. Préparation du dressage
   1. Saisissez toutes les métadonnées pertinentes pour la préparation du placage et l’analyse computationnelle dans la carte de plaques (fournie dans le fichier supplémentaire 1). Enregistrez les identifiants d’échantillon (par exemple, numéros ou caractères) dans la même disposition que la plaque de puits réelle dans l’onglet sampleID. Enregistrer les conditions expérimentales, y compris l’âge de l’échantillon, dans la même disposition que la plaque réelle du puits dans l’onglet état.
      REMARQUE : Les informations fournies dans l’onglet état seront utilisées pour identifier le groupe d’âge de chaque échantillon (c’est-à-dire jeune ou vieux). Ces groupes d’âge identifiés serviront ensuite de références pour construire le modèle de prédiction du vieillissement (ImAge). Par conséquent, l’onglet condition doit contenir des données pouvant être associées à l’âge, ainsi que d’autres conditions expérimentales pertinentes si nécessaire.
   2. Enregistrez les biomarqueurs cibles (par exemple, H3K27me3) dans la même disposition que la plaque de puits réelle dans l’onglet # (# est remplacé par un nombre). Vérifiez que toutes les combinaisons de métadonnées correspondent et sont correctement reflétées dans un format de tableau consécutif dans l’onglet platemap.
      REMARQUE : Chaque colonne du tableau doit correspondre à un nom d’onglet désigné (par exemple, « sampleID »). Un onglet supplémentaire intitulé « métadonnées » est fourni pour documenter les objectifs du projet et colorer les détails ; Ces informations ne seront pas utilisées dans l’analyse des données. Utilisez cet onglet selon le besoin de la juger.
   3. Exportez la carte de l’onglet au format de fichier csv avec le nom court et descriptif du projet (par exemple, project.csv).
      REMARQUE : L’onglet métadonnées fournit un modèle pour résumer les objectifs du projet et les informations sur l’immunocoloration. L’utilisation de l’onglet métadonnées dans le modèle Platemap est optionnelle pour le processus de placage lui-même. Cependant, d’autres onglets, y compris sampleID, channel# (# est remplacé par un chiffre), sont nécessaires pour l’analyse computationnelle.
3. Placez 10 000 noyaux/puits dans un volume de 20 à 30 μL dans une plaque de puits (par exemple, plaques à 384 puits). Plaque de rotation à 1 000 x g (accélération neuf, décélération 4) pendant 10 minutes à 4 °C.
4. Fixez avec un volume 1:1 de paraformaldéhyde (PFA) à 8 % dans du PBS pendant 10 minutes à température ambiante.
   ATTENTION : Effectuez les étapes de la PFA dans une hotte à fumée et jetez les déchets conformément aux procédures de sécurité institutionnelles.
5. Retirez la solution. Ajoutez 30 μL de 0,1 M glycine dans du PBS pendant 5 minutes à température ambiante. Retirez la solution. Lavez avec 100 μL de PBS 2x et ajoutez 30 μL de PBS pour le stockage.
   REMARQUE : Les cellules peuvent être stockées à 4 °C ou procéder immédiatement à l’immunomarquage.
6. Immunomarquage
   1. Supprimez PBS. Ajoutez 30 μL de solution bloqueante (2 % de BSA et 0,5 % de Triton X-100 dans PBS) et incubez pendant 1 heure à température ambiante. Retirez la solution de blocage.
   2. Ajouter 25 μL d’anticorps primaires : anti-H3K27ac de souris (1:250) et anti-H3K27me3 de Rabbit (1:250) dilués dans un tampon de blocage (0,4 - 2 μg/mL). Couver toute la nuit à 4 °C.
   3. Retirez la solution primaire d’anticorps. Lavez avec 100 μL de PBS 3 fois pendant 3 minutes à température ambiante.
   4. Ajoutez 25 μL d’anticorps secondaires : Alexa 488 Donkey Anti-Mouse (1:250) et Alexa 555 Donkey Anti-Rabbit (1:250) dilués dans un tampon de blocage (1 - 10 μg/mL). Incubez pendant 2 heures à 4 °C ou 1 h à température ambiante.
   5. Lavez avec 100 μL de PBS 3 fois pendant 3 minutes à température ambiante. Colorez avec DAPI/Hoechst à 30 μL de concentration de 0,01 mg/mL. Laver avec 100 μL de PBS.
      REMARQUE : Conserver l’assiette à 4 °C dans du papier aluminium ou procéder immédiatement à l’imagerie. DAPI/Hoechst est nécessaire pour l’étape de segmentation des noyaux.
7. Imagerie
   1. Cellules d’image sur un imageur à haute teneur pour une résolution maximale (pour cet ensemble de données, 20x a été utilisé, mais 63x est recommandé).
      REMARQUE : Bien que l’imagerie puisse être réalisée avec n’importe quel imageur à haut contenu, ce protocole suppose une structure de dossiers plate d’images acquises et un format d’image générique (par exemple, .tiff) comme sortie d’image acquise (Figure 2).
   2. Collectez plusieurs champs par puits et plusieurs piles z, idéalement couvrant de haut en bas les noyaux cellulaires. Une couverture de 10 μm avec l’axe z (par exemple, 20 tranches z à un pas z de 0,5 μm) couvre généralement la plupart des noyaux cellulaires de souris. La taille et la couverture requise dépendent de l’espèce et des types cellulaires d’intérêt. L’imagerie représentative est présentée à la Figure 3.
   3. Transférez les données d’imagerie vers l’ordinateur où l’analyse computationnelle sera effectuée, en suivant la structure de dossiers présentée à la Figure 2.
   4. Ajoutez le préfixe annoté entre crochets carrés du nom du projet défini à l’étape 1.2.2 ci-dessus au dossier image data (par exemple, [project]original_folder_name)

2. Analyse computationnelle des données d’imagerie

1. Préparation des besoins logiciels système (requise uniquement pour la configuration initiale)
   1. Installez Windows Subsystem for Linux (WSL) si vous utilisez sur une machine Windows en suivant les instructions à https://learn.microsoft.com/en-us/windows/wsl/install. Installez Anaconda ou Miniconda en suivant les instructions sur https://www.anaconda.com/docs/getting-started/anaconda/main
2. Préparation de l’environnement de calcul (requise uniquement pour la configuration initiale)
   1. Téléchargez les scripts de workflow depuis le dépôt github https://github.com/terskikh-lab/ImAge_workflow. Décompressez le fichier téléchargé.
      REMARQUE : L’emplacement de stockage des données peut être désigné arbitrairement ; cependant, il est recommandé de sélectionner un répertoire distinct de l’emplacement de stockage des fichiers système (par exemple, le lecteur C sous Windows).
   2. Organisez le dépôt ImAge cloné pour correspondre à la structure de dossiers supposée afin d’exécuter correctement les scripts (Figure 2).
   3. Ouvre l’application terminale si tu fonctionnes sous Linux ou macOS. Ouvre l’application WSL si tu fonctionnes sous Windows.
   4. Changez de dossier vers le fichier de dépôt cloné. Désormais, le terme Commande : désigne une instruction visant à copier et coller le code suivant dans l’application terminale, suivie d’une pression sur la touche Entrée .
      Commande : cd /PATH_TO_CLONED_REPOSITORY/ImAge-main
      REMARQUE : Remplacez « /PATH_TO_CLONED_REPOSITORY » par le paramètre spécifique à l’utilisateur. Par exemple, lorsque le dépôt est dézippé dans le dossier « analysis » du lecteur D et accessible depuis WSL, cela sera alors « /mnt/d/analysis ».
   5. Créer un nouvel environnement informatique avec Python version 3.10 en utilisant conda (application en ligne de commande installée avec Anaconda/miniconda).
      Commande : conda create -n ImAge_workflow python=3.10
   6. Activez l’environnement nouvellement créé.
      Commande : conda activer ImAge_workflow
   7. Installez Poetry (un gestionnaire de paquets Python) en utilisant l’installateur pip (installateur de paquets Python lors de la création de l’environnement ImAge_workflow).
      Commande : installation de pip poésie
   8. Installez les paquets Python prérequis avec Poetry.
      Commande : installation de poésie
      ATTENTION : Assurez-vous que le dossier actuel est le dossier ImAge_workflow, ce qui peut être vérifié en exécutant la commande : pwd.
   9. Configurez CUDA dans l’environnement Conda pour permettre la fonctionnalité d’unité de traitement graphique (GPU) à l’étape de segmentation pour un calcul plus rapide (applicable uniquement pour Linux ou PC Windows avec GPU Nvidia).
      Commande : mkdir -p $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d
      echo 'NVIDIA_PACKAGE_DIR=$(dirname $(python -c "import nvidia ; print(nvidia.__file__)"))' >> $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d/env_vars.sh
      echo 'for dir in $NVIDIA_PACKAGE_DIR/* ; faire si [ -d « $dir/lib » ] ; puis exporte LD_LIBRARY_PATH="$dir/lib :$LD_LIBRARY_PATH » ; fi terminé' >> $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d/env_vars.sh
      REMARQUE : Les scripts détectent automatiquement la disponibilité GPU sur le serveur. Si aucun GPU n’est disponible, il fonctionne par défaut sur le CPU.
3. Effectuez les calculs comme décrit ci-dessous.
   REMARQUE : L’analyse computationnelle se compose de quatre étapes : segmentation des noyaux, extraction des caractéristiques d’image, construction de l’axe du vieillissement (ImAge) et prédiction de l’ImAge. Chaque processus est réalisé à l’aide de scripts Python ; o1_illumination_correction, o2_segmentation, o3_extract_features et o4_ImAge_validation. Toutes ces étapes sont incluses dans un seul script Python, main.py. Les relevés ImAge extraits peuvent être visualisés à l’aide d’un graphique de boîte et de violon tel que présenté dans Figure 4. L’affichage ImAge peut également être extrait dans un format de tableau simple (format standard .csv fichier), avec des échantillons représentés sous forme de lignes et les affichages et métadonnées correspondants sous forme de colonnes. Les utilisateurs ont la flexibilité d’effectuer des analyses numériques supplémentaires sur les relevés ImAge selon les besoins. Ces graphiques et le fichier CSV peuvent être obtenus en utilisant un seul script Python, visualization.py. Le processus de prédiction ImAge utilise des signaux bootstrapés obtenus à partir de cellules individuelles au sein du même tissu. Ces signaux bootstrapés sont des signaux moyennés dérivés d’échantillonnages aléatoires et d’itérations répétées. Cette approche vise à garantir que l’analyse capture les lectures les plus fiables et représentatives, l’incertitude de l’analyse étant proportionnelle à l’hétérogénéité inhérente du tissu.
   1. Ouvre l’application terminale si tu fonctionnes sous Linux ou macOS. Ouvre l’application WSL si tu fonctionnes sous Windows.
      Commande : cd /PATH_TO_CLONED_REPOSITORY/ImAge-main
      ATTENTION : Assurez-vous que le dossier actuel est le dossier ImAge_workflow, ce qui peut être vérifié en exécutant la commande : pwd.
   2. Activez l’environnement.
      Commande : conda activer ImAge_workflow
   3. Configurez les paramètres d’analyse sur le flux de travail/main.py fichier dans l’éditeur de code ou de texte (par exemple, l’application Notepad, Microsoft Visual Studio Code, etc.).
      1. Définissez le nom du projet dans la variable p à un identifiant court et sûr pour le système de fichiers utilisé pour organiser les sorties (par exemple, p = brain_3ages_k27me3).
      2. Définissez la liste des canaux pour l’extraction des fonctionnalités dans le chs. Inclure le canal de segmentation si des caractéristiques de ce canal sont requises pour l’analyse (chs = ['DAPI', 'H3K27me3', 'H3K27ac']).
      3. Cartographiez les identifiants de canaux d’image des noms de fichiers vers les colonnes de la carte des plaques à l’aide de imageIndex. Déterminez le format de l’étiquette de canal utilisé par le système d’imagerie pour acquérir les données d’image et utilisez cette étiquette comme clé. Associez chaque étiquette à l’en-tête de colonne exact, sensible aux majuscules, dans la carte de platemap enregistrée à l’étape 1.2.2 (par exemple, imageIndex = {'1' : 'Channel1', '2' : 'Channel2', '3' : 'Channel3'}).
         ATTENTION : Les noms de colonnes sont sensibles à la casse et doivent correspondre à votre fichier de carte des plaques.
      4. Définissez les emplacements des données : orgDataLoadPath vers la racine du jeu de données, orgDataSubFolder vers le sous-dossier image si nécessaire, et resultsSavePath vers la racine de sortie.
      5. Confirmez l’extension de nom de fichier dans imageFileFormat et modifiez imageFileRegEx pour utiliser des groupes de capture nommés en Python pour toutes les parties requises : ligne, col, champ, zposition et canal. Utilisez la syntaxe suivante : ( ? P\d+), où GROUP est remplacé par row, col, field, zposition ou channel.
         REMARQUE : Mettez à jour la règle régulière si les noms de fichiers diffèrent ; tous les groupes nommés doivent analyser correctement. Par exemple, le nom du fichier r01c11f01p01-ch1sk1fk1fl1.tiff doit être converti en ce qui suit : r( ? P\d+)c( ? P\d+)f( ? P\d+)p( ? P\d+)-ch( ? P\d+)sk1fk1fl1\.tiff.
      6. Régler le canal de segmentation dans segmentation_ch sur le canal nucléaire utilisé pour la détection d’objets (par exemple, segmentation_ch = « DAPI »).
      7. Décidez si vous souhaitez utiliser la correction d’illumination en réglant illumiCorrection. Réglez sur True pour calculer et appliquer les modèles BaSiC ; réglez sur Faux pour traiter les images brutes.
         REMARQUE : Pour les plaques de ≥ 25 puits, une correction d’éclairage est recommandée afin de réduire le biais systématique.
      8. Réglez la taille physique du voxel en micromètres dans voxel_dim comme [z, y, x]. Utilisez les métadonnées du microscope pour déterminer l’espacement (par exemple, voxel_dim = [1,0, 0,6, 0,6]). Sauvegardez le fichier et fermez l’éditeur après avoir vérifié chaque paramètre
   4. Exécutez des scripts pour obtenir des lectures ImAge et effectuer des validations. Pendant l’exécution du script, ne fermez pas le terminal ni l’application WSL.
      Commande : Workflow/main.py Python
      REMARQUE : Le script (main.py) englobe toutes les étapes, y compris la segmentation, l’extraction de caractéristiques, la construction de l’axe ImAge et la prédiction par défaut. Le script génère un temps d’achèvement estimé pour chaque étape (par exemple, segmentation des noyaux). Chaque processus (par exemple, o1_illumination_correction) générera des fichiers intermédiaires au format .pickle contenant les résultats de chaque procédé. Cependant, cela vise uniquement le transfert de données entre processus afin d’assurer un traitement standardisé et n’est pas destiné à la manipulation par l’utilisateur dans cet article. Néanmoins, si les utilisateurs doivent manipuler ou adopter ces fichiers, consultez la documentation incluse dans chaque fonction Python pour la forme et les types de données¹³.
   5. Visualisez les résultats et exportez les lectures brutes ImAge pour une analyse supplémentaire sur un logiciel externe. Commande : Workflow/visualization.py Python
      REMARQUE : Cette étape produit les chiffres et tableaux des lectures ImAge, et les fichiers sont situés respectivement à fig_o4_ImAge_validation_VIOLIN et export_o4_ImAge_validation (Figure 2).

Résultats

Les images représentatives doivent être bien peuplées pour obtenir des cellules uniques, mais les noyaux individuels ne doivent pas se toucher, car cela dégrade la qualité de la segmentation des noyaux cellulaires. La figure 3 montre l’imagerie représentative pour obtenir des résultats d’analyse computationnelle robustes.

Les résultats présentés dans ce manuscrit de méthode sont adaptés du manuscrit ImAge d’Alvarez-Kuglen et

Discussion

Préparation de l’échantillon
Pour la préparation de l’échantillon, prélevez rapidement les tissus d’intérêt et congelez-les immédiatement dans de l’azote liquide. Lors du broyage du tissu avec un mortier et pilon, un couvercle en silicone peut être utilisé pour éviter la perte d’échantillons. Ajoutez plus d’azote liquide si le tissu est difficile à pulvériser. Pour les tissus plus fragiles, les échantillons peuvent également être traités frais (plutôt que congelés) af...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Albumine sérique bovine	Sigma-Aldrich & nbsp ;	A9647
Anti-Ogg anti-souris Donkey (H+L) anticorps secondaire fortement adsorbé croisé, Alexa 488  ;	Invitrogen	A-21202
Anti-Rabbit IgG (H+L) Anticorps secondaire fortement adsorbé croisé, Alexa 555	Invitrogen	A-31572
Glycine	Bio-Rad	161-0718
Anticorps Histones H3K27ac (mAb)  ;	Motif actif	39685
Anticorps Histones H3K27me3 (pAb)  ;	Motif actif	39155
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570
Kit d’isolation des noyaux : Nuclei EZ Prep	Sigma-Aldrich	NUC101
Opéretta CLS High Content Imager	Revvity	https://www.revvity.com/au-en/product/operetta-cls-system-hh16000020
Paraformaldéhyde 16 % de Solution aqueuse de qualité EM	Sciences de la microscopie électronique	15710-S
PBS	Thermo Fisher	AM9624
Microplate PhenoPlate à 384 puits	Revvity	6057302
Triton-X	Sigma	T8787
Solution Trypan Blue, 0,4 %   ;	Gibco & nbsp ;	15250061  ;