Method Article

Analyse spécifique au sous-type cellulaire du protéasome de la membrane neuronale dans les neurones somatosensoriels

DOI:

10.3791/69061

⸱

October 10th, 2025

 ,  , 
1Department of Molecular Pharmacology and Neuroscience, Loyola University Chicago Stritch School of Medicine, 2Center for Translational Research and Education

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protéasome de la membrane neuronale (NMP) a récemment été identifié dans un sous-ensemble de neurones somatosensoriels comme un régulateur clé de la perception du toucher, de la douleur et des démangeaisons. Cet article présente un flux de travail robuste pour analyser l’expression et la fonction de la NMP spécifique au type de cellule à l’aide du tri cellulaire, du profilage du transcriptome et des analyses immunofluorescentes basées sur la culture.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La signalisation des neurones sensoriels dépend des protéasomes fonctionnels, et leur localisation subcellulaire influence la fonction. Un complexe protéasome spécialisé, le protéasome de la membrane neuronale (NMP), a récemment été identifié dans une sous-population de neurones somatosensoriels périphériques. La NMP se localise exclusivement à la membrane plasmique du soma et aux axones proximaux et distaux. Le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) a révélé que, dans des conditions normales, la NMP est principalement exprimée dans les neurones MrgprA3+ et Cysltr2+, qui médient les sensations mécaniques, les démangeaisons et la douleur. L’inhibition aiguë et sélective de la NMP dans la peau de la patte des souris a réduit la sensibilité mécanique et la sensibilité à la douleur sans affecter la sensation thermique. Notamment, contrairement à l’inhibition globale du protéasome, l’inhibition sélective de la NMP ne provoque pas de neuropathie. Des études in vitro suggèrent que la NMP facilite la communication de neurone à neurone, potentiellement par la libération de peptides de signalisation, et qu’elle est essentielle aux réponses neuronales normales à la stimulation. Ces résultats identifient la NMP comme un régulateur clé de la diaphonie sensorielle des neurones nécessaire au toucher normal, à la douleur et à la sensation de démangeaison. Ainsi, la NMP représente une cible potentielle pour la gestion de la douleur. Cet article présente des méthodes permettant d’isoler les populations neuronales exprimant et non exprimant la NMP en utilisant l’alimentation en anticorps et le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Ces populations sont adaptées au profilage d’expression spécifique au type de cellule via le scRNA-seq ou les analyses de la dynamique d’expression de la NMP basées sur la culture. Ensemble, ces méthodes fournissent un flux de travail robuste pour étudier la dynamique d’expression de la NMP et sa contribution aux affections pathologiques liées à la douleur.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La fonction du protéasome est essentielle au développement et au maintien optimaux du système nerveux périphérique (SNP)1,2,3,4,5,6. Des études in vitro et in vivo utilisant des inhibiteurs du protéasome démontrent que l’activité protéasomale est cruciale pour le développement neurologique, la myélinisation, l’excitabilité et la fonction des cellules gliales 7,8,9,10. De plus, la chimiothérapie à base d’inhibiteurs du protéasome induit des neuropathies douloureuses chez 30 à 60 % des patients, souvent caractérisées par une douleur chronique et une altération de la sensation dans les extrémités 8,9,11,12,13. Il est intéressant de noter que l’administration à faible dose de ces mêmes inhibiteurs réduit la sensibilité aux stimuli douloureux, suggérant un rôle complexe du protéasome dans le traitement sensoriel 6,14,15. Cependant, malgré ces études approfondies, la fonction spécifique des protéasomes dans le SNP est restée mal comprise.

Les protéasomes sont la principale machinerie de dégradation des protéines dans tous les domaines de la vie et sont essentiels au maintien de l’homéostasiedes protéines 16. Le protéasome de base 20S est composé de quatre cycles heptamériques de sous-unités α, β, β α et médie la dégradation des protéines indépendante de l’ubiquitine17,18. L’association avec des particules régulatrices forme le protéasome coiffé 26S et 30S, qui médie la dégradation des protéines dépendante de l’ubiquitine 4,17. Dans les neurones, les protéasomes ont été identifiés dans tous les compartiments cellulaires, et leur localisation subcellulaire est connue pour influencer la fonction19. Cependant, de nombreux inhibiteurs de protéasome couramment utilisés manquent de spécificité pour cibler sélectivement des populations de protéasome localisées de manière différentielle.

En effet, en utilisant des inhibiteurs de protéasome imperméables à la membrane et le marquage des anticorps dans des cellules non perméabilisées, il a été constaté qu’un complexe de protéasome spécifique aux neurones se localise dans la membrane plasmique dans un sous-ensemble de neurones somatosensoriels20. L’analyse scRNA-seq des neurones primaires du ganglion de la racine dorsale (DRG), séparés en populations NMP+ et NMP- par l’alimentation en anticorps contre une sous-unité du protéasome et le tri FACS, a abouti à 20 amas de cellules transcriptionnellement distincts20. Une analyse plus approfondie a révélé que les cellules NMP+ ne se regroupaient que dans 3 des 20 groupes. À l’aide d’ensembles de marqueurs génétiques pour des sous-types neuronaux spécifiques, 13 sous-types différents de neurones somatosensoriels ont été identifiés. La majorité des neurones NMP+ se sont regroupés avec les neurones sensoriels MrgprA3+ et Cysltr2+ 20. Un nombre minimal de cellules NMP+ s’est regroupé dans un troisième groupe, dans lequel aucun ensemble de gènes spécifiques n’a été identifié, et ce groupe n’a donc pas été attribuéà 20. Les neurones MrgprA3+ et Cysltr2+ sont des nocicepteurs de type C, sensibles à la chaleur, aux stimuli mécaniques et pruritogènes, correspondant aux sous-types neuronaux CGRP-θ et SST, respectivement21,22. Sur les 20 amas de cellules identifiés, 7 amas NMP exprimaient des marqueurs génétiques compatibles avec des cellules non neuronales, y compris les cellules de Schwann, la glie satellite et les cellules immunitaires, et n’ont pas non plus été attribués20. Ces populations cellulaires étaient attendues, car il n’est pas possible de séparer les cellules non neuronales des cellules neuronales lors de la culture de neurones DRG20.

En étudiant sa fonction, l’inhibition in vitro de la NMP a modifié l’excitabilité neuronale à la stimulation du KCl, de l’histamine et de l’αβ-méthylèneadénosine 5'-triphosphate20. In vivo, l’inhibition de la NMP a réduit la sensibilité aux stimuli mécaniques et à la douleur, sans effet sur la sensation thermique20. Ces résultats révèlent que la NMP est un régulateur clé de la sensation mécanique, de la douleur et des démangeaisons, et une cible thérapeutique potentielle pour la gestion de la douleur20. Cependant, les mécanismes spécifiques liant l’activité de la NMP au développement de la douleur dans différents contextes pathologiques restent mal compris. Par conséquent, des recherches plus approfondies sur la dynamique et la fonction de l’expression de la NMP dans les affections associées à la douleur et à la neuropathie sont justifiées.

Cet article décrit ici un flux de travail robuste (Figure 1) pour identifier et isoler les populations neuronales NMP+ DRG. Cette approche permet d’étudier la dynamique d’expression des NMP à l’aide du tri FACS, du scRNA-seq et de l’immunomarquage. Ces approches permettent une analyse à haute résolution de l’expression de la NMP d’une manière spécifique au type de cellule, ce qui peut être utilisé pour étudier le rôle de la NMP dans des conditions normales et diverses affections associées à la douleur.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les méthodes décrites à l’aide d’animaux de laboratoire ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de la Stritch School of Medicine de l’Université Loyola de Chicago.

1. Préparation des solutions de digestion, des milieux DRG et des milieux FACS

  1. Préparez une solution saline complète (CSS) contenant 137 mM de NaCl, 5,3 mM de KCl, 1 mM de MgCl2·6H2O, 25 mM de sorbitol, 10 mM d’HEPES et 3 mM de CaCl2·2H2O. Ajustez le pH à 7,2 avec du NaOH et stérilisez par filtre.
  2. Préparez la solution de travail du mélange d’enzymes de dissociation tissulaire (trituration modérée) en combinant 190 μL de la mère (5 mg/mL dans H2O), 84 μL de 50 mM d’EDTA et 6,5 mL de CSS. Préparez frais et filtrez avant utilisation.
  3. Préparez une solution de mélange d’enzymes de dissociation tissulaire (faible trituration)-papaïne contenant 190 μL de solution mère de mélange d’enzymes, 150 μL de papaïne, 84 μL de 50 mM d’EDTA et 6,5 mL de CSS. Préparez frais et filtrez avant utilisation.
  4. Préparez une solution de BSA/TI/DMEM en combinant 7,5 mg d’inhibiteur de trypsine et 7,5 mg de BSA dans 5 mL de milieu DMEM/F12. Préparez frais et filtrez-la.
  5. Préparez des milieux neuronaux DRG en combinant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), 1 % de pénicilline/streptomycine, 1 % de glutamine et 2 % de supplément 50x B27 dans 430 ml de DMEM/F12.
  6. Préparez le tampon FACS en combinant 1 % de FBS, 1x PBS, 25 mM HEPES et 1 % de pénicilline/streptomycine dans de l’eau autoclave. Préparez frais et filtrez-la.
  7. Vingt-quatre heures avant le début du protocole, enduire deux tubes de polystyrène à fond rond de 5 mL en les remplissant de tampon FACS et en les plaçant à 4 °C.

2. Préparation d’une suspension de neurones DRG unicellulaire

  1. Récoltez tous les DRG de 4 à 6 souris P20-P23 en suivant les méthodes décrites précédemment20,23.
  2. Transférez les DRG dans un tube conique de 15 ml et ajoutez 7 ml de solution de travail de mélange d’enzymes de dissociation tissulaire (trituration modérée). Incuber en agitant doucement (en tournant) à 37 °C pendant 20 min.
  3. Essorez les ganglions à 120 × g pendant 2 min. Retirer délicatement le surnageant sans déranger la pastille et remettre les ganglions en suspension dans 7 mL de solution de travail de mélange d’enzymes de dissociation tissulaire (faible trituration) et de papaïne. Incuber en agitant doucement (en tournant) à 37 °C pendant 15 min.
  4. Essorer à 120 × g pendant 2 min. Retirer le surnageant et remettre les ganglions en suspension dans 500 μL de solution BSA/TI/DMEM.
  5. Triturez les ganglions 12 à 16 fois avec une pipette Pasteur en verre poli au feu bouchée de 1 ml.
  6. Filtrez les débris cellulaires en les faisant passer à travers une crépine de 40 μm. Lavez la passoire avec 1 mL de solution BSA/TI/DMEM pour assurer la collecte de tous les neurones DRG. Transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 ml.
  7. Essorer à 120 × g pendant 2 min. Retirez le surnageant et remettez doucement la pastille en suspension dans 1 mL de média DRG.
    REMARQUE : Il s’agit de la suspension de neurone DRG à cellule unique.

3. Alimentation en anticorps pour marquer les neurones NMP-positifs

  1. Divisez la suspension neuronale DRG en deux tubes de 1,5 mL, contenant chacun 500 μL, et étiquetez les deux tubes : « primaire » et « sans primaire ».
  2. Ajouter 20 μL d’anticorps anti-protéasome de chèvre de la sous-unité alpha 2 (PSMA2) dans le tube marqué « primaire » (dilution 1:25).
    1. Facultatif : Pour tester l’intégrité de la membrane et la spécificité de l’anticorps PSMA2, incluez un échantillon supplémentaire de DRG primaires incubés avec une chaîne lourde anti-neurofilaments (NF-H) de poulet (1:1 000) suivie d’un échantillon secondaire (1:250) (par exemple, conjugué à 488) de poulet (étape 3.10).
      REMARQUE : Le contrôle du marquage anti-NF-H ne doit pas aboutir à un marquage cellulaire si la membrane neuronale est intacte.
  3. Incuber les cellules en une légère agitation pendant 30 min à 37 °C.
  4. Filtré à chaud, stérilisé 1x PBS pendant l’incubation primaire de l’anticorps.
  5. Centrifuger les tubes à 200 × g pendant 2 min et prélever 90 % du surnageant (jeter).
  6. Remettez les neurones en suspension dans 500 μL de PBS chaud. Incuber les tubes en agitant doucement pendant 3 min à 37 °C.
  7. Répétez les étapes 3.5-3.6 pour un total de trois lavages.
  8. Pendant les étapes de lavage, préparez l’anticorps secondaire en diluant 4 μL d’IgG anti-chèvre (fluorophore de 555 nm) dans 1 000 μL de média DRG chaud (dilution 1:250).
  9. Après le troisième lavage, remettre en suspension les tubes « primaire » et « sans primaire » dans 500 μL de la solution d’anticorps secondaire.
    REMARQUE : À partir de ce moment, protégez les tubes de la lumière en les enveloppant dans du papier d’aluminium.
  10. Incuber les tubes en agitant doucement pendant 40 min à 37 °C.
  11. Lavez les cellules en répétant les étapes 3.5-3.6 pour un total de trois lavages.
  12. Après le troisième lavage, remettre les neurones en suspension dans 300 μL de tampon FACS. Transférez les cellules remises en suspension dans des tubes à fond rond en polystyrène séparés de 5 ml et placez-les sur de la glace dans un seau à glace avec couvercle pour les protéger de la lumière.
  13. Placez les tubes à fond rond prétraités contenant le tampon FACS de la veille dans le seau à glace avec les tubes contenant les cellules et passez à l’étape de tri FACS.

4. Séparation des neurones NMP-positifs (NMP+) et NMP-négatifs (NMP-) via le tri FACS

  1. Immédiatement après l’alimentation en anticorps et le marquage des neurones DRG, apportez les cellules et les tubes revêtus à un trieur FACS.
  2. Ajouter la 7-aminoactinomycine D (7-AAD) (1:1 000) aux tubes « primaires » et « sans primaire ». Incuber pendant 10 à 30 min sur glace.
    REMARQUE : Le 7-AAD est utilisé pour exclure les cellules mortes du processus de tri.
  3. Retirez le tampon FACS des tubes qui ont été enduits pendant la nuit et remplacez-le par 1 ml de tampon FACS frais. Ces tubes servent de tubes de collecte pour les neurones triés.
  4. Utilisez le tube étiqueté « sans primaire » pour définir les paramètres et le contrôle pour les neurones non étiquetés.
  5. Appliquez le déclenchement par diffusion directe (FSC) pour isoler les cellules correspondant à la taille des neurones sensoriels. Le diamètre des neurones sensoriels varie de 10 à 50 μm.
  6. Appliquez un contrôle de diffusion latérale (SSC) pour exclure les cellules mortes et les débris (diffusion latérale inférieure) et pour isoler les événements compatibles avec la granularité des neurones DRG (diffusion latérale plus grande).
  7. Chargez le tube « primaire » et réglez les paramètres de déclenchement établis avec l’échantillon « sans primaire » pour détecter les populations neuronales non marquées (NMP-) et 555-positives (NMP+).
  8. À l’aide d’une buse de 100 μm et d’une pression de tri de 15-20 psi, triez les neurones en 555+ et 555-.
  9. Passez à l’analyse en aval des neurones triés.

5. Séquençage de l’ARN unicellulaire des neurones NMP+ et NMP-

  1. Transférez les cellules triées dans des tubes de 1,5 mL et placez-les sur de la glace. Transportez les cellules vers un noyau de séquençage unicellulaire.
  2. Effectuez le séquençage de l’ARN unicellulaire sur les neurones triés NMP+ et NMP à une profondeur de 30 000 à 100 000 lectures par cellule.
  3. Analysez les données de scRNA-seq à l’aide de divers logiciels disponibles gratuitement pour générer des grappes de cellules en fonction de profils d’expression génique spécifiques. Pour plus de détails sur les étapes d’analyse et les programmes précédemment utilisés, reportez-vous à Villalón Landeros et al.20.
  4. Construisez une liste de marqueurs génétiques spécifiques pour identifier des populations neuronales individuelles à l’aide de bases de données disponibles telles que https://painseq.shinyapps.io/harmonized_painseq_v2/ ou https://kleintools.hms.harvard.edu/tools/springViewer_1_6_dev.html?datasets/Sharma2019/all
  5. Utilisez la liste de marqueurs génétiques spécifiques pour identifier les amas de cellules résultants.
    REMARQUE : L’analyse scRNA-seq précédemment réalisée a été réalisée par une société de conseil indépendante (www.cmcherryconsulting.com).

6. Cultures primaires de neurones NMP+ et NMP- enrichis

  1. La veille de l’expérience, placer des lamelles rondes de 12 mm dans une plaque de culture à 24 puits (1 lamelle/puits) et laver avec de l’éthanol à 70 % pendant 15 min. Ensuite, rincez à l’eau stérile 3 fois et séchez à l’air libre dans une hotte de culture de tissus stérile.
  2. Une fois que les lamelles sont sèches, enduisez-les de bromhydrate de poly-L-lysine (PLL) de 0,1 mg/mL et placez-les à 4 °C pendant la nuit.
  3. Le jour de l’expérience, retirez la LPL, rincez les lamelles à l’eau stérile 3 fois et laissez sécher dans une hotte de culture tissulaire.
    REMARQUE : Le PLL peut être sauvegardé et réutilisé.
  4. Diluer 10 μL de laminine à 1 mg/mL dans 125 μL de milieu DRG et placer 20 à 30 μL au centre de chaque lamelle.
  5. Enduire les lamelles de laminine pendant au moins 40 minutes avant utilisation.
  6. Transférez les cellules triées par FACS dans un tube de 1,5 mL et centrifugez à 200 × g pendant 5 min pour prélever les cellules. Retirez le surnageant et remettez les neurones en suspension dans 50 μL de média DRG chaud.
  7. Aspirez la laminine de la lamelle et laissez la lamelle sécher.
  8. Semez 15 à 20 μL de neurones remis en suspension sur chaque lamelle. Déplacez avec précaution la plaque avec les lamelles ensemencées dans un incubateur de culture tissulaire et incubez pendant au moins 30 minutes (pas plus de 1 h) pour permettre aux cellules d’adhérer.
  9. Remettre la plaque dans un capuchon de culture tissulaire et ajouter 1 mL de milieu DRG chaud stérile dans chaque puits contenant des cellules sur des lamelles.
    REMARQUE : Abaissez la pointe de la pipette dans le coin inférieur du puits et distribuez lentement pour éviter de toucher la lamelle et de perturber les cellules. L’ajout trop rapide de média peut créer des turbulences et déloger les cellules.
  10. Maintenir les cultures à 37 °C avec 5 % de CO2/95 % d’humidité avec 75 % de changements de milieu tous les 2-3 jours.

7. Analyse de l’expression de la NMP spécifique au type de cellule

  1. Préparez une plaque de culture de 140 mm ou un plateau de coloration par immunofluorescence en le recouvrant d’un gros morceau de parafilm.
  2. À l’aide d’une pince stérile 5/45, transférez les lamelles de la boîte de culture tissulaire sur le parafilm sur le plateau de coloration, en vous assurant que le côté contenant les neurones DRG est orienté vers le haut.
  3. Ajoutez 100 μL de média DRG dans chaque lamelle du parafilm pour éviter que les cellules ne se dessèchent.
    REMARQUE : Ajouter les liquides en pipetant lentement juste au-dessus du bord de la lamelle.
  4. Diluer l’anticorps primaire anti-PSMA2 de chèvre dans un milieu DRG chaud à une dilution de 1:20.
  5. À l’aide d’un aspirateur équipé d’un embout non filtré P10, retirez lentement le média de la lamelle en aspirant par le bord. Ajouter 100 μL de solution d’anticorps anti-PSMA2 de chèvre dans les lamelles et incuber à température ambiante pendant 40 min.
  6. Aspirez soigneusement la solution d’anticorps primaire des lamelles. Ajouter 100 μL de PBS (à température ambiante) et incuber pendant 3 min à température ambiante pour laver.
  7. Aspirez le PBS de la lamelle et répétez l’ajout et l’aspiration du PBS pour un total de trois lavages.
  8. Préparer l’anticorps secondaire anti-chèvre (p. ex., conjugué 555) dans un milieu DRG chaud à une dilution de 1:250.
  9. Après le troisième lavage, ajouter 100 μL de l’anticorps secondaire dilué dans la lamelle et incuber à température ambiante pendant 40 min.
    REMARQUE : À partir de ce pas en avant, protégez les cellules de la lumière.
  10. Aspirez la solution d’anticorps secondaire de la lamelle et lavez-la 3 fois comme décrit aux étapes 7.6 et 7.7.
  11. Retirez le dernier lavage PBS et fixez les cellules en ajoutant 100 μL de solution fixatrice contenant 4 % de paraformaldéhyde (PFA), 4 % de saccharose dans 1x PBS. Incuber à température ambiante pendant 10 min.
  12. Aspirez le fixateur et lavez-le 3 fois en répétant les étapes 7.6-7.7.
  13. Perméabiliser les cellules en ajoutant 100 μL de détergent non ionique à 0,1 % (par exemple, Triton X-100) dans 1x PBS et incuber à température ambiante pendant 5 min.
  14. Aspirez la solution de perméabilisation et lavez 3 fois en répétant les étapes 7.6-7.7.
  15. Ajouter 100 μL de solution bloquante composée de 5 % de FBS, 5 % de sérum d’âne dans 1x PBS et incuber à température ambiante pendant 40 min.
  16. Préparez un mélange d’anticorps primaires spécifiques au type de cellule de neurone DRG selon les dilutions suivantes dans une solution bloquante : peptide lié au gène anti-calcitonine de lapin (CGRP) (1:500) ; isolectine B4, conjugué de biotine (IB4) (1:50) ; poulet anti-NF-H (1:1000).
    REMARQUE : Ces anticorps n’interfèrent pas les uns avec les autres et peuvent être ajoutés dans la même solution.
  17. Retirez la solution bloquante et ajoutez le mélange d’anticorps primaires dans la lamelle. Incuber à température ambiante pendant 45 min.
  18. Retirez la solution d’anticorps et lavez-la 3 fois en répétant les étapes 7.6-7.7.
  19. Préparez une solution de mélange d’anticorps secondaires en diluant la streptavidine (p. ex., conjuguée 647), l’anti-lapin d’âne (p. ex., conjuguée 488) et l’anti-poulet d’âne (p. ex., conjuguée 405) à 1:500 chacune.
  20. Retirez le dernier lavage PBS et ajoutez 100 μL de solution d’anticorps secondaire dans les lamelles. Incuber à température ambiante pendant 45 min.
  21. Lavez 3 fois en répétant les étapes 7.6-7.7.
  22. Facultatif : Préparer la coloration nucléaire à 1-10 μg/mL. Ajouter 100 μL de solution de coloration nucléaire, incuber pendant 30 s à température ambiante et laver 2 fois avec de l’eau désionisée (diH2O) en répétant les étapes 7.6-7.7.
  23. Aspirez le dernier lavage de la lamelle et, à l’aide d’une pince à pointe fine, soulevez la lamelle du parafilm. Épongez l’excès de liquide en touchant doucement le bord de la lamelle sur un mouchoir non pelucheux.
  24. Placez une gouttelette de 7 μL de support de montage sur une lame de microscope. Placez délicatement la lamelle sur la gouttelette du fluide de montage, en vous assurant que les cellules sont orientées vers le bas et sont en contact avec le fluide.
  25. Placez les lames de microscope avec lamelles dans un tiroir ou une boîte sombre et sec pendant au moins 1 h pour sécher et sceller le bord de la lamelle. Terminez de sceller le bord des lamelles avec du vernis à ongles à séchage rapide et attendez 10 à 15 minutes avant l’imagerie.
  26. Imagez les lames à l’aide d’un microscope confocal à fluorescence ou à disque rotatif équipé des filtres de lumière appropriés pour visualiser la fluorescence bleue, verte, rouge et rouge lointaine.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La capacité de distinguer la NMP des protéasomes intracellulaires repose sur des approches de marquage membranaire. L’alimentation en anticorps permet l’utilisation d’anticorps spécifiques à la sous-unité du protéasome sur les neurones vivants pour marquer les protéasomes accessibles uniquement de l’extérieur de la cellule. En raison de leur taille et de leur hydrophilie, les anticorps sont incapables de traverser les membranes cellulaires intactes24. Les neurones ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les protéasomes sont essentiels dans toutes les cellules et peuvent être trouvés dans tous les compartiments de la cellule19. La découverte récente d’un complexe protéasome spécialisé, le NMP, dans les neurones des systèmes nerveux central25, 26, 27et périphérique20 a changé notre compréhension actuelle de la fonction des protéasomes. Des travaux a...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

E.V.L a été soutenu par des fonds de démarrage de la Stritch School of Medicine de l’Université Loyola de Chicago. Nous tenons à remercier Robert Ladd pour ses conseils et son aide avec FACS.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 M de solution tampon HEPES, pH 7,3Qualité biologique118-089-721Tampon FACS
10 fois par PBSThermo Fisher Scientific70011-044Tampon FACS
solution mère de paraformaldéhyde (PFA) à 16 %; Grade EMEMS15710solution de fixation
1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Fisher Scientific10-010-023Lavages FACS
Tube à fond rond en polystyrène de 5 mLFisher Scientific14-959-6Tubes FACS
7-aminoactinomycine D (7-AAD)InvitrogenA1310Étiquettes cellules mortes
Supplément B27Thermo Fisher Scientific17504044milieu de culture
Albumine sérique bovineMilliporeSigmaA9647 ; N° CAS : 9048-46-8BSA/TI/DMEM
Chlorure de calcium dihydraté (CaCl ?-2H ? O)MilliporeSigmaRéf. C7902Solution saline complète
Chaîne lourde anti-neurofilaments de poulet (NF-H)MilliporeSigmaAB5539anticorps
DMEM/F12 1:1Thermo Fisher Scientific11320033milieu de culture; BSA/TI/DMEM
Âne anti-chèvre IgG (H+L) Alexa Fluor Plus 555Thermo Fisher ScientificN° A32816anticorps
Âne anti-lapin IgG (H+L) Alexa Fluor Plus 488Thermo Fisher ScientificN° A32790anticorps
DyLight 405 âne anti-pouletJackson ImmunoResearch703-475-155anticorps
EDTAMilliporeSigmaE5134 ; Numéro d’identification CAS : 6381-92-6Solutions de travail Liberase TM/Liberase TL-papain
Sérum fœtal bovin (FBS)MilliporeSigmaN° A9647milieu de culture/tampon FACS/solution bloquante
Pipette pasteur en verre, 9 poucesFisher ScientificRéférence 1367820Dtitruration
Chèvre anti-PSMA2Fabriqué en interneNAanticorps
Poudre HEPESMilliporeSigmaN° H4034Solution saline complète
HoechstThermo Fisher ScientificN° H21492Coloration nucléaire
Sérum de chevalThermo Fisher Scientific26050070Solution de blocage
IB4, conjugué de biotineMilliporeSigmaL2140anticorps
LaminineSigma-AldrichL2020-1MGplat de culture
L-glutamineThermo Fisher Scientific25030081milieu de culture
Liberase trituration basse (TL)MilliporeSigma54010200001Liberase TL solution mère
Liberase trituration modérée (TM)MilliporeSigma5401119001Liberase TM solution mère
Chlorure de magnésium hexahydraté (MgCl ?-6H ? O)MilliporeSigmaRéférence M2393Solution saline complète
Supports de montageSouthernBiotech0100-01Fluoromount-G
PapaïneWorthingtonN° de catalogue : 9001-73-4Solution de travail Liberase TL-papain
Pénicilline/streptomycineMilliporeSigma15140122milieu de culture/tampon FACS
Bromhydrate de poly-L-lysine (PLL)MilliporeSigmaRéf. P4707plat de culture
Chlorure de potassium (KCl)MilliporeSigmaRéf. P5405Solution saline complète
Lapin anti-CGRPImmunostar24112anticorps
chlorure de sodium (NaCl)MilliporeSigmaS9888 ; Numéro d’identification CAS : 7647-14-5Solution saline complète
SorbitolMilliporeSigmaRéférence 56755-MSolution saline complète
Streptavidine Alexa Fluor 647 conjuguéThermo Fisher ScientificRéf. S21374anticorps
SaccharoseSigma-AldrichS0389-500Gsolution de fixation
Inhibiteur de la trypsineMilliporeSigmaT9253 ; N° CAS : 9035-91-8BSA/TI/DMEM

References

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