Article de méthode

Modélisation de la réparation dysplasique et fonctionnelle de l’alvéole pulmonaire après une infection grippale

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DOI :

10.3791/69062

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19 septembre 2025

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1Cancer and Developmental Biology Laboratory, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

Dans cet article

Résumé

Ce protocole fournit des instructions pour l’administration intranasale de l’IAV et l’analyse en aval des lésions pulmonaires de souris et des modifications transcriptionnelles associées aux types de cellules pulmonaires.

Résumé

L’infection virale cause des dommages aigus et à long terme à l’alvéole pulmonaire, la structure tissulaire spécialisée responsable des échanges gazeux entre le système cardiovasculaire et l’environnement extérieur. L’infection par le virus de la grippe A (IAV) chez la souris représente un modèle translationnel de la réponse du poumon humain à l’infection virale et induit des changements transitoires et persistants de l’état cellulaire de l’alvéole. Dans certains cas, des états cellulaires aberrants induits par des lésions virales qui ne se résolvent pas au fil du temps peuvent altérer de façon permanente la fonction critique d’échange gazeux du poumon. Cet article présente des méthodes d’infection intranasale de souris avec A/PR/8/34 IAV et la caractérisation des altérations transitoires et durables de la composition cellulaire et de la structure tissulaire des poumons endommagés. Ce modèle permet une étude détaillée des mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à la réparation pulmonaire et au dysfonctionnement chronique. Cette approche offre également une plate-forme pour évaluer les interventions thérapeutiques visant à promouvoir une régénération pulmonaire efficace et à restaurer la fonction respiratoire après une lésion virale.

Introduction

Les poumons jouent un rôle crucial dans l’apport d’oxygène et de nutriments aux tissus locaux. Les cellules endothéliales (CE) qui peuplent les petits vaisseaux sanguins capillaires des poumons sont essentielles au bon fonctionnement du tissu pulmonaire, au maintien de l’intégrité vasculaire et à l’efficacité des échanges gazeux1. Les CE forment la niche vasculaire et interagissent réciproquement avec d’autres cellules telles que les cellules épithéliales, les cellules immunitaires et les cellules mésenchymateuses. Cela contribue à la régulation du développement pulmonaire et à la réparation des tissus en réponse à une blessure ou à une maladie2.

L’infection par le virus de la grippe A H1N1 est un problème mondial3. Les patients atteints d’une infection H1N1 sont souvent diagnostiqués avec des lésions alvéolaires diffuses exsudatives (DAD)4. L’infection par le virus H1N1 peut entraîner de graves lésions pulmonaires et de graves conséquences, notamment une pneumonie, une lésion pulmonaire aiguë sévère (LAI) et un syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA)5. Les dommages proviennent principalement du virus qui infecte les cellules épithéliales pulmonaires, ce qui provoque une réponse immunitaire excessive entraînant une inflammation, des lésions tissulaires et une accumulation de liquide dans les poumons. Les cellules épithéliales qui tapissent les voies respiratoires et les alvéoles, qui sont responsables des échanges gazeux, sont ainsi directement endommagées par le virus H1N1, entraînant une perturbation de la structure normale du poumon 6,7. Il est devenu clair que d’autres types de cellules, bien qu’ils ne soient pas directement infectés par l’IAV, peuvent être endommagés en réponse à l’infection 8,9. Les lésions tissulaires après une infection grippale affectent donc tous les compartiments cellulaires du poumon, et il a récemment été démontré que l’infection par l’IAV provoque des changements transitoires et persistants de l’état cellulaire dans plusieurs compartiments cellulaires9. Cette plasticité cellulaire en réponse à la maladie peut être utile ou nuisible à la réparation réussie des tissus et justifie une étude plus approfondie.

Le modèle expérimental le plus adopté pour étudier la grippe et sa pathogenèse est l’infection intranasale de souris par le virus de la grippe A/PR/8/3410. Il s’agit d’une technique importante permettant d’étudier la gravité de la maladie, la mortalité et l’infectiosité virale. L’infection intranasale des souris imite la voie d’infection naturelle chez l’homme et permet d’étudier les réponses immunitaires adaptatives et innées contre le virus. En 1934, une souche spécifique du virus de la grippe A « A/PR/8/34 » a été isolée chez un patient à Porto Rico11. Cette souche du virus de la grippe a maintenant été adaptée aux souris et n’infecte plus les humains de manière productive. En raison des similitudes entre les systèmes immunitaires de la souris et de l’homme, les souris sont le modèle animal le plus populaire pour la recherche sur l’IAV12. Dans cette méthode, la souche A/PR/8/34 H1N1 est administrée directement à des souris par les narines, imitant une infection naturelle13. Il s’agit d’une méthode facile, rentable et pratique pour étudier les effets d’une infection virale sur le tissu pulmonaire de l’hôte dans des conditions de type sauvage (WT) ainsi que de knock-out (KO). Les techniques alternatives présentent des avantages et des inconvénients par rapport au modèle intranasal. L’inoculation intratrachéale (IT) permet une administration précise du virus dans les poumons, mais cette technique n’imite pas complètement l’infection par inhalation et ne fournit pas d’informations sur la toxicité dans les voies respiratoires supérieures. L’inoculation informatique nécessite également une grande habileté pour réduire le risque de lésion trachéale13,14. L’inoculation par inhalation d’aérosol (AR) imite la voie naturelle d’infection et crée une pathologie pulmonaire plus uniforme que l’infection intranasale, mais il peut être difficile de maintenir une concentration uniforme du virus dans l’aérosol et d’obtenir une administration précise de l’aérosol viral. L’innocuité est également une préoccupation importante de la méthode d’inoculation AR10. Par conséquent, la technique d’inoculation intranasale de l’administration de l’IAV est une approche cruciale pour la recherche axée sur la pneumologie sur les effets en aval de l’infection virale dans les lésions et la réparation des tissus. Contrairement aux modèles chimiques ou mécaniques, il offre un moyen plus réaliste et moins invasif d’étudier les lésions pulmonaires induites par la grippe et les interactions hôte-pathogène.

Ici, nous établissons une méthode reproductible pour l’infection intranasale de souris par le virus de la grippe A (A/PR/8/34) et pour caractériser les changements cellulaires et structurels à court et à long terme dans l’alvéole pulmonaire qui résultent d’une lésion virale. Les études utilisant cette méthode peuvent aider à découvrir les mécanismes de lésion et de réparation des tissus pulmonaires afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour les maladies pulmonaires.

Protocole

Travailler avec le virus de la grippe A dans un modèle animal est considéré comme un niveau de biosécurité 2 (BSL2) et un niveau de biosécurité animale 2 (ABSL2). Toutes les procédures animales utilisées pour générer ces données ont été approuvées par le Comité de soin et d’utilisation des animaux du Centre de recherche sur le cancer, Institut national du cancer, National Institutes of Health (Protocole #24-452). Ce protocole est également approuvé par le Comité institutionnel de biosécurité du Centre de recherche sur le cancer, Institut national du cancer, National Institutes of Health. Avant de commencer ce protocole, il est recommandé aux utilisateurs d’obtenir l’approbation du comité de protection et d’utilisation des animaux de leur établissement et de leur comité de biosécurité.

1. Préparation du stock de travail

REMARQUE : Tous les travaux avec le virus de la grippe doivent être effectués sur de la glace dans une enceinte de biosécurité. Éjectez les embouts et tout ce qui entre en contact avec le virus dans un récipient d’eau de Javel à 10 %. Les seaux à glace, les pipettes et les boîtes à pointes doivent être vaporisés avec une solution d’eau de Javel à 10 % plutôt que immergés. Incuber à température ambiante pendant au moins 30 min. Jetez les déchets solides dans un contenant à déchets biologiques dangereux et jetez les déchets liquides dans l’évier, en rinçant à l’eau.

  1. Décongeler du bouillon congelé (0,5 ml) de virus sur de la glace dans une enceinte de sécurité biologique.
  2. Installez un conteneur à déchets contenant 10 % d’eau de Javel dans l’eau du robinet. Placez deux boîtes de congélation en plastique ou en carton pouvant contenir jusqu’à 100 tubes d’échantillon dans un congélateur à -80 °C pour le pré-refroidissement.
  3. Pré-étiqueter 160 tubes de 1,5 mL pour les aliquotes du virus. Les tubes à vis sont préférables aux tubes à bouchon rabattable pour éviter de créer des aérosols lors de l’ouverture des tubes viraux pour l’utilisation. Placez les tubes sur de la glace pour pré-refroidir avant de faire des aliquotes de virus.
  4. Préparez des aliquotes de virus de 3 μL à l’aide d’une pipette P20 calibrée et d’embouts, en ne plaçant le virus que dans des tubes pré-refroidis et en gardant les aliquotes sur de la glace en tout temps.
  5. Après avoir fait des aliquotes, conservez-les dans une boîte de congélation préréfrigérée étiquetée « A/PR/8/34 Influenza Virus (IAV) », le numéro de catalogue, le numéro de lot et la date d’expiration.
    REMARQUE : Différents lots de virus ont une infectiosité différente et ne doivent pas être mélangés.
  6. Placez la boîte dans un congélateur à -80 °C. Assurez-vous de tout garder aussi froid que possible, car le titre viral diminuera à chaque cycle de congélation/décongélation.

2. Diluation d’aliquotes de virus pour utilisation dans des expériences d’infection intranasale

  1. Décongeler une aliquote de 3 μL de stock viral sur de la glace dans l’enceinte de biosécurité.
  2. Effectuer une dilution de 1:100 (dilution A) en transférant 2 μL de l’aliquote de 3 μL dans un tube prérefroidi de 1,5 mL contenant 198 μL de D-PBS froid.
  3. Continuer à diluer le stock viral jusqu’à ce qu’il atteigne la concentration appropriée pour 0,5-1 DL50 dans le fond de souche des souris utilisées. Gardez tout sur de la glace et utilisez des tubes prérefroidis pour éviter de trop réchauffer le virus.
    REMARQUE : Par exemple, pour le VR-95PQ, lot 70063082, infecter les souris avec 12 600 à 31 500 virus CEID50/μL (mis à l’échelle en fonction du poids corporel) à une dilution de 1:500 000.
  4. À partir de la dilution A (1:100), effectuer une dilution de 1:50 000 (dilution B) en ajoutant 10 μL de dilution A à 4990 μL de D-PBS froid dans un tube pré-refroidi de 15 mL. Bien mélanger en pipetant de haut en bas à l’aide d’une pipette sérologique de 5 ml.
  5. À partir de la dilution B, effectuer une dilution de 1:500 000 (dilution C) en ajoutant 200 μL de dilution B à 1,8 mL de D-PBS dans un tube de 5 mL pré-refroidi. Bien mélanger en pipetant de haut en bas.
    REMARQUE : Pour déterminer la dilution idéale du virus à utiliser pour infecter les animaux lors de l’achat d’un nouveau lot, il est possible d’estimer à l’aide du titre du virus indiqué sur la fiche produit et d’ajuster la dilution en fonction du titre du lot précédent. La meilleure façon de déterminer la dilution idéale est de titrer empiriquement le nouveau lot de virus à l’aide de souris C57BL/6 de type sauvage. Prévoyez une gamme de dilutions allant de 1:50 000 à 1:500 000 et commandez 1 à 2 cages de souris femelles C57BL/6 par dilution à tester. Infectez les souris à différentes concentrations et surveillez leur perte de poids. Pour tester les titres viraux, l’étude propose d’utiliser uniquement des souris femelles afin de réduire la variabilité qui peut être causée par les différences de sexe ou de poids entre les souris. Les souris femelles deviennent souvent plus malades que les souris mâles, peut-être en raison de leur petite taille ou en raison de différences spécifiques au sexe en réponse à l’infection grippale, comme c’est le cas pour d’autres formes de lésions pulmonaires chez la souris15. Bien que cela n’ait pas été étudié en détail, des souris femelles ont été utilisées dans les expériences de titrage parce que si le titre était déterminé à l’aide de souris mâles, les souris femelles pourraient mourir à la dose déterminée. Cependant, il a été constaté que les souris mâles tombent sensiblement malades et ont des lésions pulmonaires notables lorsqu’elles sont infectées par un titre viral, qui a été déterminé en utilisant uniquement des souris femelles. Une dilution idéale si vous utilisez des souris d’origine mixte ou consanguines sera « 1 LD50 », la dilution à laquelle 50 % des souris C57BL/6 de type sauvage meurent. Les souris consanguines sont plus résistantes à l’infection16 et seront blessées et se rétabliront bien à cette dilution. Si les souris de l’expérience se trouvent sur un fond consanguin C57BL/6, la dose idéale sera la moitié de ce « 0,5 LD50 ». Parce que le but de ces expériences est d’étudier les lésions et la réparation, il est idéal de définir une dose à laquelle les souris tombent malades et perdent 20 à 25 % de leur poids corporel, mais la plupart des souris finissent par récupérer (Figure 1). Si toutes les souris de l’étude ont à peu près le même poids (~25 g), il est possible d’administrer le virus de la grippe à 50 μL de la dilution appropriée à chaque souris. Cependant, le poids des souris varie de 15 à 35 g. Par conséquent, administrez 2 μL de dilution virale par gramme de poids corporel (par exemple, une souris de 15 g recevrait 30 μL de grippe, tandis qu’une souris de 35 g recevrait 70 μL). Il en résulte un niveau plus constant d’infection et de lésions tissulaires chez les animaux de différentes tailles. Cette information est nécessaire pour planifier le volume de dilution C.

3. Transport des aliquotes virales vers les animaleries

  1. Placez le tube de 5 ml contenant la dilution virale finale dans la glace et étiquetez le contenant avec un autocollant de danger biologique. Tapisser une boîte de support d’échantillons en plastique avec des essuie-tout pour absorber les déversements possibles.
  2. Placez le matériel nécessaire à l’infection intranasale à l’intérieur de la boîte étiquetée comme présentant un risque biologique : une pipette P200, une boîte non ouverte d’embouts de pipette P200 filtrés, un stylo et un tube conique de 50 ml rempli d’eau de Javel fraîche à 10 % pour les déchets viraux. Pour lutter contre l’infection, remplissez un tube de 1,5 mL avec le même D-PBS froid que celui utilisé pour diluer l’IAV.

4. Administration de l’IAV à des souris

REMARQUE : Travailler avec le virus de la grippe dans l’animalerie nécessite une installation de niveau de sécurité ABSL2. L’EPI standard comprend des blouses, une blouse de laboratoire jetable, deux bonnets pour cheveux, des gants en nitrile doubles, des couvre-chaussures doubles, des lunettes de protection (lunettes de sécurité) et un masque. Le virus de la grippe dilué doit être conservé sur de la glace tout au long du protocole d’administration pour éviter la perte d’infectiosité.

  1. Tout travail avec des virus doit avoir lieu à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité. Bien que le virus de la grippe A/PR/8/34 soit une souche adaptée aux souris, les virus de la grippe sont sujets aux mutations et, par conséquent, traitent le virus comme s’il était potentiellement infectieux pour les humains.
  2. Administrez l’anesthésie à l’isoflurane aux animaux un par un à un débit de 2,5 à 3 % sur le vaporisateur. Déplacez les animaux d’une boîte d’anesthésie à un cône nasal avant de leur administrer la grippe.
  3. Lorsqu’une souris est sous anesthésie, vérifiez sa respiration et pincez-vous les orteils pour voir si elle réagit. Les souris sont prêtes à l’infection par le virus de l’IAV lorsqu’elles réagissent à un pincement de l’orteil par une petite convulsion ou un « saut » - mais pas si elles sont suffisamment éveillées pour bouger la tête.
  4. À l’aide d’une pipette P200 réglée à 50 μL (ou 2 μL/g de poids corporel ; voir NOTE ci-dessous l’étape 2.5), aspirez l’IAV dilué (ou le témoin PBS) du flacon sur de la glace et déposez la pipette sur la boîte à pointes ou sur une serviette en papier où la pointe n’entrera pas en contact avec les gants ou la surface de l’enceinte de biosécurité.
  5. Prenez la souris anesthésiée en la frottant et maintenez-la face à la verticale à un angle de 45°. Ébouriffez la souris suffisamment pour que la trachée soit allongée pour une meilleure inhalation, mais pas trop serrée pour ne pas obstruer la respiration. Assurez-vous que le souffle de la souris est superficiel mais régulier, sans halètement.
  6. Pipetez lentement la dilution IAV dans les narines de la souris. Cela peut être fait avec succès à l’aide de l’une des deux méthodes décrites aux étapes 4.6.1 et 4.6.2.
    1. Déposez la dilution virale dans les narines goutte à goutte, en alternant entre les narines afin que le virus pénètre des deux côtés du nez.
    2. Créez une « bulle » de virus couvrant les deux narines, maintenue en pipetant régulièrement et lentement pendant que la souris inhale le liquide.
      REMARQUE : Cette étude a systématiquement utilisé la méthode d’instillation de bulles, qui était plus contrôlée et reproductible. Cette méthode permet d’administrer facilement la suspension virale dans les narines sous anesthésie et facilite la respiration naturelle. La méthode goutte à goutte est tout aussi valide, mais quelle que soit la méthode utilisée, la cohérence de la méthode doit être appliquée à toutes les expériences pour garantir moins de variabilité dans les résultats.
  7. Tenez l’embout de la pipette près du nez, mais ne touchez pas le nez. Si la souris se réveille, administrez la moitié de la dose et ramenez-la dans le cône nasal de l’isoflurane avant d’administrer la seconde moitié de la dose.
  8. Si la souris est suffisamment éveillée pour secouer la tête, tousser ou cracher le virus, une anesthésie supplémentaire est nécessaire pour éviter de provoquer un virus aérosolisé et pour assurer une bonne infection. Si la souris n’est pas réveillée, administrez la dose complète. Si la souris a été replacée sur le cône nasal, répétez l’étape 4.6 pour administrer l’IAV restant.
  9. Éjectez la pointe dans un récipient à déchets contenant de l’eau de Javel fraîche à 10 %. Utilisez une nouvelle pointe pour chaque cage de souris.
  10. Après chaque administration d’IAV, tenez la souris à la verticale pendant 1 à 2 minutes pour garder les voies respiratoires ouvertes et assurez-vous que la grippe a été correctement délivrée aux poumons. Si le virus de la grippe a réussi à être transmis aux poumons de la souris, des crépitements peuvent être ressentis en plaçant un doigt de chaque côté de la poitrine de la souris.
  11. Une fois que la souris a commencé à récupérer, remettez-la dans la cage pour qu’elle se rétablisse complètement. Les souris se rétabliront rapidement de l’isoflurane mais doivent être surveillées jusqu’à ce qu’elles soient ambulatoires.
  12. Notez des événements tels que des craquements dans la poitrine et une respiration profonde qui indiquent que l’IAV a été bien inhalé, ou des bulles et des pulvérisations nasales qui indiquent qu’une partie a été expulsée des narines de la souris. Gardez une trace de ces informations dans une feuille de calcul du journal des blessures (fichier supplémentaire 1) et un cahier de laboratoire.
  13. Répétez les étapes 4.2 à 4.12 pour chaque souris à infecter.

5. Transport de retour au laboratoire

  1. Remettez 50 ml de conique contenant de l’eau de Javel et des pointes dans la boîte de support d’échantillon en plastique, avec le reste de dilution de l’IAV (le cas échéant) et les articles de laboratoire utilisés pour l’infection grippale.
  2. Une fois de retour au laboratoire, incubez tout ce qui a été en contact avec le virus avec de l’eau de Javel à 10 %. Vaporisez les seaux à glace, les pipettes et les boîtes à pointes avec une solution d’eau de Javel à 10 % plutôt que de les immerger. Incuber à température ambiante pendant au moins 30 min. Jetez les déchets solides dans le conteneur à déchets biologiques dangereux et jetez les déchets liquides dans l’évier, en rinçant à l’eau.

6. Surveillance des souris et procédures expérimentales supplémentaires

  1. Surveiller quotidiennement après l’infection grippale l’indice de l’état corporel (NEC)17 et le poids corporel de toutes les souris témoins (PBS) et infectées par le VIA, à partir du lendemain de l’infection (jour 1) ou 3 jours après l’infection (jour 4). Il est peu probable que les souris infectées par l’IAV perdent beaucoup de poids avant le 4e jour suivant l’infection (figure 1).
    REMARQUE : Les souris qui perdent plus de 30 % de leur poids corporel ou qui atteignent un score d’état corporel de 1 doivent être euthanasiées.
  2. Si vous le souhaitez, administrer EdU à des souris par injection intrapéritonéale (i.p.) ou dans l’eau potable pour surveiller la prolifération cellulaire après une infection grippale.
    REMARQUE : De nombreux types de cellules dans le poumon de la souris prolifèrent après des dommages induits par l’IAV9. Il est possible d’administrer d’autres médicaments, des aliments spéciaux ou de l’eau spéciale à volonté à des fins expérimentales spécifiques. Gardez à l’esprit que les souris ne mangent ou ne boivent pas autant que d’habitude pendant leur rétablissement de la grippe, de sorte qu’une méthode d’administration basée sur l’injection peut être plus souhaitable ; d’autre part, il peut être difficile d’injecter des souris avec un BCS de 2-2,5.

7. Prélèvement de tissu pulmonaire pour les approches en aval

  1. Prélever du tissu pulmonaire pour des applications en aval, notamment l’analyse d’immunofluorescence, la cytométrie en flux ou le séquençage d’ARN unicellulaire dans l’installation de souris ou en laboratoire dans une enceinte de biosécurité.
  2. Euthanasiez les souris une par une avec du CO2. Ne pas luxer le col de l’utérus pour éviter de disloquer la trachée. La thoracotomie bilatérale est généralement une méthode d’euthanasie secondaire approuvée.
    REMARQUE : Cette étude suit les lignes directrices approuvées de l’établissement en matière de soins aux animaux et le protocole d’euthanasie au CO2 et a constamment utilisé cette méthode dans les études antérieures sur la grippe sans introduire de variabilité significative dans les lésions pulmonaires ou les résultats histopathologiques. La kétamine/xylazine peut également être utilisée pour euthanasier les souris afin d’éviter les dommages causés par l’inhalation de CO2 . Cependant, l’inhalation de CO2 est une méthode acceptable si l’acquisition de kétamine/xylazine est trop coûteuse ou si l’obtention d’une licence DEA est trop difficile.
  3. Disséquez la cavité thoracique et exposez la cage thoracique et la trachée.
  4. Ouvrez le diaphragme et séparez-le soigneusement de la cage thoracique afin de ne pas percer les poumons. Coupez le long des côtés de la cage thoracique et retirez la cage thoracique en haut. Coupez les clavicules et disséquez l’os et les tissus mous loin de l’avant de la trachée.
  5. Disséquez le muscle et les tissus entourant la trachée jusqu’à ce que les anneaux cartilagineux soient visibles, mais ne percez pas la trachée. À l’aide d’une pince incurvée, poussez l’œsophage vers l’extérieur de l’arrière de la trachée et disséquez-le loin de la trachée.
  6. Enfilez un morceau de suture derrière la trachée et faites un nœud de suture lâche (enroulez une extrémité autour d’une pince avec une autre, saisissez l’extrémité libre de la suture et tirez l’extrémité libre à travers les boucles).
  7. Perfuser le système circulatoire avec le D-PBS. Coupez un gros vaisseau (sous le membre antérieur ou au bas du diaphragme) et perfuser le D-PBS à travers le ventricule droit (bas du cœur, vers le haut) en poussant lentement sur l’extrémité de la seringue. Si l’aiguille n’est pas visible à travers la paroi cardiaque, elle se trouve probablement dans le ventricule gauche. Cela permet d’évacuer le sang des poumons.
    REMARQUE : Ne poussez pas les bulles. S’il y a des bulles dans la conduite, expulsez-les avant de pousser le D-PBS avec la seringue. Si la mort des cellules endothéliales est une préoccupation, il est plus doux d’utiliser la perfusion par gravité plutôt que de pousser le PBS à la main.
  8. Si vous prélevez du tissu pour l’histologie ou l’immunofluorescence seulement, passez à l’étape 7.9 ; si vous recueillez pour une suspension unicellulaire seulement, coupez tous les lobes pulmonaires et placez-les dans du PBS sur de la glace, puis passez à l’étape 7.11.
  9. Gonflage pulmonaire pour l’immunofluorescence ou l’histologie en aval :
    1. Gonflez les poumons avec du paraformaldéhyde à 2 % (PFA) et déshydratez-les à l’éthanol pour l’incorporation de la paraffine ou gonflez-les à 2 % de PFA et déshydratez-les par du saccharose pour la cryosection.
    2. Pour les techniques de détection d’ARN telles que l’ARNscope ou la réaction en chaîne d’hybridation (HCR), fixez les poumons à 4 % de PFA. Pour une meilleure fixation, gonflez les poumons dans de l’agarose à très faible point de fusion à 2 % et sectionnez immédiatement sur un microtome vibrant en PFA à 2 % ou 4 % dans une plaque de culture tissulaire pour l’immunofluorescence en aval.
  10. Gonflage pulmonaire à la main :
    1. Gonflez les poumons à la main à l’aide d’une seringue et d’une aiguille de 21 à 23 G avec ou sans tube ou en utilisant la gravité en fixant un tube de PFA sur un support annulaire à 30 cm au-dessus de la surface de la paillasse.
    2. Après avoir isolé la trachée, insérez l’aiguille dans le haut de la trachée, biseautez vers le haut, sans percer le bas de la trachée, et resserrez la suture autour de la trachée et de l’aiguille avant d’insérer le liquide.
      REMARQUE : L’utilisation d’une aiguille pointue comporte un léger risque de ponction trachéale par rapport à une aiguille à pointe émoussée, et les chercheurs doivent faire très attention pendant la procédure pour éviter tout dommage. Si une aiguille pointue perfore la trachée, une aiguille à pointe émoussée doit être utilisée.
  11. Pour créer une suspension unicellulaire pour la cytométrie en flux en aval ou l’analyse de séquençage unicellulaire, retirez le tissu pulmonaire du D-PBS et émincez le tissu pulmonaire avec des ciseaux, puis hachez avec une lame de rasoir pendant 2 à 3 minutes pour obtenir des morceaux de tissu encore plus fins.
  12. Dissocier dans un tampon de digestion contenant 480 U/mL de collagénase I, 100 μL/mL de dispase et 2 μL/mL de DNase dans du D-PBS, à 37 °C pendant 30 à 35 min. Filtrez à travers des filtres de 100 μm et 40 μm, lysez tous les globules rouges restants à l’aide d’un tampon de lyse Ammonium-Chlorure-Potassium (ACK) et remettez en suspension dans 1 % de BSA dans du PBS pour le traitement et l’analyse en aval.
    REMARQUE : Pour détecter l’infection virale et la clairance après une infection dans les poumons, il est possible d’évaluer la charge virale à l’aide d’un test qRT-PCR ou d’un test TCID50 dans les homogénats pulmonaires pour mesurer la réplication virale. La neuraminidase et la coloration de la capside peuvent également être utilisées pour détecter une infection virale. La clairance virale devrait se produire aux jours 8 et 9 suivant l’infection18,19, tandis que la réparation et la régénération du tissu pulmonaire se poursuivent pendant plusieurs semaines9.

Résultats

Par rapport aux souris non infectées traitées au PBS, les souris infectées par l’IAV présenteront des lésions tissulaires hétérogènes (Figure 1A). Les lésions tissulaires peuvent être quantifiées à l’aide d’un algorithme de clustering k-means dans MATLAB20 (Figure 1B). Les souris infectées par l’IAV commenceront à perdre du poids entre 3 et 4 jours après l’infection. À un titre idéal, les souris perdront entre 20 et 30 % de leur poids corporel initial, la perte de poids maximale se produisant 8 à 10 jours après l’infection (ppp) (figure 1C). À 11-12 dpi, les souris devraient avoir commencé à prendre du poids et devraient revenir à moins de 10-15 % de leur poids corporel initial à 14 dpi. Pour les études de régénération, il est utile que la plupart des souris de l’expérience perdent du poids et subissent des lésions tissulaires, mais ne meurent pas. Cependant, en raison de l’hétérogénéité des lésions tissulaires (figures 1A, B) et de la variabilité possible de l’administration intranasale, il est normal que plusieurs souris participant à une expérience ne perdent pas de poids ou ne subissent pas de lésions tissulaires et que plusieurs souris perdent >30 % de leur poids corporel, ce qui entraîne l’euthanasie (figure 1D). Les expériences qui tentent de déterminer une différence de survie et de perte de poids entre, par exemple, des souris avec KO d’un gène particulier et leurs témoins WT devront peut-être ajuster le titre et la dose d’IAV et devront effectuer un calcul de puissance pour déterminer la taille de l’échantillon nécessaire pour détecter une telle différence dans ces deux paramètres.

En plus des changements dans la structure globale des tissus et la santé de la souris, des changements transcriptionnels dans tous les compartiments cellulaires pulmonaires se produisent au cours de la réponse du tissu aux dommages. Cela comprend à la fois les états cellulaires transitoires qui finissent par se résoudre au fur et à mesure que le tissu est réparé, y compris les états des cellules épithéliales transitionnelles ou intermédiaires et les états des cellules immunitaires myéloïdes, et les états cellulaires persistants qui ne contribuent pas à la réparation fonctionnelle, y compris les cellules épithéliales Krt5+ et les cellules endothéliales TrkB+9. Par exemple, dans l’endothélium capillaire du poumon de souris, un état cellulaire endothélial transitoire stimulé par l’interféron se produit à 6 dpi, caractérisé par une expression élevée des gènes stimulés par l’interféron (Figure 2A). Cet état est résolu par 11-19 ppp (Figure 2A). Un état endothélial capillaire induit par une lésion (iCAP) se produit à 11 dpi, caractérisé par une expression élevée de Ntrk2 (TRKB), Sparcl1 et Bnip3 (Figure 2B). Contrairement à l’état de cellule endothéliale stimulé par l’interféron, l’état de cellule endothéliale iCAP persiste ensuite dans les régions de tissus gravement endommagés et est toujours présent un an après l’infection (Figure 2C). Les états transitoires des cellules épithéliales alvéolaires, y compris les cellules transitionnelles alvéolaires et les états épithéliales alvéolaires immatures de type I (AT1), surviennent également après l’infection (Figure 2D). Enfin, l’infection entraîne la perte de nombreux macrophages alvéolaires endogènes (aMAC_a) et leur reconstitution à partir de monocytes inflammatoires (iMON) et d’aMACs endogènes. Les macrophages alvéolaires à 1 an après l’infection ont des états transcriptionnels différents (aMAC_a et aMAC_b) selon leur origine (Figure 2E)9. Les états cellulaires transitoires et persistants qui surviennent à la suite d’une lésion pulmonaire aiguë justifient une étude plus approfondie, car leur comportement anormal dans la niche peut contribuer de manière productive ou négative à la réparation réussie des tissus et à la fonction tissulaire ultérieure. Les données de séquençage de l’ARN unicellulaire ont déjà été publiées9 et sont déposées dans le Gene Expression Omnibus sous le nom de GEO : GSE262927.

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Figure 1 : Surveillance des lésions pulmonaires et de la santé animale. (A) Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (HE) de coupes de tissu pulmonaire provenant d’un poumon faussement infecté (traité par PBS) à gauche et d’un poumon infecté par l’IAV à droite. Par rapport au poumon non blessé, le poumon infecté par l’IAV présente des lésions tissulaires hétérogènes. Barres d’échelle, 1 mm. (B) À l’aide d’un algorithme de clustering k-means dans MATLAB20, les lésions tissulaires peuvent être caractérisées comme graves (rouge), endommagées (vertes) ou normales (bleu). Il est important de noter que dans le lobe pulmonaire traité par PBS à gauche, les structures des voies respiratoires sont classées comme « sévères » en raison de la densité et de l’intensité de la coloration des cellules épithéliales des voies respiratoires. Cependant, il est encore possible de discerner facilement la différence entre les poumons traités par PBS et les poumons infectés par la grippe compte tenu de cette base de référence. Barres d’échelle, 1 mm. (C) Exemple de courbe de perte de poids tirée d’une expérience représentative d’infection par l’IAV dans laquelle des poumons de souris ont été prélevés 13 jours après l’infection (dpi). La courbe contient des données provenant de six souris de type sauvage, et les points représentent la moyenne, tandis que les barres d’erreur représentent l’erreur type de la moyenne. (D) Exemple de courbe de survie tirée d’une expérience représentative d’infection par l’IAV dans laquelle des poumons de souris ont été prélevés 14 jours après l’infection (dpi). La courbe contient des données provenant de sept souris de type sauvage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Surveillance des changements de l’état des cellules endothéliales capillaires après une infection par l’IAV. (A) Un état EC stimulé par l’interféron se produit à 6 dpi qui est résolu entre 11 et 19 dpi. La réanalyse des données publiées de séquençage de l’ARN unicellulaire provenant de poumons de souris à plusieurs moments différents après l’infection grippale montre que le score du module d’interféron dans tous les types de cellules endothéliales capillaires est le plus élevé à 6 dpi. Les données ont été réanalysées à l’aide de R, et le score du module d’interféron est basé sur l’expression de 87 gènes stimulés par l’interféron dans chaque type de cellule. CAP1, cellule endothéliale capillaire de type 1 ; iCAP, cellule endothéliale induite par une lésion ; CAP2, cellule endothéliale capillaire de type 2 ; EC, cellule endothéliale. (B) En revanche, un état EC induit par une lésion caractérisé par l’expression de Ntrk2 (TRKB) apparaît à 11 dpi et persiste jusqu’à un an après l’infection. Barre d’échelle, 500 μm. (C) Les données transcriptionnelles du séquençage de l’ARN unicellulaire des cellules endothéliales capillaires pulmonaires après une infection grippale démontrent la nature dynamique de l’état des cellules endothéliales capillaires pendant la réparation des tissus. (D) Les cellules épithéliales alvéolaires connaissent également une plasticité cellulaire après une infection grippale. Un type de cellule transitionnelle alvéolaire apparaît entre 6 et 11 dpi et est résolu à 19 dpi. Un état cellulaire AT1 immature (AT1_c) apparaît à 11 dpi et persiste jusqu’à 90 dpi. (E) Après l’infection, de nombreux macrophages alvéolaires existants (aMAC_a) sont perdus, et un afflux de monocytes inflammatoires (iMON) est observé à 6 dpi. La population de macrophages alvéolaires est reconstituée à la fois par les aMAC existants pour régénérer la population aMAC_a, et par les monocytes inflammatoires, générant la population aMAC_b. Bien que les deux représentent un état de macrophage alvéolaire, les aMAC résultants peuvent être distingués transcriptionnellement. Les graphiques (C-E) indiquent le pourcentage de cellules dans chaque population à chaque point temporel de l’ensemble de données longitudinales sur l’infection grippale et ont été générés à l’aide de R. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire 1 : Registre des blessures, registre du poids et registre de l’état corporel (NEC) pour la surveillance des animaux après une infection grippale. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Ici, nous avons rapporté une méthode pratique de transfert du virus de la grippe chez la souris pour initier des dommages rapides et efficaces aux poumons de souris et étudier les mécanismes de régénération réussie et de réparation dysplasique. Nous démontrons que l’inoculation intranasale d’A/PR/8/34 IAV peut être une technique sans stress. Il faut moins de 2 minutes par souris pour terminer l’inoculation après une anesthésie à l’isoflurane. Il s’agit d’une technique simple et non invasive d’inoculation virale qui suit la voie naturelle de l’infection et permet d’étudier la réponse des tissus et du système immunitaire d’une manière plus pertinente sur le plan physiologique. Le virus inoculé par les narines de souris peut induire à la fois une immunité muqueuse et systémique21. Plus important encore, les dommages causés par l’infection virale sont clairement visibles dans les coupes de tissu pulmonaire colorées à l’hématoxyline et à l’éosine (HE)22 (Figure 1). Une chronologie complète des changements transcriptionnels attendus dans les types de cellules pulmonaires dans chaque compartiment du poumon a déjà été publiée9. Ici, nous avons réanalysé un sous-ensemble de ces données pour démontrer que dans les compartiments endothélial, épithélial alvéolaire et immunitaire myéloïde capillaire des poumons de souris, des changements transcriptionnels transitoires et persistants se produisent au cours de la réponse à l’infection grippale chez des souris non infectées jusqu’à un an après l’infection (Figure 2).

Ce protocole comporte plusieurs étapes critiques, et un dépannage approprié de ces étapes produira une expérience réussie. Le virus de la grippe A/PR/8/34 est une souche de grippe adaptée à la souris qui n’infecte pas les humains de manière productive23, mais il est toujours important de suivre toutes les procédures de sécurité indiquées pendant l’expérience pour éviter toute possibilité d’infection du personnel de laboratoire. L’administration d’un anesthésique à l’isoflurane est une étape essentielle pour assurer le succès de l’administration du virus, car les souris n’inhalent pas bien le virus lorsqu’elles sont éveillées. Vérifiez la respiration et surveillez le mouvement de la tête de la souris pendant la procédure pour vous assurer que le virus est inoculé dans les deux narines. Si les souris ne sont pas complètement anesthésiées, des bulles peuvent être générées, ce qui limite à la fois l’inhalation du virus et génère des aérosols. Les deux résultats doivent être évités et les souris doivent être replacées sur le cône nasal d’isoflurane si des éternuements ou des bulles sont observés dans les narines. La surveillance post-infection, telle que la mesure de la perte de poids, de l’état corporel et de l’état de santé, ainsi que la fourniture d’un complément alimentaire de récupération, est également un élément important de cette expérience. Si l’on observe que les souris ne perdent pas suffisamment de poids ou n’ont pas la quantité attendue de lésions tissulaires (Figure 1), il est possible que la dose soit trop faible ; D’autre part, si de nombreuses souris atteignent le point final de perte de poids corporel de 30 %, il est possible que la dose soit trop élevée. Dans les deux cas, il est préférable de déterminer la dose appropriée à l’aide d’un titre empirique du lot de virus à l’aide d’une cohorte de souris C57BL/6, comme nous le décrivons ici.

Étant donné que l’infection grippale continue d’être répandue dans le monde entier, qu’elle provoque des maladies respiratoires graves et qu’elle peut être mortelle, il est primordial de comprendre le processus d’infectiosité virale et la réponse cellulaire à l’infection et aux lésions tissulaires dans les poumons. La méthode d’infection intranasale décrite dans cette étude pourrait donc aider à identifier des mécanismes de régulation importants et à développer de nouvelles approches thérapeutiques pour les maladies pulmonaires. De plus, les applications futures de la technique pourraient utiliser une souche différente du virus de la grippe adaptée à la souris, telle que X31, pour déterminer les effets sur la structure et la fonction du tissu pulmonaire dans le cas d’infections respiratoires répétitives. Étant donné que de nombreuses personnes sont sujettes à plusieurs infections respiratoires au cours de leur vie, une telle extension de ce modèle pourrait avoir des implications importantes pour l’étude de la régénération du tissu pulmonaire et, par conséquent, pour la santé publique.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette recherche a été soutenue par le programme de recherche intra-muros des National Institutes of Health (NIH) des États-Unis, du National Cancer Institute, du Center for Cancer Research.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1,5 mL de tube & nbsp ;Fisher Scientific02-682-557
100 & micro ; Filtre à cellules MFaucon352360
Tube conique de 15 mLFaucon352196
1x PBSGibc010010-023
40 & micro ; Filtre à cellules MFaucon352340
Tube de 5 mLGlobe6101C
Tube conique de 50 mLFaucon352098
Stock du virus de la grippe A/PR/8/34ATCC  ;VR-95PQDifférents lots ont un titer viral différent
Tampon de lyse ACKQualité biologique118-156-101
Anticorps anti-TRKBR& Systèmes DAF1494
JavelCloroxEau de Javel à 10 %
Albumine sérique bovineSigma AldrichA8022
Chambre d’induction par anesthésie CO2N’importe lequelN/A
Collagénase de type IGibco17100017
DAPIMilipore Sigma28718-90-3
DispaseCorningCB-40235
Outils de dissection : ciseaux, pinces courbes, pinces droitesN’importe lequelN/A
DnaseSigma Aldrich4716728001
D-PBSCorning21-031-CM
ÉthanolPharmco111000200
Fioles en verreDWK Sciences de la Vie986562
Seau à glaceN’importe lequelN/A
IsofluraneCovetrus29404
Aiguilles, 21 & ndash ; 23 GN’importe lequelN/A
Piquette P20/P200   ;PipetmanF144056M/F144058M,
Pointes de pipette P20/P200Thomas Scientific1159M43/1159M40
Paraformodéhyde (PFA) & nbsp ;Thermo ScientificJ19943-k22 %PFA
PipetmanN’importe lequelN/A
Cartons de congélation en plastique ou cartonN’importe lequelN/A
Lame de rasoirN’importe lequelN/A
Ring StandN’importe lequelN/A
Pipettes sérologiques, 5 mLFaucon357543
Chambre isoflurane à induction à bouche coulissante pour sourisSomni Scientific
SutureFisher ScientificNC9422522
Tubes à seringue et luer-locksN’importe lequelN/A
Seringue, 10 mLN’importe lequelN/A
Machine d’anesthésie de table IsofluraneOhmedaOhmeda Isotec-4Le débit devrait être de 2,5 et ndash ; 3%
Agarose à fusion ultra-faibleSigma AldrichA5030-1G
Pesée de la balanceOHAUSCS200

Références

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Infection intranasalecellules pith liales alv olairestats des cellules endoth lialess quen age de cellules uniquescytom trie en fluxdigestion du tissu pulmonairemarquage par immunofluorescencemacrophages alv olaires
Modélisation de la réparation dysplasique et fonctionnelle de l’alvéole pulmonaire après une infection grippale
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