Article de recherche
CD44 facilite la pathogenèse de la maladie en orchestrant les cascades inflammatoires et la différenciation ostéoclastique via l’activation de la voie PI3K/Akt. La glycitéine exerce des effets thérapeutiques sur les manifestations comorbides de l’ostéoporose (OP) + de la parodontite (MP) par l’atténuation ciblée de la signalisation médiée par CD44.
Cette étude élucide les déterminants moléculaires critiques associés à la comorbidité de l’ostéoporose (OP) et de la parodontite (MP) par le biais d’un profilage protéomique, tout en délimitant la fonction régulatrice de CD44 dans la parodontite expérimentale dans un modèle murin d’OP. La phase I a consisté à prélever des échantillons de sérum chez des patients atteints d’OP+(n = 3) et de témoins sains (n = 6) subissant des évaluations de santé de routine dans notre établissement pour une analyse protéomique comparative. Une validation translationnelle ultérieure des gènes exprimés différentiellement (DEG) et des cascades de signalisation associées a été effectuée sur des échantillons cliniques et des modèles murins OP+. Pour caractériser mécaniquement le rôle de CD44 dans la progression de la MP dans des conditions ostéoporotiques, un modèle murin d’OP a été généré par ovariectomie bilatérale, suivie d’une induction expérimentale de la MP par la mise en place d’une ligature. Les évaluations complètes comprenaient des modifications histomorphométriques par coloration à l’hématoxyline-éosine, une analyse microarchitecturale de l’os dans la région de la première molaire maxillaire à l’aide de la micro-TDM et une évaluation par immunotransfert des composants de la voie phosphoinositide-3-kinase (PI3K)/Akt. Un criblage pharmacologique en réseau parallèle couplé à des simulations d’amarrage moléculaire a été effectué pour identifier les constituants bioactifs d’Angelica sinensis ayant un potentiel thérapeutique. L’interrogation protéomique a permis d’identifier CST3, A2M, CD44, CDH13, CETP et VWF comme médiateurs pathogènes candidats dans la pathogenèse OP+. Entre nos mains, l’analyse de l’enrichissement de l’ensemble des gènes a révélé que la signalisation PI3K/Akt fonctionne comme un médiateur principal de la progression de la maladie OP+. La validation quantitative basée sur la PCR par transcription inverse a confirmé une régulation positive significative de CD44 dans les cohortes cliniques et expérimentales d’OP+. La modulation in vivo via la suppression de CD44 a significativement restauré l’intégrité du tissu parodontal, réduit l’infiltration des cellules inflammatoires et renforcé la microarchitecture osseuse alvéolaire chez les souris OP, en concomitance avec l’inhibition de la voie PI3K/Akt. La pharmacologie du réseau a révélé que la glycitéine était le principal produit phytochimique bioactif d’Angelica sinensis, le CD44 étant identifié comme sa cible moléculaire centrale. La glycitéine a amélioré la structure osseuse alvéolaire chez les souris OP+, augmentant la fraction de volume osseux (BV/TV), l’épaisseur trabéculaire (Tb.Th), la densité minérale osseuse (DMO) et réduisant le nombre trabéculaire (Tb.N), le rapport surface/volume osseux (BS/BV), indiquant une qualité osseuse plus saine, attribuée mécaniquement à l’atténuation de l’axe de signalisation CD44.
La parodontite (MP) est une maladie microbienne complexe et mixte causée par le dépôt de biofilms pathologiques dans le sillongingival 1. Il se caractérise par un déséquilibre de l’environnement microécologique qui déclenche une cascade inflammatoire pathologique au sein de l’hôte, conduisant finalement à des lésions progressives irréversibles du cément, du ligament parodontal et de l’os alvéolaire, qui sont des composants du système d’attache parodontale. Cela peut entraîner le déchaussement ou même la perte des dents2. La quantité a été normalisée à des fins de comparabilité, et les données épidémiologiques les plus récentes3 indiquent que plus de 1,066 milliard de personnes dans le monde souffrent de parodontite sévère, avec une prévalence normalisée selon l’âge d’environ 12,5 %, ce qui met en évidence des variations considérables entre les populations internationales.
L’ostéoporose (OP), une maladie osseuse systémique, se caractérise par une dégradation substantielle de la microstructure osseuse et une perte systématique de masse osseuse 4,5. Le risque de fractures est fortement augmenté par cette faiblesse structurelle, en particulier chez les personnes âgées. Notamment, les personnes âgées de 65 ans et plus au Japon avaient une prévalence plus élevée de maladie parodontale que les adultes âgés de 30 à 64 ans. Les femmes ménopausées ont une incidence plus élevée de maladies parodontales et éprouvent souvent d’autres problèmes de santé 6,7. L’étude prévoit qu’entre 2005 et 2025, la charge de morbidité augmentera de plus de 50 %, et que le coût économique devrait passer de 17 à 25 milliards de dollars. L’étude prévoit qu’entre 2005 et 2025, la charge de morbidité augmentera de plus de 50 %, et que le coût économique devrait passer de 17 à 25 milliards de dollars. Cette tendance met en évidence l’impact socio-économique important de ces maladies parodontales. De plus, chez les patientes atteintes de maladie parodontale et de gingivite, il existe une corrélation positive claire entre la durée de la maladie et sa chronicité et l’augmentation des risques pour la santé8.
Des études antérieures ont indiqué que l’OP pourrait favoriser le développement de la MP et vice versa en raison de facteurs de risque communs aux deux maladies, tels que le vieillissement, le tabagisme et un apport insuffisant en calcium et en vitamine D. Dans la population féminine ménopausée, une OP sévère pourrait être accompagnée d’une teneur réduite en minéraux mandibulaires, ce qui pourrait être associé à des niveaux déficients d’attachement parodontal9. Il a été démontré que la réduction de la densité osseuse associée aux OP pourrait accélérer la résorption osseuse alvéolaire induite par la MP, favorisant ainsi l’invasion des pathogènes parodontaux10. Parmi une gamme de problèmes de santé liés à l’âge et aux changements physiologiques, la MP et la PO sont particulièrement importantes avec l’accélération du vieillissement de la population mondiale et l’augmentation significative du nombre de femmes ménopausées. Par conséquent, il est d’une importance cruciale de clarifier les indicateurs pertinents et leurs associations pour la prévention des maladies, le traitement et l’évaluation pronostique. Motivée par ces aspects, cette étude a utilisé la protéomique pour cribler des protéines clés, en mettant l’accent sur la signalisation PI3K/Akt médiée par CD44, dans le développement d’OP+, en explorant les rôles régulateurs et les mécanismes possibles des protéines clés à l’aide d’un modèle expérimental de chez des souris OP. Dépistage plus approfondi des agents thérapeutiques ciblés présents dans Angelica sinensis, une plante médicinale traditionnelle chinoise largement utilisée en pratique clinique pour ses propriétés anti-inflammatoires et protectrices des os, et précédemment signalée pour atténuer la perte osseuse et moduler les réponses inflammatoires dans l’ostéoporose et la maladie parodontale. Guidée par la pharmacologie de réseau et l’amarrage moléculaire, la glycitéine a été identifiée comme le principal produit phytochimique bioactif et un candidat rationnel pour l’intervention OP+.
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Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux directives institutionnelles pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Le protocole de l’étude a été examiné et approuvé par le Comité d’éthique animale. Tous les efforts ont été déployés pour minimiser la souffrance animale.
Cette étude vise à évaluer le rôle de la régulation de la voie PI3K/Akt par CD44 dans la différenciation ostéoclastique et la progression inflammatoire au cours de l’ostéoporose et de la parodontite comorbides (OP+) et à déterminer si la glycitéine, un composé bioactif d’Angelica sinensis, peut moduler thérapeutiquement ces effets. La justification découle de preuves émergentes liant la surexpression de CD44 à la résorption osseuse pathologique et à la dérégulation immunitaire dans OP+11,12,13. En intégrant la protéomique, la modélisation in vivo et la pharmacologie en réseau, le protocole étudie systématiquement les mécanismes moléculaires et les interventions thérapeutiques pour atténuer la progression de la maladie14.
La taille de l’échantillon pour les expériences in vivo a été basée sur des études antérieures et une analyse de puissance, ce qui a donné n = 6 par groupe, ce qui garantit une puissance statistique adéquate pour détecter des différences significatives (P < 0,05) entre les conditions de traitement. La glycitéine a été administrée à des doses de 50 mg/kg et 100 mg/kg, en suspension dans 5 % de DMSO dans de l’huile d’olive et administrée par gavage oral quotidien. Les souris ont été surveillées pendant 8 semaines après l’induction de la MP. La mise en place de la ligature pour induire une inflammation parodontale a utilisé du fil de soie 5-0, et une ovariectomie bilatérale a été réalisée sous anesthésie sodique pentobarbital à 0,3 % (0,5 ml/100 g)15. De plus, des essais moléculaires, y compris la RT-qPCR, le western blot et l’ELISA, ont été effectués à l’aide de protocoles validés16, et les évaluations histologiques, telles que la coloration à l’hématoxyline-éosine (H&E) et au bleu de méthylène, ont suivi les chronologies et les durées de coloration établies.
Toutes les procédures expérimentales impliquant des réactifs chimiques, des agents colorants et des échantillons biologiques ont été menées conformément aux protocoles de biosécurité standard afin de minimiser les risques pour la santé. Les matières dangereuses telles que le formol, l’EDTA, le bleu de méthylène et le fuchsin acide ont été manipulées avec des équipements de protection individuelle (EPI), notamment des gants, des masques et des lunettes de sécurité. Tous les déchets, y compris les réactifs usagés et les produits jetables contaminés, ont été collectés dans des contenants désignés pour les matières contaminées et éliminés par des services d’élimination des déchets dangereux certifiés conformément aux directives de sécurité de l’établissement et de l’environnement. La figure 1 illustre l’ensemble du flux de travail expérimental.
Collecte de données cliniques
Dans notre étude, nous avons systématiquement collecté et analysé de manière exhaustive les données cliniques de base et les antécédents médicaux détaillés de trois patients atteints d’OP+et de six sujets témoins, y compris les facteurs démographiques et de style de vie, ainsi que les profils anatomiques et métastatiques. De plus, une confirmation rigoureuse du résultat du test d’infection au VPH (positif ou négatif) a été effectuée. Le stade de progression ou le schéma de récidive des lésions métastatiques a été enregistré en détail. Au cours des 7 premiers jours d’immunothérapie, les échantillons de sang des patients ont été systématiquement prélevés et standardisés, y compris des indicateurs biochimiques tels que des tests sanguins de routine. Des analyses sanguines de routine ont été effectuées en stricte conformité avec les procédures standard afin d’évaluer avec précision les paramètres clés tels que les plaquettes, les lymphocytes et les neutrophiles. L’albumine sérique a été mesurée en parallèle, et la fonction hépatique a été évaluée par une analyse quantitative de l’indice de concentration de globuline.
Patient
Évaluation de la densité minérale osseuse et stratification des participants
Nous avons effectué une comparaison systématique des mesures de densité osseuse dans la région lombaire et le col du fémur. Tous les examens ont été effectués par des radiologues expérimentés de notre service, à l’aide d’équipements de précision pour quantifier avec précision les valeurs de densité osseuse. Pour assurer un prélèvement d’échantillon standardisé, les participants devaient être à jeun pendant au moins 8 heures avant l’échantillonnage. En intégrant les données de densité osseuse aux données complètes d’évaluation parodontale, nous avons strictement classé les sujets dans le groupe de l’ostéoporose avec parodontite (OP+) ou dans le groupe témoin sain (HC), en veillant à ce que le rapport de masculinité corresponde parfaitement entre les deux groupes. L’appariement sexuel fait référence à la répartition égale des femelles entre les groupes OP+et les groupes témoins sains. Cependant, seules les participantes ont été incluses dans cette étude pour se concentrer sur l’ostéoporose postménopausique ; Il n’y avait aucun sujet masculin dans l’un ou l’autre des groupes. L’étude a adhéré aux directives éthiques de la Déclaration d’Helsinki, tous les participants signant des formulaires formels de consentement éclairé, protégeant pleinement leurs droits.
Paramètres de diagnostic
L’ostéoporose a été définie selon les directives chinoises pour le diagnostic et la prise en charge de l’ostéoporose primaire (2022)17, avec des seuils diagnostiques fixés à un score T ≤ -2,5 écarts-types (ET) pour la DMO lombaire (L1-L4) ou la DMO de la hanche. La stadification de la parodontite a suivi la classification mondiale des maladies parodontales de 201818, l’inclusion étant limitée aux cas de grade A, stades II à III. Critères d’inclusion : Femmes ménopausées âgées de 50 à 65 ans, double diagnostic d’OP et de MP répondant aux critères ci-dessus, absence de troubles auto-immuns, pas d’antécédents de néoplasmes malins, fonctions cardio-pulmonaires, hépatiques et rénales normales. Critère d’exclusion : Participation refusée du patient ou de la famille, pharmacothérapie récente (≤6 mois) pour OP ou MP.
Profilage protéomique d’échantillons de sérum
Des échantillons de sérum de trois patients OP+et de six sujets témoins ont été prélevés pour une analyse protéomique. La quantification relative des protéines a été réalisée à l’aide de procédures standard, et les protéines exprimées de manière différentielle ont été définies comme celles dont le P < 0,05 et le changement de pli > 1,519.
Analyse d’enrichissement d’ensembles de gènes (GSEA)
La GSEA a été utilisée pour identifier les principales voies de signalisation dérégulées entre les cohortes témoin et OP+. Les données transcriptomiques brutes ont d’abord été transformées à l’aide de la conversion log2 et normalisées par normalisation quantile pour supprimer les effets de lot. Des ensembles de gènes ayant plusieurs fonctions biologiques ont été examinés à partir de la base de données MSigDB (Molecular Signatures Database), et la signification statistique a été évaluée à l’aide du test non paramétrique de la somme des rangs de Wilcoxon. Les résultats de l’enrichissement ont été présentés à l’aide de scores d’enrichissement normalisés et de taux de fausses découvertes (FDR < 0,25).
Analyse pondérée des réseaux de co-expression génique (WGCNA)
WGCNA a été utilisé pour identifier les modules de gènes significativement associés aux phénotypes OP+. Une puissance à seuil souple de 12 a été sélectionnée pour obtenir une topologie de réseau sans échelle (R2 > 0,85), et l’analyse de corrélation de Pearson a été utilisée pour évaluer les relations entre les gènes propres du module et les traits cliniques. Des analyses d’enrichissement fonctionnel ont été menées pour découvrir des voies biologiques pertinentes dans des modules fortement corrélés.
Etablissement de modèles murins ostéoporotiques induits par l’ovariectomie
Cette étude a porté sur 116 souris femelles de grade SPF. Avant les expériences, les animaux ont été logés dans des conditions de température et d’humidité contrôlées pendant une phase d’adaptation de 7 jours, au cours de laquelle ils ont reçu de la nourriture standardisée pour rongeurs et de l’eau distillée. Toutes les procédures de manipulation des animaux ont strictement suivi les protocoles éthiques approuvés par le Comité d’éthique du Centre des sciences de la santé de l’Université Jiaotong de Xi’an, sous l’approbation ID 0609. L’étude a été enregistrée sous le numéro de projet [2024-054].
Protocole chirurgical de l’ovariectomie bilatérale (OVX) :
Les souris ont été anesthésiées par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique à 0,3 % (0,5 ml/100 g de poids corporel). La fourrure dorsale a été épilée chirurgicalement et les animaux ont été positionnés en position couchée dorsale sur une plate-forme chirurgicale chauffée et stérile. Après préparation aseptique à l’éthanol à 75 %, des incisions paravertébrales bilatérales (1 cm latéralement à la colonne vertébrale) ont été pratiquées au niveau des coussinets graisseux rénaux. La bourse ovarienne a été extériorisée et l’oviducte a été ligaturé à l’aide de sutures de soie 5-0, suivi d’une excision des ovaires bilatéraux, du tissu adipeux associé et des structures oviductales partielles. Les couches musculofasciales et cutanées ont été fermées séquentiellement avec des sutures résorbables 4-0. L’antisepsie postopératoire a été réalisée avec de l’éthanol à 75 %.
Contrôles de la chirurgie simulée :
Les souris opérées simulées ont subi des étapes procédurales identiques, y compris l’exposition ovarienne et la résection du tissu adipeux périovarien, sans extirpation ovarienne.
Prise en charge postopératoire :
La récupération postanesthésique a été facilitée à l’aide de coussins chauffants à eau circulante jusqu’à la marche complète. L’analgésie a été maintenue par l’administration sous-cutanée de carprofène (5 mg/kg par jour) pendant 72 heures postopératoires, complétée par de la pénicilline G prophylactique (50 000 UI/kg) pendant 48 heures pour prévenir les infections du site opératoire. La masse corporelle a été surveillée chaque semaine pendant la phase de modélisation ostéoporotique de 6 semaines, avec des critères d’exclusion appliqués aux animaux présentant une perte de poids de >20 % ou une détresse clinique.
Construction d’un modèle animal expérimental OP+
Le modèle expérimental de DP a été développé sur la base du modèle animal OP précédemment établi. Pour éviter la rupture du fil et assurer une insertion en douceur entre les molaires, une suture en soie 5-0 a été utilisée pour la ligature. Au cours de la procédure, le coin de la bouche de la souris a été doucement rétracté, et le fil a été saisi avec une pince et soigneusement placé dans la région cervicale entre la première et la deuxième molaire. Le fil et l’extrémité de la pince ont été maintenus à niveau pour minimiser le traumatisme de la muqueuse buccale, réduisant ainsi le risque d’hémorragie ou de mortalité. L’autre main tira doucement l’extrémité opposée du fil, le guidant progressivement dans l’espace interproximal entre les molaires. Une fois le fil correctement positionné, une section près de la face buccale a été serrée à l’aide d’une pince et soigneusement passée entre la deuxième et la troisième molaire en utilisant la même technique. Une traction douce vers le bas assurait un passage en douceur de la soie. Enfin, le fil a été solidement attaché autour de la deuxième molaire dans la région mi-cervicale. Les souris ont ensuite été autorisées à se rétablir.
Réaction en chaîne quantitative par polymérase par transcription inverse (RT-qPCR)
La table des matériaux répertorie des séquences d’amorces directes et inverses spécifiques pour les gènes ciblant la RT-qPCR liés à l’inflammation, à la coagulation et à l’adhésion cellulaire, notamment CD44, CDH13, VWF et GAPDH. Les séquences d’amorces utilisées pour l’analyse RT-qPCR sont résumées dans le tableau 1.
Analyse par transfert Western
Les caractéristiques d’expression des protéines clés de la voie de signalisation dans les tissus parodontaux ont été systématiquement étudiées à l’aide du western blot. Les tissus parodontaux ont été soumis à une homogénéisation par congélation-décongélation à l’aide d’un tampon RIPA, contenant des inhibiteurs de protéase et de phosphatase, afin d’extraire efficacement la protéine totale. Après une centrifugation à grande vitesse (12 000 × g, 4 °C, 10 min) pour séparer le lysat, le surnageant a été utilisé pour mesurer avec précision la concentration en protéines à l’aide d’un kit BCA, fournissant ainsi des données fiables pour les expériences ultérieures.
Pour chaque groupe expérimental, 30 μg de protéines totales ont été chargés et séparés par un système SDS-PAGE à 10 %. Les protéines résolues ont ensuite été transférées sur des membranes en PVDF à l’aide d’une méthode de transfert semi-sec. Pour minimiser les interférences de fond, les membranes ont été bloquées avec du lait en poudre écrémé à 5 % pendant h à température ambiante. Par la suite, les membranes ont été maintenues à 4 °C dans un environnement stable pour un traitement ultérieur.
Les membranes ont ensuite été incubées avec des anticorps primaires spécifiques (voir Tableau des matériaux) pendant 2 h à °C. Le lendemain, le tampon TBST a été utilisé pour un lavage en profondeur, et les membranes ont ensuite été traitées avec des anticorps secondaires conjugués à la HRP à une dilution de 1:10 000 pendant 1,5 heure à température ambiante. Toutes les étapes d’immunodétection ont été réalisées en stricte conformité avec des protocoles standardisés afin d’assurer la cohérence et la validité de l’analyse des voies de signalisation20.
En utilisant des substrats de chimiluminescence améliorée (ECL) pour capturer les signaux et un équipement d’imagerie à haute résolution pour localiser avec précision les bandes de protéines, les valeurs de densité optique des bandes ont été analysées quantitativement à l’aide du logiciel ImageJ. En fin de compte, en comparant systématiquement les niveaux d’expression relatifs des protéines cibles/β-actine dans chaque groupe avec le groupe témoin, le degré d’activation et les changements dynamiques de la voie PI3K/Akt dans le cadre de différentes interventions ont été évalués avec précision.
Dosage immuno-enzymatique (ELISA)
À l’aide de kits ELISA (voir la table des matériaux), cette étude a permis de quantifier précisément diverses cytokines inflammatoires, notamment le TNF-α, l’IL-6, l’IL-1β et l’IL-4, dans des échantillons de sérum. Il a également évalué les concentrations de TRAP5b, ALP et TGF-β en tant que marqueurs de l’activité des ostéoclastes. Une plaque de 96 puits prérecouverte d’anticorps de capture a été incubée à 25 °C avec des échantillons de sérum dilués à 1:10 dans du PBS pendant 2 h, permettant aux antigènes de se lier spécifiquement aux anticorps de capture immobilisés. Après l’incubation, les substances non liées ont été éliminées par trois lavages à l’aide de PBS-T (solution saline tamponnée au phosphate avec Tween-20). Par la suite, des anticorps de détection marqués à la biotine ont été ajoutés et incubés pendant 1 heure à la même température. Ensuite, la streptavidine-HRP a été introduite pour lier les anticorps biotinylés, et le mélange a été incubé pendant 20 minutes supplémentaires à température ambiante dans des conditions protégées de la lumière. La réaction enzymatique a ensuite été terminée à l’aide de la solution d’arrêt, et l’absorbance a été mesurée à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques pour déterminer les concentrations de cytokines.
Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E)
Des méthodes standard ont été utilisées pour effectuer la coloration H&E sur des sections de tissu parodontal incluses dans de la paraffine afin d’analyser les changements microstructurels. Le processus de préparation de l’échantillon comprenait une fixation initiale dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % pendant 24 h, suivie d’une déshydratation graduelle à l’éthanol (70 %, 80 %, 95 % et 100 %) et d’une clarification dans du xylène, et enfin d’une intégration dans de la paraffine pour produire des sections de 4 μm d’épaisseur21. Après le déparaffinage dans le xylène, les échantillons ont été réhydratés par des concentrations décroissantes d’éthanol (100 % à 70 %). Le processus de coloration a commencé par une immersion de 5 minutes dans de l’hématoxyline (Meisner), suivie d’un rinçage à l’eau courante, d’une différenciation dans de l’alcool acide à 1 % dans de l’éthanol et d’un autre rinçage. Les sections ont ensuite été colorées avec de l’éosine à 0,5 % pendant 10 s pour compléter le protocole.
Après coloration, les lames ont été déshydratées à nouveau dans une série d’éthanol gradué, clarifiées dans du xylène et scellées avec un agent de montage. Les observations ont été faites au microscope équipé d’objectifs 10x et 40x pour l’acquisition d’images à haute résolution. L’analyse histologique a évalué l’intégrité structurelle du tissu conjonctif parodontal, l’infiltration des cellules inflammatoires et la morphologie de la résorption osseuse alvéolaire. Le niveau d’inflammation a été noté à l’aide d’un indice de Loe-Silness amélioré, avec deux pathologistes en aveugle à l’identité de l’échantillon évaluant indépendamment les échantillons via une échelle semi-quantitative pour assurer l’objectivité et la reproductibilité22.
Coloration au bleu de méthylène
Cette étude a utilisé la méthode de coloration au bleu de méthylène sur des coupes osseuses alvéolaires maxillaires standardisées et traitées pour quantifier le degré de résorption osseuse. La procédure expérimentale a commencé par la fixation des tissus : les tissus parodontaux ont été fixés dans une solution de formol neutre à 10 % pendant 24 h, suivi d’un traitement de décalcification de 21 jours dans une solution d’EDTA à 10 % (pH 7,4). Après décalcification, les échantillons ont été noyés dans de la paraffine et préparés en coupes de tissu de 4 m d’épaisseur, qui ont ensuite été montées sur des lames silanisées. Le processus de prétraitement de la section comprenait le déparaffinage du xylène, l’hydratation à l’éthanol par gradient et l’incubation dans un bain-marie à 60 °C. Les lames ont ensuite été colorées avec une solution de bleu de méthylène à 0,1 % pendant 15 min.
Après la coloration, les sections ont été lavées pendant 1 minute à l’aide d’eau distillée préchauffée à 60 °C, assurant une élimination efficace de l’excès de colorant sans endommager la structure des tissus. Ils ont ensuite été contre-colorés avec de la fuchsine acide à 0,1 % pendant 5 minutes pour améliorer le contraste entre les structures tissulaires. Ce protocole de coloration a fourni une visualisation cohérente et fiable pour l’analyse quantitative de la résorption osseuse alvéolaire23. Enfin, les lames ont été déshydratées à l’aide d’éthanol classé, clarifiées dans du xylène et montées. Le tissu osseux coloré a été analysé au microscope à champ lumineux, et des images à haute résolution ont été acquises pour évaluer avec précision la résorption du bord de l’os alvéolaire en vue d’une évaluation morphologique ultérieure.
Analyse par micro-tomodensitométrie (Micro-CT)
Une micro-tomodensitométrie a été réalisée pour évaluer les changements microstructurels 3D dans l’os alvéolaire de souris modèles OP+, ciblant spécifiquement la première région molaire maxillaire. Après 8 semaines de surveillance postopératoire, les souris ont été euthanasiées sans cruauté par inhalation de CO2 , une méthode adaptée à la préservation des structures maxillo-faciales. Les spécimens maxillaires ont ensuite été récoltés et fixés dans du paraformaldéhyde à 4 % à 4 °C pendant 48 h24.
L’analyse Micro-CT a été réalisée avec les images DICOM reconstruites de la région maxillaire importées dans le logiciel en sélectionnant l’ensemble de données correspondant aux échantillons scannés. Une région d’intérêt standard (ROI) a été définie manuellement comme la partie mésiale buccale d’un tiers de la racine de la première molaire maxillaire en décrivant la structure osseuse alvéolaire sur les vues sagittale et coronale, et environ 50 coupes consécutives ont généralement été incluses pour couvrir entièrement la région.
Pour séparer l’os trabéculaire des tissus mous environnants et du fond, un seuil de densité de 180-220 mgHA/cm3 a été appliqué. Une segmentation a ensuite été effectuée pour générer une structure binaire représentant uniquement l’os trabéculaire. L’analyse morphométrique a été effectuée à l’aide du module de morphométrie osseuse du logiciel. Les paramètres ont été calculés automatiquement, notamment la fraction volumique osseuse (BV/TV), l’épaisseur trabéculaire (Tb.Th), l’nombre trabéculaire (Tb.N), le rapport surface/volume osseux (BS/BV) et la densité minérale osseuse (BMD). Suite à l’analyse, les résultats numériques ont été exportés sous forme de tableurs.
Ces mesures ont été utilisées pour évaluer l’étendue des dommages microstructuraux dans l’os alvéolaire associés à l’état pathologique OP+et pour évaluer l’efficacité thérapeutique de la glycitéine dans la restauration de la qualité osseuse. Cette approche a permis une évaluation quantitative, reproductible et à haute résolution de l’intégrité structurelle dans l’environnement osseux parodontal, offrant des informations morphologiques clés sur les résultats du traitement.
Profilage pharmacologique en réseau
Afin d’étudier systématiquement les composants bioactifs de la médecine traditionnelle chinoise (MTC) qui peuvent moduler les principales voies biologiques pertinentes pour l’ostéoporose et la parodontite comorbides (OP+), cette étude a utilisé une approche de pharmacologie en réseau pour analyser Angelica sinensis. Cette plante a été sélectionnée en raison de son utilisation historique en MTC pour la gestion des troubles osseux et de l’inflammation, y compris les symptômes associés à l’ostéoporose et aux maladies chroniques des gencives. Au cours de la phase de criblage des composés, les matières actives d’Angelica sinensis ont été extraites à l’aide des bases de données TCMSP et TCMID [les détails de la base de données ont été déplacés vers la ToM] et filtrées à l’aide des critères de biodisponibilité orale (OB) ≥ 30 % et de ressemblance au médicament (DL) ≥0,18). Les interactions composé-cible ont été prédites à l’aide de STITCH, avec validation du site cible via DisGeNET et OMIM. L’analyse de l’enrichissement des voies a été réalisée à l’aide de la plateforme DAVID 2021 afin d’identifier les voies de signalisation de KEGG potentiellement modulées par les composés sélectionnés. Pour visualiser les interactions moléculaires, un réseau « composé-cible-voie » a été construit sur la base d’indices topologiques (centralité de degré, centralité d’intermédiarité). L’analyse a identifié la glycitéine, un flavonoïde naturel, comme un composé aux propriétés pharmacocinétiques favorables et à une forte connectivité avec CD44, suggérant une pertinence thérapeutique potentielle dans l’OP+. Cependant, la glycitéine n’a pas été cliniquement approuvée pour le traitement de l’ostéoporose ou de la parodontite ; Ces résultats sont basés sur des prédictions in silico et fournissent un cadre théorique pour des expériences de validation in vivo ultérieures 25.
Validation de l’amarrage moléculaire
Les structures protéiques de CD44 (PDB ID : 1UUH) et PI3K (PDB ID : 4L23) ont été extraites de la banque de données protéiques RCSB (https://www.rcsb.org). Les structures des ligands (glycitéine, ligustilide) ont été optimisées par la minimisation de l’énergie à l’aide d’un champ de force moléculaire. Des simulations d’amarrage ont été effectuées à l’aide d’un algorithme génétique sous les paramètres suivants : 100 passages, taille de la population 150 et évaluations énergétiques 25×106 . Les poches de liaison ont été définies sur la base des coordonnées cristallographiques des ligands (CD44 : 20×20×20 Å3 ; PI3K : 25×25×25 Å3). Les poses d’amarrage résultantes ont été classées en fonction de l’énergie de liaison (ΔG, kcal/mol), et la reproductibilité a été validée à l’aide d’un seuil d’écart quadratique moyen (RMSD) de <2,0 Å.
Évaluation thérapeutique de la gycitéine dans des modèles murins OP+
La glycitéine (pureté ≥ 98 %) a été obtenue auprès d’un fournisseur biochimique certifié de qualité analytique pour les expériences in vivo est une isoflavone naturelle connue pour être présente dans Angelica sinensis, avec des propriétés anti-inflammatoires et ostéoprotectrices signalées26. La parodontite ostéoporotique a été induite chez des souris femelles C57BL/6 âgées de 11 semaines par ovariectomie bilatérale (OVX) et inflammation parodontale induite par la ligature. Les souris ont été randomisées en quatre cohortes (n = 6 par groupe) :
Simulacre : Chirurgie simulée + véhicule (5 % de diméthylsulfoxyde [DMSO] dans l’huile d’olive, gavage oral quotidien)
OP+: Modèle de la maladie + véhicule
OP++ glycitéine à faible dose (50 mg/kg) : modèle de maladie + suspension de glycitéine dans le véhicule
OP++ glycitéine à forte dose (100 mg/kg) : modèle de maladie + suspension de glycitéine dans le véhicule
Analyse statistique
Des tests statistiques inférentiels ont été effectués et des représentations visuelles des données ont été créées pour la génération de graphiques et la visualisation des données. Les comparaisons entre les groupes ont été évaluées à l±'aide de tests t bilatéraux non appariés, en considérant les valeurs avec &l 0,05 comme statistiquement significatives. Ces méthodes ont permis d’assurer la robustesse des données et d’améliorer la fiabilité des résultats d’analyse ultérieurs.
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Profilage protéomique des cohortes OP+
L’analyse protéomique quantitative du sérum de patients OP+(n=3) et de témoins sains (n=6) a identifié des protéines dérégulées impliquées dans la pathogenèse de la maladie. L’analyse comparative a révélé neuf protéines régulées à la baisse (APOL1, CST3, IGLV3-27, IGHV3-33, PF4, CLEC3B, SRGN, C6, SELL) et six protéines régulées à la hausse (IGLV9-49, A2M, VWF, CETP, CD44, CDH13) dans les sérums OP+par rapport aux témoins (Figure 2A,B...
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Cette étude propose un cadre de recherche translationnelle qui combine le profilage protéomique, la validation de l’expression génique, la modélisation animale in vivo et la pharmacologie en réseau pour explorer les mécanismes moléculaires sous-jacents à la comorbidité de l’ostéoporose et de la parodontite (OP+). L’hypothèse centrale est que CD44 module l’axe de signalisation PI3K/Akt, exacerbant ainsi la perte osseuse inflammatoire dans les conditions OP+, et que la glycitéine, un flavonoïde d’Angelica sine...
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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Cette étude a été financée par la Fondation pour la science et la technologie de l’industrie des soins de santé de la province du Gansu, en Chine (subvention n°. GSWSKY2020-77), la Fondation provinciale des sciences naturelles du Gansu (subventions n° 25JRRA314 et 21JR7RA620), le Programme provincial de talents du Gansu et le Programme de recherche sur l’incubation des jeunes de l’Hôpital provincial du Gansu (subvention n° 23GSSYF-35).
Contributions de l’auteur :
Jing Qi a mené la majorité des travaux expérimentaux et de l’analyse des données. Yunqing Pang a contribué à la collecte d’échantillons, à la conservation des données et à l’analyse statistique. Yu Wang a participé à la conception de l’expérience et a fourni un soutien technique. Dawei Hou et Jing Wang ont co-supervisé le projet, révisé de manière critique le manuscrit pour le contenu intellectuel important et approuvé la version finale. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.
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| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Kits ELISA | Biotechnologie Shanghai Enzyme Link | Quantification des cytokines inflammatoires (TNF-&alpha ;, IL-6, IL-1&beta ;, IL-4, ALP, TRAP5b, TGF-&beta ;, VWF, CD44) | |
| Kit d’extraction d’ARN | Biotechnologie Yesheng de Shanghai | Extraction de l’ARN sérique | |
| Kit de synthèse d’ADNc | Biotechnologie Yesheng de Shanghai | Transcription inverse à haute activité | |
| Kit qPCR | Biotechnologie Yesheng de Shanghai | Amplification quantitative par PCR | |
| Anticorps (primaires/secondaires) | Technologie de signalisation cellulaire / Abcam / Hangzhou Xianli Biotechnology / Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology | Anticorps primaires spécifiques ; contrôle interne de la &bêta-actine ; anticorps IgG IgG de chèvre | |
| Réactifs d’histologie | Beyotime Biotechnology / Shanghai Shangshang | Hématoxyline&ndash ; Coloration à l’éosine et au bleu de méthylène | |
| Substrat chimiluminescent | Biotechnologie Yakken | Détection par transfert Western | |
| Système Micro-CT | Scanco Medical AG (Viva CT40) | Analyse microstructurale à haute résolution | |
| Système LC-MS/MS | Thermo Scientific Q Exactive HF-X | Analyse protéomique haute résolution | |
| Logiciel : MaxQuant (v2.1.0), Andromeda | Institut Broad | Prétraitement des données protéomiques | |
| Logiciel : GSEA (v4.3.2) | Institut Broad | Analyse de l’enrichissement des voies | |
| Logiciels : R (v4.0.3), WGCNA (v1.73), pheatmap (v1.0.12) | Fondation R | Calcul statistique, analyse de réseau, clustering, cartes thermiques | |
| Logiciels : AutoDock 4.2, AutoDockTools 1.5.7 | L’Institut de recherche Scripps | Amarrage moléculaire et définition de la grille | |
| Logiciel : Open Babel 3.1.1 | Projet Open Babel | Optimisation de la structure des ligands | |
| Logiciel : PyMOL 2.5.2 | Schrö ; dinger, LLC | Visualisation de l’amarrage moléculaire |
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