Article de méthode

Modélisation de l’hypoxie/lésion par réoxygénation dans les cellules épithéliales tubulaires proximales

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DOI :

10.3791/69077

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21 novembre 2025

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1Group of Metabolism and Gene Regulation, UCAM HiTech Sport & Health Innovation Hub, Universidad Católica de Murcia, 2Department of Internal Medicine (Nephrology) and Pathology, Leiden University Medical Center

Dans cet article

Résumé

Ici, nous décrivons un protocole in vitro pour modéliser les dommages hypoxiques/réoxygénations dans les cellules épithéliales tubulaires proximales très métaboliques. Ce modèle est conçu pour induire des lésions métaboliques induites par le stress, mesurées par l’expression de marqueurs de lésions des tubules proximaux et l’évaluation de la fonction respiratoire mitochondriale.

Résumé

La transplantation rénale représente environ 60 % à 65 % de tous les organes solides transplantés. La plupart des reins de donneurs sont prélevés auprès de personnes décédées, nécessitant une conservation prolongée au froid, ce qui est un facteur connu pour de mauvais résultats de greffe. Malgré les stratégies actuelles de préservation, la lésion ischémie-reperfusion (IRI) reste une conséquence inévitable d’une interruption transitoire du flux sanguin, entraînant une privation d’oxygène et de nutriments. Au sein du néphron, les cellules épithéliales tubulaires proximales (PTEC) du segment S3 sont particulièrement sensibles à l’IRI en raison de leur forte demande métabolique et de leur dépendance à la phosphorylation oxydative mitochondriale. Au niveau moléculaire, l’IRI perturbe le métabolisme mitochondrial et réduit la production d’ATP, compromettant les besoins énergétiques des cellules épithéliales tubulaires proximales (PTEC) et favorisant l’apoptose et la nécrose. Pour étudier ces mécanismes et évaluer les stratégies thérapeutiques potentielles, des modèles in vitro robustes et reproductibles de l’IRI rénale qui reproduisent avec précision la vulnérabilité métabolique des PTEC sont essentiels. Ici, nous décrivons un protocole pour l’induction et l’évaluation des lésions hypoxies/réoxygénation (H/R) chez les PTEC im-PTEC (IM-PTEC) immortisés par la murine. Le protocole inclut des informations détaillées sur la composition du milieu et les conditions de culture nécessaires au maintien de ces cellules, suivies de l’induction des lésions H/R par des phases contrôlées d’hypoxie et de réoxygénation qui imitent étroitement les événements d’ischémie et de réperfusion dans les reins transplantés. Ce modèle offre une plateforme précieuse pour évaluer les effets de différentes interventions sur les cellules épithéliales rénales exposées à une lésion H/R. L’impact de ces traitements peut être évalué par l’analyse de l’expression des marqueurs associés aux lésions de la PT, ainsi que par l’évaluation de la fonction respiratoire mitochondriale. Ensemble, ces résultats offrent des perspectives mécanistes sur l’efficacité des composés et les processus de récupération cellulaire, soutenant le développement de thérapies ciblées pour l’IRI rénale.

Introduction

Selon l’Observatoire mondial sur le don et la transplantation, la transplantation rénale représente environ 60 % à 65 % de toutes les greffes d’organes solides dans le monde, le nombre d’interventions réalisées en 2023 étant près de trois fois supérieur à celui des greffes de foie, cette dernière étant le deuxième type le plus courant. Dans 61 % des greffes rénales réalisées cette année-là, l’organe provenait de donneursdécédés 1, ce qui implique une période de conservation plus longue que celle des donneurs vivants, où le délai d’attente est nettement pluscourt 2. Pendant cette période de préservation, les reins sont généralement préservés à l’aide d’un stockage statique à froid afin de ralentir le métabolisme cellulaire, ce qui réduit la demande en oxygène et énergie et limite ainsi les lésionsischémiques 3. Cependant, le stockage statique à froid ne fournit qu’une protection partielle, car il ne peut pas soutenir pleinement le métabolisme cellulaire ni la délivrance d’oxygène, entraînant un dysfonctionnement métabolique progressif lors de la préservation 4,5. Alternativement, la préservation normothermique ex vivo est apparue comme une stratégie viable pour maintenir l’organe à une température proche de la physiologie, soutenant ainsi le métabolisme cellulaire et l’oxygénation, et réduisant par conséquent la lésion ischémie-reperfusion (IRI)6.

Cependant, lors d’une transplantation rénale, une lésió rénale aiguë (AKI) due à l’IRI est une conséquence inévitable. L’IRI résulte de l’interruption du flux sanguin à travers l’organe, entraînant un déséquilibre entre l’offre et la demande d’oxygène et denutriments 7. Ce processus a un impact direct sur la fonction du rein transplanté, augmente le risque de rejet aigu et de diminution de la fonction du greffonà long terme 8,9.

Les PTEC — particulièrement abondants dans le cortex rénal — sont particulièrement vulnérables à l’IRI. Ces cellules constituent environ 60 % à 70 % de l’épithélium tubulaire et sont responsables de la réabsorption de la majeure partie du filtrat glomérulaire, y compris l’eau, les ions, le glucose et les acidesaminés 10. Leur activité métabolique élevée est soutenue par un vaste réseau mitochondrial pour répondre aux besoins de transport dépendants del’ATP 11. Par conséquent, ils sont extrêmement sensibles aux troubles métaboliques, tels que la privation d’oxygène et les dysfonctionnements mitochondriaux, deux caractéristiques centrales del’IRI 12.

Pendant l’IRI, la privation d’oxygène perturbe la phosphorylation oxydative mitochondriale, entraînant une déplétion de l’ATP et une fonction de réabsorptionaltérée 13,14. Cela initie un changement métabolique de l’oxydation des acides gras (FAO) vers la glycolyse anaérobie et l’activation de la voie du pentose phosphate, qui, bien que temporairement protectrice, est insuffisante pour répondre pleinement aux besoins énergétiques et redox de cescellules 15. Si la suppression de la FAO persiste pendant la phase de réparation, l’accumulationlipidique 16 et la lipotoxicité s’ensuivent17, endommageant davantage les cellules et affaiblissant leur capacitérégénérative 18. Cet état métabolique inadaptatif peut finalement entraîner une atrophie tubulaire, une mucoviscidose, et une progression vers une maladie rénalechronique 19.

Cette altération métabolique, due à un FAO défectueux, entrave la capacité à répondre aux fortes exigences énergétiques du tubulerénal 17,19. La déplétion d’ATP et l’accumulation lipidique qui en résultent favorisent la dysfonction mitochondriale et la génération d’espèces réactives de l’oxygène, qui activent la signalisation pro-inflammatoire et l’infiltrationleucocytaire 20,21,22. L’inflammation persistante et les lésions oxydatives déstabilisent l’intégrité mitochondriale, amplifiant la défaillance énergétique et déclenchant finalement la mort cellulaire apoptotiqueet nécrotique 23,24. Durant cette phase de lésion aiguë, des biomarqueurs spécifiques tels que la molécule de léssion rénale 1 (KIM-1) et la lipocaline associée à la gélatinase des neutrophiles (NGAL) sont régulés à la hausse, servant d’indicateurs sensibles des lésions tubulaires proximales et de l’AKI25 précoce.

Après une blessure aiguë, les mécanismes de réparation maladaptés favorisent un dépôt excessif de la matrice extracellulaire, une caractéristique de la fibroserénale 26. Parmi les composants de la matrice extracellulaire, le collagène, en particulier le collagène de type I (codé par le gène Col1a1), s’accumule dans l’espace interstitiel, contribuant à l’atrophie tubulaire et à la perte du parenchymefonctionnel 27. Ce remodelage fibreux est en grande partie provoqué par la sénescence tubulaire et la transition partielle épithéliale-mésenchymatose (pEMT) dans les cellules épithéliales tubulaires, conduisant finalement à un déclin fonctionnelrénal 28,29,30. L’apparition de la TEP rénale et de la fibrose favorise la progression de l’AKI à la maladie rénale chronique (MRC), aboutissant à une perte irréversible de la fonction rénale et à une survie compromise desgreffons 31,32.

Dans ce protocole, nous décrivons un modèle in vitro de lésions H/R utilisant des cellules épithéliales tubulaires proximales (IM-PTEC) immortalisées SV40 de souris, soumises à des conditions H/R contrôlées. La plupart des études précliniques sur l’IRI rénale se sont traditionnellement appuyées sur des modèles animaux, qui reproduisent les réponses vasculaires et immunitaires complexes du rein mais entraînent des coûts plus élevés, des préoccupations éthiques et une variabilité biologique nettement plusélevée 33,34. Ces limitations ont ralenti le développement de systèmes complémentaires basés sur des cellules, valides pour des études mécanistes détaillées et à haut débit. Cette configuration expérimentale permet la simulation reproductible de la privation et de la restauration d’oxygène, imitant les caractéristiques clés de l’IRI observées dans les reins transplantés. Le modèle sert d’outil précieux pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à la lésion tubulaire, à l’expression des biomarqueurs et aux réponses fibreuses dans un environnement contrôlé. De plus, elle offre une plateforme pertinente pour le dépistage et l’évaluation de stratégies thérapeutiques potentielles visant à prévenir ou atténuer les lésions ischémiques et à améliorer les résultats post-transplantation.

Protocole

Les cellules utilisées dans ce protocole n’ont pas été isolées dans le contexte de cette étude. Ils avaient été auparavant isolés et mis à disposition par d’autres chercheurs35. Par conséquent, aucune nouvelle expérimentation animale n’a été réalisée, et aucune approbation éthique n’a été requise pour les travaux présents.

1. Culture IM-PTEC

  1. Préparez le milieu L3 comme décrit dans le Tableau 1.
  2. Décongelez un flacon d’IM-PTEC. Cultivez environ 1 x 106 cellules à 33 °C dans un incubateur humidifié dans des conditions standard (5 % de CO2, O 2 atmosphérique) jusqu’à 80 % de confluence (généralement atteinte après 3 jours).
    REMARQUE : Les IM-PTEC sont isolés à partir de souris Immorto. Pour un protocole détaillé sur l’isolement des IM-PTEC, veuillez consulterla section 35.
  3. Sous-culture de cellules 2 fois par semaine avec un ratio de répartition approximatif de 1:10. Pour le passage, détachez la monocouche adhésive à l’aide de trypsine-EDTA à 0,05 % pendant 2-3 minutes à 33 °C, neutralisez avec un milieu de croissance complet, puis resemez dans des flasques de culture fraîches.
ComposantConcentration en quantité/Média final
DMEM/F12500 mL
Sérum fœtal pour veaux (FCS)10%
Pénicilline10 000 U/mL
Streptomycine10 000 μg/mL
L-glutamine0,02 μM
Insuline5 μg/mL
Transferrin5 μg/mL
Sélénite sodique5 μg/mL
Triiodothyronine40 pg/mL
Hydrocortisone36 ng/mL
Facteur de croissance épidermique20 ng/mL
Interféron γ (IFN-γ)10 ng/mL

Tableau 1 : Composition du médium L3.

2. Culture restrictive des IM-PTEC

  1. Sous-culture comme décrit à l’étape 1.3 et transférer l’ensemble de la suspension cellulaire d’un flacon T-25 d’IM-PTEC vers un flacon T-75 contenant environ 10 mL de milieu L3 sans interféron-γ (IFN-γ). Culture à 37 °C dans des conditions standards jusqu’à 80 % de confluence (généralement atteinte après 3 jours).
  2. Sous-culture comme décrit à l’étape 1.3 et transférer toute la suspension cellulaire d’un flacon T-75 en deux flasques T-175 contenant environ 20 mL de milieu L3 sans IFN-γ. Culture à 37 °C dans des conditions standards jusqu’à 80 % de confluence (généralement atteinte après 3 jours).
  3. Plaquer les IM-PTEC pour les expériences en détachant des cellules de cultures confluentes en utilisant 0,05 % de trypsine-EDTA, en les resuspendant dans un milieu complet, puis en les ensemençant à la densité souhaitée (environ 1 x 105). Utiliser des plaques à 6 puits pour l’analyse de l’expression des marqueurs moléculaires, ou des microplaques de culture cellulaire à 96 puits adaptées aux études de respiration mitochondriale.
    REMARQUE : Pour d’autres expériences, utilisez un format de culture approprié.
    1. Lorsque vous placez les cellules dans une microplaque de culture cellulaire à 96 puits pour des études de respiration mitochondriale, laissez les quatre puits aux coins vides pour les utiliser comme correction de fond. Laissez la microplaque 1 heure à température ambiante avant de la placer dans l’incubateur pour permettre aux cellules de se stabiliser.

3. Procédure d’hypoxie/réoxygénation (Figure 1)

  1. Rafraîchir les IM-PTEC en retirant le milieu de culture et en ajoutant un nouveau milieu L3 sans IFN-γ (0,1 mL/puits pour les plaques à 96 puits ou 2 mL/puits pour les plaques à 6 puits). Placez les cellules dans un incubateur hypoxique à 1 % O2, 5 % CO2, à 37 °C pendant 48 heures.
  2. Retirez les cellules de l’incubateur d’hypoxie et rafraîchissez les avec un milieu L3 sans IFN-γ. Placez les cellules dans un incubateur de culture cellulaire dans des conditions standard d’O2 et 5 % deCO2 à 37 °C pendant 24 heures.
    REMARQUE : Les conditions hypoxiques peuvent être atteintes soit à l’aide d’un incubateur d’hypoxie, soit d’une chambre modulaire d’hypoxie reliée à une alimentation gazeuse contrôlée.

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Figure 1 : Représentation schématique du modèle H/R in vitro dans des cellules épithéliales tubulaires proximales immortalisées (IM-PTECs). Les IM-PTEC dérivés de souris transgéniques H-2Kb-tsA58 (Immorto) ont été cultivés dans des conditions normoxiques, exposés à l’hypoxie (1 %O2, 48 h), puis réoxygénés (conditions standardO2, 24 h), pour une analyse de lecture. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

4. Analyse de l’expression des marqueurs moléculaires

  1. Isolation de l’ARN
    1. Ajoutez 800 μL de réactif d’isolation à ARN à chaque puits d’une plaque à 6 puits. Incubez pendant 5 minutes à température ambiante. Transférez les échantillons dans des tubes microcentrifuges de 1,5 mL sans ARNase.
    2. Ajoutez 200 μL de chloroforme et mélangez bien pendant 15 secondes en pipettant. Incubez à température ambiante pendant 2-3 minutes.
    3. Centrifugez à 12 000 x g à 4 °C pendant 12 minutes. Transférer la phase supérieure aqueuse dans un tube de microcentrifuge de 1,5 mL sans ARNase.
    4. Ajoutez 500 μL d’isopropanol. Incubez à température ambiante pendant 10 minutes. Centrifugez à 12 000 x g à 4 °C pendant 10 minutes.
    5. Jetez le surnageant et lavez la pastille avec 1 mL d’éthanol à 70 %. Centrifugez à 5 000 x g à 4 °C pendant 5 minutes. Jetez le surnageant.
    6. Faites sécher la granule à l’air libre. Dissoudez la pellete dans 12 μL d’eau sans ARNase.
    7. Chauffez l’échantillon à 56 °C pendant 15 minutes. Mesurez la concentration d’ARN dans un spectrophotomètre UV-Vis en microvolume.
      REMARQUE : Gardez toujours les échantillons sur la glace entre les étapes d’incubation pour éviter la dégradation de l’ARN.
  2. Transcription inversée
    1. Sur glace, ajoutez les composants de la réaction suivants dans un tube de microcentrifuge de 0,2 mL sans ARN : 10 μL de Master Mix (2x), 2 μL d’Enzyme Mix, 1 à 5 μg d’ARN, et jusqu’à 20 μL de H2O sans nucléase.
    2. Mélangez doucement et éclovez à 25 °C pendant 10 minutes, puis à 50-55 °C pendant 10 minutes.
    3. Désactivez la réaction en chauffant à 85 °C pendant 5 minutes et laissez refroidir sur glace. Diluez l’ADN cD à 1:5 ou 1:10.
  3. PCR quantitative en temps réel (RT-qPCR)
    1. Préparez les ensembles d’amorces en les mélangeant à une concentration finale de 10 μM (Tableau 2).
    2. Pour chaque gène à mesurer, préparez un mélange qPCR en temps réel (RT) contenant les réactifs suivants par puits : 5 μL de mélange maître RT-qPCR ; 0,4 μL d’amorce avant 10 μM, 0,4 μL d’amorce inverse 10 μM, et 2,2 μL d’H2Osans nucléase.
    3. Ajoutez 8 μL du mélange RT-qPCR à chaque puits d’une plaque PCR de 384 puits. Ajoutez 2 μL d’échantillon d’ADNc à chaque puits, en laissant une goutte au bord du puits.
    4. Après avoir ajouté tous les échantillons, tapotez doucement la plaque jusqu’à ce que toutes les gouttes tombent dans les puits. Scellez fermement la plaque avec sa membrane. Faites tourner la plaque PCR à 384 puits.
    5. Mesurez dans un système RT qPCR avec le programme suivant : 98 °C pendant 30 s, 40 cycles de 98 °C pendant 10 s suivis de 60 °C pendant 30 s, et une courbe de fusion à 95 °C.
GèneSéquences d’amorces
Kim-1F : 5' - TGGTTGCCTTTTCTCT
R : 5' - TCAGCTCGGGAATGCACAA
NgalF : 1,5 m - ATGTCACCTCCCTCCTGTCGGTCAG
R : 5' - GCCACTTGCACATTGTAGCTCTG
Acta2F : 1,5 m - GCCATCTTTCATTGGGATGGA
R : 1,5 m - CCCCTGACAGGACGTTGTTA
Col1a1F : 1,57 m - CCTCAGGGTATTGCTGGACAAC
R : 5' - CAGAAGGTTTTTTTTGCCAGG

Tableau 2 : Séquences d’amorce utilisées pour la RT-qPCR.

5. Évaluation de la fonction respiratoire mitochondriale

  1. La veille de l’analyse
    1. Allumez l’analyseur de taux de consommation d’oxygène (OCR)/taux d’acidification extracellulaire (ECAR) et laissez-le chauffer au moins 5 heures avant l’expérience.
    2. Hydratez une cartouche capteur à 37 °C dans un incubateur nonCO2 toute la nuit.
  2. Jour de l’analyse
    1. Préparer un milieu d’analyse pour une microplaque de culture cellulaire à 96 puits contenant : 33,4 mL de milieu DMEM pH 7,4 ; 0,875 mL de glucose 1 M (concentration finale 25 mM) ; 0,35 mL de pyruvate 100 mM (concentration finale 1 mM) ; et 0,35 mL de Glutamine 200 mM (concentration finale 2 mM).
    2. Préparez des solutions inhibitrices selon le tableau 3.
    3. Retirez la cartouche captrice assemblée de l’incubateur. Chargez 25 μL de chaque inhibiteur dans son port correspondant à l’aide d’une pipette multicanal et d’un guide de chargement.
    4. Retirez le milieu de culture cellulaire de la microplaque de culture cellulaire. Ajoutez 175 μL de milieu d’essai préchauffé (37 °C) à chaque puits à l’aide d’une pipette multicanal.
    5. Placez la microplaque de culture cellulaire dansun incubateur non-CO 2 à 37 °C pendant 45 à 60 minutes avant l’analyse.
    6. Placez la plaque d’étalonnage avec la cartouche capteur chargée dans l’analyseur OCR/ECAR pour étalonnage.
    7. Placez la microplaque de culture cellulaire dans l’instrument pour la mesure.
    8. Après l’exécution, conservez la microplaque de culture cellulaire pour quantifier la protéine totale afin de normaliser les données.
[Cartouche] (μM)[Médium de test] (μM)Port APort BPort C
Oligomycine121.58,4 μL
FCCP916,3 μL
Antimycine A252.517,5 μL
Roténone12.51.258,75 μL
Milieu d’essai3,5 mL3,5 mL

Tableau 3 : Solutions inhibitrices pour l’évaluation de la respiration mitochondriale.

Résultats

Une validation temporelle a d’abord été réalisée pour déterminer les conditions optimales d’hypoxie/réoxygénation (H/R) afin de reproduire une lésion ischémique chez les IM-PTEC. L’activation de la caspase-3, caractéristique de la lésion ischémie-rénale à la réperfusion tant in vivo qu’in vitro, a été utilisée comme indicateur de fidélité du modèle36,37. Nous avons constaté que 48 heures d’hypoxie suivies de 24 heures de réoxygénation ont produit la plus forte augmentation de l’activité de la caspase-3. La viabilité cellulaire, évaluée par l’essai MTT, restait comparable à celle des contrôles normoxiques dans ces conditions, indiquant que bien que la signalisation apoptotique ait été initiée, les cellules restaient viables pour des tests pharmacologiques ultérieurs (Figure supplémentaire 1). Ce protocole validé a ensuite été utilisé pour induire une lésion H/R par hypoxie/réoxygénation contrôlée des IM-PTEC.

Après l’insulte ischémique, une RT-qPCR a été réalisée pour déterminer l’expression de plusieurs marqueurs de lésions rénales (Figure 2). La RT-qPCR a montré que, dans le contexte de l’IRI, l’expression de Kim-138,39 et Ngal40,41, marqueurs connus de l’insuffisance rénale aiguë, était significativement augmentée. De plus, l’expression d’Acta2 42,43 et Col1a144,45,46, marqueurs de la pEMT/fibrose rénale, a également été augmentée. En plus d’être un marqueur rénal de pEMT/fibrose, l’expression de Col1a1 peut être corrélée à la gravité47 de la MRC. /p>

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Figure 2 : Expression moléculaire des marqueurs de lésions rénales sous normoxie ou hypoxie/réoxygénation (H/R). Après H/R, l’expression des marqueurs moléculaires de lésions rénales Kim-1, Ngal, Acta2 et Col1a1 est significativement augmentée chez les IM-PTEC. Les données sont présentées comme une erreur moyenne ± standard de la moyenne (MEB) provenant de quatre réplicés biologiques par condition. La signification statistique a été évaluée à l’aide d’un test t de Student à deux queues non apparié. Les niveaux de signification sont indiqués comme suit : p < 0,05 (*), p < 0,01 (**), p < 0,001 (***), et p < 0,0001 (****). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Des études de respiration mitochondriale ont également été réalisées pour déterminer la capacité respiratoire mitochondriale après H/R (Figure 3). Grâce à la mesure du taux de consommation d’oxygène (OCR), nous avons déterminé qu’après le défi ischémique, tous les paramètres de respiration mitochondriale (respiration basale, production d’ATP, fuite de protons, respiration maximale et capacité de réserve) étaient réduits, ce qui indiquait un métabolisme mitochondrial entravé.

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Figure 3 : OCR (taux de consommation d’oxygène) dans les IM-PTEC en conditions normoxiques ou hypoxiques. Après hypoxie/réoxygénation (H/R), les IM-PTEC présentent une diminution de la fonction respiratoire mitochondriale. La respiration mitochondriale a été évaluée en ajoutant séquentiellement des inhibiteurs de la chaîne de transport électronique : oligomycine, FCCP (cyanure de carbonyle-p-trifluorométhoxyphénylhydrazone), antimycine A et roténone. Les données sont présentées comme une erreur moyenne ± standard de la moyenne (MEB) provenant de quatre réplicés biologiques par condition. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Ces résultats confirment que le protocole H/R induit efficacement des altérations moléculaires et métaboliques compatibles avec une lésion rénale ischémique chez les IM-PTEC48,49. Ce protocole fournit donc un cadre utile pour reproduire des conditions similaires à l’ischémie rénale et à la réperfusion in vitro.

Figure supplémentaire 1. Viabilité cellulaire et activité de la caspase-3 sous des conditions de normoxie et d’hypoxie/réoxygénation (H/R). (A) Viabilité cellulaire. La viabilité cellulaire a été évaluée par test MTT après exposition à la normoxie ou à l’hypoxie/réoxygénation (H/R). Les résultats sont exprimés en viabilité relative ( %) normalisée aux témoins normoxiques. (B) Caspase fendue-3. L’activité de la caspase 3 fendue (protéine nmol/min/mg) a été quantifiée dans des cellules soumises à différentes durées de normoxie (N), d’hypoxie (H) et de reperfusion (R). Les données sont présentées en moyenne ± SEM, et chaque point représente une réplique biologique individuelle. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figurine.

Discussion

La plupart des données précliniques sur l’IRI rénale induite par l’IRI proviennent de modèles in vivo 50,51,52,53, en raison de l’absence de modèles in vitro établis. Cela, ajouté à la disponibilité limitée de lignées cellulaires tubulaires proximales muriennes bien caractérisées, restreint la recherche in vitro, faisant du développement de ce protocole un atout précieux. Cette méthode offre une plateforme plus accessible et reproductible pour étudier les mécanismes de lésions rénales H/R dans des conditions contrôlées, tout en réduisant le besoin d’utilisation animale.

De plus, ce protocole utilise principalement des équipements de laboratoire standards, facilitant sa mise en œuvre sans nécessiter d’instruments spécialisés et coûteux. La seule exception est la nécessité d’un incubateur d’hypoxie, généralement disponible dans les laboratoires de recherche sur le cancer pour recréer les microenvironnements tumorauxhypoxiques 54,55,56. Cette accessibilité favorise une adoption plus large et favorise la reproductibilité entre différents laboratoires.

Une considération cruciale dans ce protocole est la bonne culture des IM-PTEC. Les cellules doivent être cultivées à 33 °C et complétées par IFN-γ afin d’éviter la régulation à la baisse de l’activité SV40. Avant les procédures expérimentales, les IM-PTEC sont ensuite déplacés dans des conditions restrictives pendant 7 jours avant le début des expériences. La culture restrictive est obtenue en augmentant la température à 37 °C et en retirant l’interféron-gamma (IFN-γ) du milieu pendant une semaine, ce qui diminue l’expression de l’antigène T de grande taille SV40 — une protéine virale codée par le virus simien 40, utilisée pour immortaliser les cellules responsables descellules 35,57 afin de perdre leur statut d’immortalisation et favorisant un phénotype58 plus différencié et physiologiquement pertinent. Notamment, les IM-PTEC peuvent développer des vacuoles cytoplasmiques proéminentes après plusieurs jours de culture ; Si une vacuolation survient, l’hydroxycortisone doit être omise du milieu de culture pour prévenir ou inverser ce changement.

Bien que l’utilisation de PTEC immortalisés offre l’avantage de la stabilité et de la facilité d’entretien, les chercheurs peuvent également envisager d’utiliser des cellules épithéliales tubulaires primaires pour augmenter leur pertinence physiologique. Cependant, les PTEC primaires de souris présentent une plus grande variabilité donneur àdonneur 59,60 et ont une capacité prolifativelimitée 61,62, ce qui les rend moins adaptés aux expériences à haut débit ou à long terme. Leur utilisation peut être plus appropriée pour des études de validation ou pour l’étude de réponses spécifiques dérivées du patient

Ce protocole offre une plateforme précieuse pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents aux lésions H/R, identifier et évaluer des approches thérapeutiques potentielles, et explorer les réponses cellulaires telles que l’inflammation, le stress oxydatif et les voies de mort cellulaire dans un environnementcontrôlé 63,64.

Néanmoins, une limitation importante de ce modèle est qu’il ne reproduit pas certaines caractéristiques d’ischémie observées lors de la transplantation rénale, telles que l’hypothermie et la privation de nutriments lors du stockage au froid9. Ces affections influencent fortement le métabolisme cellulaire et les schémas de lésions, et leur absence peut limiter la traduction des résultats au contexte clinique65,66.

En conclusion, ce modèle H/R in vitro chez les IM-PTEC offre une approche reproductible, accessible et éthiquement favorable pour étudier la lésion ischémie-rénale par réperfusion dans des conditions contrôlées. Bien qu’il ne retranscrive pas entièrement la complexité de l’ischémie in vivo , il représente un outil complémentaire précieux pour élucider les mécanismes cellulaires, cribler les candidats thérapeutiques et réduire la dépendance à l’expérimentation animale dans la recherche sur les reins.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer avec cette œuvre

Remerciements

Mariano Marin-Blazquez fait partie du « Programa de Doctorado en Ciencias de la Santé » de l’Université catholique de Murcie (UCAM). Le travail dans les groupes Ruben Rabadan-Ros et Ruben Zapata-Perez est soutenu par une subvention du Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades - Proyectos de Generación de Conocimiento 2023 (PID2023-147560OA-I00). Ruben Rabadán-Ros est soutenu par une subvention de la Fundación Séneca - Agencia de Ciencia y Tecnología de la Región de Murcia (22524/JLI/24, Ayudas a Proyectos para la Generación de Nuevo Liderazgo Científico Jóvenes Leaders en Investigación 2024). AT est financée par une subvention NWO-FAPESP sur le vieillissement sain réalisée par Zonmw (n° 457002002) et une bourse Junior Talent de Nierstichting.

Les auteurs reconnaissent chaleureusement l’Universidad de Murcia (UM) et l’Universidad Católica de Murcia (UCAM) pour leur accès à leurs installations où les images vidéo ont été enregistrées.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaque qPCR à 384 puitsBiosystèmes appliqués4309849
CentrifugeuseOrtoalresaBiocen22R
ChloroformeVWR0757-500ML
DMEM/F12Gibco21331020
Facteur de croissance épidermiqueSigma-AldrichE9644
ÉthanolPanReac AppliChem141086.1214
FCSBiowestS181B-500
Bloc chauffantEppendorfThermoMixer C
HydrocortisoneSigma-AldrichH0135
Incubateur d’hypoxieMemmertICO 50med
IFN-& gamma ;ProspecBIoCYT-358
IncubateurMemmertICO 105
IsopropanolVWR0918-1L
ITSeGibco41400045
L-glutamineGibco25030081
Pipette multicanalEppendorf3125000052
Incubateur nonsous2
Amorces PCREurofins Génomique
Pénicilline - StreptomycineGibco15140-122
Mix maître qPCRNZYTechMB22303
Système qPCR en temps réelBiosystèmes appliquésQuantStudio 5
Mix maître à transcription inverséeNZYTechMB12502Contient un mélange enzymatique
Eau sans ARNaseHyCloneSH3053802
Kit de test de stress Mito pour cellule XF SeahorseAgilent103015-100Contient de l’oligomycine, du FCCP, de l’antimycine A et de la roténone
Seahorse XF DMEM mediumAgilent103575-100
Hippocampe XF GlucoseAgilent03577-100
Glutamine XF HippocampeAgilent103579-100
Seahorse XF PyruvateAgilent103578-100
Analyseur Seahorse XFe96AgilentS7800BR
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent103792-100Contient une microplaque de culture cellulaire XFe96 et une cartouche de capteur XFe96
Cycleur thermiqueBIO-RADCycleur thermique T100
TriiodothyronineSigma-AldrichT5516
TrizolInvitrogen15596026
Spectrophotomètre UV-VisDeNovixDS-11

Références

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