Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Isolement de l’ARN à partir de l’épithélium du cristallin oculaire de souris et de masses massives de cellules fibreuses

912 vues

⸱

DOI :

10.3791/69079

⸱

10 octobre 2025

 ,  , 
1School of Optometry and Vision Science Program, Indiana University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole détaille la séparation de l’épithélium du cristallin oculaire de la souris et de la masse en vrac des cellules fibreuses, suivie de l’isolement de l’ARN et de l’analyse qPCR. Cette méthode permet de séparer les compartiments cellulaires du cristallin pour une analyse plus détaillée du transcriptome et des processus biologiques dans les cellules épithéliales par rapport aux cellules fibreuses différenciées.

Résumé

Le cristallin est un tissu transparent spécialisé situé dans la chambre antérieure de l’œil qui est composé de deux principaux types de cellules, les cellules épithéliales et les cellules fibreuses. Une monocouche de cellules épithéliales du cristallin recouvre l’hémisphère antérieur du cristallin, tandis que la majeure partie du cristallin est composée d’une masse de cellules fibreuses du cristallin. Une membrane basale collagène, connue sous le nom de capsule, entoure et encapsule l’ensemble du tissu. Les cellules épithéliales du cristallin adhèrent fortement à la capsule du cristallin et peuvent facilement être séparées de la masse de fibres en vrac en décollant la capsule du tissu. Les difficultés à obtenir une concentration suffisante d’ARN à partir du faible nombre de cellules épithéliales dans la monocouche du cristallin ont précédemment entravé l’étude des transcriptomes des cellules épithéliales par rapport aux cellules fibreuses. Ce protocole présente une méthode pour séparer et isoler proprement les compartiments des cellules épithéliales et fibreuses et les étapes de concentration de l’ARN afin de permettre des expériences transcriptomiques ultérieures sur des échantillons de cellules épithéliales à partir d’une seule paire de lentilles de souris. La capacité d’étudier individuellement les principaux types de cellules du cristallin aide à étudier les mécanismes biologiques de maintien et de dérégulation du cristallin, permettant de caractériser les perturbations spécifiques au type de cellule responsables des pathologies du cristallin liées à l’âge.

Introduction

Le cristallin oculaire est un organe transparent qui concentre finement la lumière sur la rétine pour produire une image claire. Le cristallin est composé de deux principaux types de cellules : une monocouche de cellules épithéliales recouvrant l’hémisphère antérieur et des cellules fibreuses qui constituent la masse majeure du tissu (Figure 1). Le cristallin est enveloppé d’une membrane basale collagène connue sous le nom de capsule du cristallin, à laquelle les cellules épithéliales sont étroitement collées. Au fur et à mesure que le cristallin se développe, les cellules épithéliales de l’équateur prolifèrent et se différencient en coquilles naissantes de cellules fibreuses qui sont superposées sur le cristallin de manière concentrique 1,2,3. La croissance du cristallin tout au long de la vie dépend de la prolifération continue de cette petite population de cellules épithéliales équatoriales qui constituent la zone germinative4. Au fur et à mesure que les cellules fibreuses mûrissent, tous les organites cellulaires sont dégradés pour éliminer les objets diffusant la lumière 5,6,7,8,9,10,11 et maintenir la transparence des tissus, et les cellules fibreuses les plus internes sont finalement compactées, ce qui donne un centre de lentille rigide 9,12. En raison de la capsule de lentille qui l’entoure, il n’y a pas de renouvellement cellulaire dans le cristallin et les fibres séminales restent au centre du cristallin tout au long de la vie, car de nouvelles fibres sont ajoutées à la périphérie du tissu ou au cortex. Les cellules fibreuses du cristallin ont des propriétés optiques différentes en fonction de leur âge et peuvent fournir un instantané temporel des différentes caractéristiques biologiques à chaque stade donné13.

Malgré les options chirurgicales disponibles, la cataracte, définie comme toute opacité dans le cristallin normalement transparent, reste la principale cause de cécité dans le monde14. La cataracte peut se manifester dans l’épithélium du cristallin, le cortex ou le noyau avec des physiopathologies différentes15. Cependant, les mécanismes cellulaires et moléculaires de la formation de la cataracte restent incertains16,17. Pour mieux comprendre comment prévenir ces différents types de cataractes et développer des alternatives à la chirurgie, il faut mieux comprendre comment ces différents types de cellules maintiennent leur homéostasie dans le cristallin.

Les cellules épithéliales et fibreuses jouent différents rôles physiologiques dans le cristallin. La prolifération cellulaire, par exemple, est limitée à l’épithélium du cristallin18. Pendant ce temps, les fibres de la lentille constituent la masse en vrac de la lentille, fournissant une structure et des propriétés de réfraction à la lentille9. Pour obtenir une perspective plus nuancée des processus biologiques impliqués dans les différents compartiments du cristallin, les cellules épithéliales et fibreuses doivent être étudiées séparément. Ici, nous présentons une méthode pour isoler l’épithélium de la masse en vrac des cellules fibreuses, extraire l’ARNm de chaque fraction et analyser ces transcrits à l’aide de la réaction en chaîne par polymérase quantitative à transcription inverse (RT-qPCR).

figure-introduction-1
Figure 1 : Schéma de l’anatomie de l’objectif. Le cristallin est composé de deux types de cellules, des cellules épithéliales monocouches (bleue et orange) recouvrant l’hémisphère antérieur et une masse massive de fibres du cristallin (blanches). Le tissu est entouré d’une fine membrane de collagène, connue sous le nom de capsule de lentille (tan). Les cellules épithéliales antérieures (en bleu) sont quiescentes tandis que les cellules épithéliales équatoriales (en orange) prolifèrent, se différencient et s’allongent pour devenir de nouvelles couches de cellules fibreuses (en blanc) à la périphérie du cristallin. Les nouvelles générations de cellules fibreuses sont superposées aux générations précédentes de fibres dans des coquilles concentriques. Les cellules les plus anciennes de la fibre du cristallin sont compactées au centre du tissu. Cette figure a été modifiée de Cheng (2024)38. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément au « Guide for the Care and Use of Laboratory Animals » des National Institutes of Health et à un protocole approuvé par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de l’Indiana.

1. Zone de travail, équipement et préparation du réactif

  1. Pipeter les pointes de l’autoclave avant utilisation et désigner les boîtes des pointes autoclavées pour les expériences sur l’ARN afin d’éviter la contamination par la RNase.
  2. Traitez la surface de travail dans la hotte et les pilons d’homogénéisation des tissus avec une solution de décontamination RNase, rincez abondamment à l’eau désionisée et séchez.
  3. Faites tremper les outils de dissection (pinces courbes, pinces droites et ciseaux de microdissection) dans de l’éthanol à 70 % pendant 5 minutes et séchez-les avec une lingette délicate avant utilisation.
  4. Utilisez des plateaux de dissection et des boîtes de Pétri neufs pour les étapes de dissection et d’isolement des tissus.
  5. Aliquote 400 μL de réactif froid TRIzol acide-guanidinium-phénol dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL sans DNAse ni RNAse dans la hotte.

2. Dissection de la lentille de la souris

  1. Euthanasier des souris adultes en utilisant une surdose de CO2 suivie d’une luxation cervicale comme mesure secondaire.
  2. Énucléez les yeux à l’aide d’une pince incurvée.
    1. Enfoncez doucement le tissu entourant l’œil avec la pince, ce qui fait ressortir l’œil de l’orbite. Fermez la pince sous l’œil et retirez-la en tirant régulièrement vers le haut.
    2. Transvasez les yeux dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL avec 750-1000 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
  3. Pour la dissection, transférez les yeux dans des puits dans un plateau de dissection avec du PBS frais 1x.
  4. Sous un microscope de dissection, utilisez une pince droite pour tenir la base du nerf optique et coupez le nerf aussi près que possible de l’œil avec des ciseaux de microdissection tranchants.
  5. Insérez soigneusement une pince fine et droite dans l’ouverture où le nerf optique a été connecté et pincez pour maintenir le tissu en place.
  6. Insérez la pointe des ciseaux de microdissection dans la même ouverture et coupez soigneusement du pôle postérieur de l’œil vers la jonction cornéenne-sclérale. N’insérez pas les instruments trop profondément pour éviter d’endommager l’objectif.
    REMARQUE : La lentille de rongeur occupe un grand volume dans l’œil, et donc, des coupes peu profondes sont recommandées pour éviter de perforer la lentille.
  7. Coupez le long de la jonction cornéenne-sclérale à l’aide des ciseaux de microdissection, en séparant au moins la moitié de la circonférence de l’œil.
  8. Utilisez la pince droite pour inverser doucement les tissus oculaires tout en poussant sur la cornée, en extrudant le cristallin à travers l’incision cornéenne-sclérale.
  9. Retirez avec précaution tous les gros tissus attachés de la lentille à l’aide d’une pince fine et droite.
  10. Si nécessaire, faites rouler doucement la lentille sur une lingette propre et délicate à l’aide d’une pince incurvée pour retirer tout tissu extralenticulaire adhérent restant.
    REMARQUE : Roulez rapidement le mouchoir sur la lingette de travail et ne laissez pas le tissu sécher excessivement. Il peut y avoir de petites opacités à la surface de la lentille en raison de taches sèches sur la capsule de la lentille. Ces opacités sont généralement réversibles lorsque l’objectif est remis en PBS 1x et n’affecteront pas les étapes suivantes.
  11. Transférez l’objectif nettoyé dans une boîte de Pétri de 6 cm avec 1x PBS.
  12. À l’aide d’une pince fine et droite, percez peu profondément la capsule de lentille près de l’équateur et décollez doucement la capsule de lentille de la masse de fibres en vrac. Les cellules épithéliales du cristallin resteront attachées à la capsule. Retirez délicatement tous les gros morceaux de fibres de la capsule qui pourraient s’être détachés avec la décapsulation.
  13. Saisissez doucement la capsule à l’aide d’une pince fine et droite et faites tourbillonner le 1x PBS pour retirer toutes les fibres restantes. Toutes les cellules fibreuses faiblement attachées se dissocieront de la capsule et des cellules épithéliales.

3. Isolement de l’ARN

REMARQUE : La figure 2 présente un résumé du flux de travail pour l’isolement de l’ARN.

  1. Déposez 2 capsules de lentille ou 2 masses de fibres en vrac dans des tubes de microcentrifugation respectifs de 1,5 mL contenant 400 μL de réactif TRIzol froid.
    REMARQUE : Les masses de fibres doivent être déplacées de la parabole au tube à l’aide de pinces incurvées pour ramasser le tissu.
  2. Fermez hermétiquement et déplacez les tubes vers une hotte chimique pour les étapes suivantes.
  3. Homogénéisez doucement les masses en vrac de fibres de lentille à l’aide d’un pilon à granulés propre.
    REMARQUE : Assurez-vous de briser complètement la masse de fibres.
  4. Incuber des échantillons (capsules de lentille ou masses de fibres homogénéisées) dans TRIzol pendant 30 min à température ambiante dans la hotte.
  5. Dans la hotte, ajouter 200 μL de chloroforme pour 400 μL de réactif TRIzol dans chaque tube. Fermez bien les tubes et secouez vigoureusement à la main pendant 15 s, en gardant le pouce au fond du tube et l’index sur le bouchon.
    REMARQUE : Les tubes de microcentrifugation de 1,5 mL indiqués dans la liste des matériaux sont utilisés en raison de l’étanchéité. Si vous utilisez d’autres marques de tubes de microcentrifugation, testez la fermeture et l’étanchéité du tube avant de l’agiter, car une solution de TRIzol et de chloroforme peut s’échapper sous le capuchon des tubes qui n’ont pas un joint étanche.
  6. Incuber les échantillons pendant 10 à 15 minutes à température ambiante pour permettre la séparation des phases.
    REMARQUE : Il doit y avoir une couche rose de réactif TRIzol au bas du tube contenant des lipides et des protéines, une couche blanche entre les phases contenant de l’ADN et une phase aqueuse claire en haut contenant de l’ARN. La couche d’ADN blanche peut être plus difficile à voir dans les échantillons de cellules épithéliales.
  7. Centrifuger les échantillons à 14 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
    REMARQUE : Déplacez soigneusement les tubes dans et hors de la centrifugeuse, en prenant soin de ne pas perturber les phases de transfert.
  8. Assemblez les tubes et les réactifs à partir d’un kit de nettoyage et de concentration d’ARN. Les tubes de la colonne de centrifugation sont montés dans un tube de collecte du kit.
  9. Dans la hotte, transférez soigneusement la phase aqueuse claire (la couche supérieure) dans un tube de microcentrifugation propre de 1,5 ml, en prenant note du volume.
    REMARQUE : Évitez de déranger, de toucher ou d’aspirer la couche d’ADN blanche sous la phase aqueuse. Inclinez le tube lors du transfert de la phase aqueuse pour ne pas perturber la couche blanche. Il est préférable de laisser une petite quantité de la phase aqueuse dans le tube plutôt que de contaminer l’échantillon. En règle générale, pour 200 μL de chloroforme ajouté, 180 à 190 μL de phase aqueuse peuvent être récupérés.
  10. Ajoutez de l’éthanol à 200 degrés à la phase aqueuse dans un rapport volumétrique de 1:1.
    REMARQUE : Le tampon de liaison à l’ARN du kit de concentrateur peut être ajouté dans un rapport volumétrique de 2:1 à la phase aqueuse avant d’ajouter de l’éthanol. Cette étape est sautée pour augmenter le rendement en ARN et parce que l’ARN a une pureté suffisante après isolement.
  11. Mélangez doucement en retournant le tube plusieurs fois ou en pipetant la solution de haut en bas. Transférez la solution mélangée dans une colonne de spin d’ARN à l’aide d’un pipeteur.
    REMARQUE : Veillez à ne pas toucher le filtre avec la pointe de la pipette.
  12. Centrifugeuse : colonnes de centrifugation à 16 000 x g pendant 30 s à 4 °C.
    REMARQUE : Il est recommandé d’étiqueter le couvercle de la colonne et le côté du tube de collecte pour garder les ensembles de tubes organisés et au cas où le capuchon se briserait lors de l’étape de centrifugation suivante.
  13. Jetez le flux continu et ajoutez 400 μL de tampon de préparation d’ARN à la colonne de spin.
  14. Centrifugeuse : colonnes de centrifugation à 16 000 x g pendant 30 s à 4 °C.
  15. Jetez le flux continu et ajoutez 700 μL de tampon de lavage d’ARN dans la colonne de centrifugation.
  16. Centrifugeuse : colonnes de centrifugation à 16 000 x g pendant 30 s à 4 °C.
  17. Jetez le flux continu et ajoutez 400 μL de tampon de lavage d’ARN dans la colonne d’essorage.
  18. Centrifugeuses : colonnes de centrifugation à 16 000 x g pendant 1 min à 4 °C.
  19. Jetez à nouveau l’écoulement et centrifugez à 16 000 x g pendant 30 s à 4 °C pour vous assurer que la colonne d’essorage est sèche.
  20. Déplacez la colonne de centrifugation dans un nouveau tube de microcentrifugation étiqueté de 1,5 ml.
  21. Ajoutez 15 μL d’eau sans RNase sur le filtre à membrane. Incuber 2 min à température ambiante.
    REMARQUE : Veillez à ne pas toucher le filtre avec la pointe de la pipette.
  22. Centrifuger la colonne de spin à 16 000 x g pendant 30 s à 4 °C pour éluer l’ARN purifié.
    REMARQUE : Le capuchon du tube de microcentrifugation de 1,5 mL restera ouvert pendant la centrifugation. Placez soigneusement les colonnes de centrifugation et les tubes de microcentrifugation de manière à ce que les capuchons ouverts reposent contre le couvercle du rotor afin qu’il ne pivote pas et ne se casse pas pendant la centrifugation. Les couvercles doivent suivre le sens de rotation du rotor.
  23. Retirez et jetez les colonnes d’essorage. L’ARN sera dans le liquide recueilli dans les tubes de microcentrifugation de 1,5 mL.
  24. Fermez hermétiquement les tubes de microcentrifugation de 1,5 mL et incubez les échantillons d’ARN à 55-65 °C pendant 10 min pour favoriser la resolbilisation.
  25. Placez immédiatement les échantillons sur de la glace après l’étape de chauffage.
  26. Stockez les échantillons à -80 °C ou transcrivez-les en ADNc pour un stockage à long terme.
    REMARQUE : Les échantillons d’ARN ont été conservés jusqu’à 3 mois sans perte de concentration notable. Des échantillons d’ARN aliquote dans de plus petits volumes pour l’entreposage afin de minimiser les cycles de gel-dégel et d’empêcher la dégradation.

4. Mesure de la concentration d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis

  1. Gardez les échantillons d’ARN sur de la glace, allumez le NanoDrop (spectrophotomètre UV-Vis) et laissez l’instrument s’initialiser.
  2. Dans le menu Acides nucléiques , sélectionnez le module de quantification de l’ARN.
  3. Blanchissez le spectrophotomètre UV-Vis en pipetant 2,0 μL d’éluant à partir de l’étape de concentration d’ARN sur le piédestal, dans ce cas, de l’eau de qualité moléculaire. Abaissez le bras de l’instrument et lisez l’échantillon vierge.
  4. Soulevez le bras de l’instrument, nettoyez le socle du capteur à l’aide d’une lingette délicate propre et sèche, puis d’une autre lingette imbibée d’eau déminéralisée, puis d’une autre lingette sèche à nouveau.
  5. Si vous le souhaitez, entrez les détails de l’échantillon dans l’interface du spectrophotomètre UV-Vis.
  6. Chargez 2,0 μL de l’échantillon d’ARN sur le piédestal, abaissez le bras et quantifiez.
  7. Répétez les étapes 4.4 à 4.6 pour nettoyer le socle entre les échantillons.
  8. Une fois terminé, enregistrez et exportez l’expérience pour une quantification supplémentaire si nécessaire.

5. Transcription inverse

  1. À l’aide d’une transcriptase inverse hautement processive et thermostable, transcrire inversement 2,0 μg d’ARN de fibre de lentille et tout l’ARN épithélial extrait en utilisant le protocole recommandé par le fabricant. Mélangez les réactifs et l’ARN de chaque échantillon dans un tube PCR propre. Conservez toutes les solutions et les échantillons d’ARN sur de la glace.
    REMARQUE : Cette transcriptase peut transcrire inversement jusqu’à 2,5 μg d’ARN par réaction. Une conversion complète de l’ARN en ADNc est supposée, de sorte que la concentration initiale d’ARN est utilisée comme concentration présumée d’ADNc.
  2. Exécutez la réaction dans le thermocycleur en utilisant les conditions énumérées dans le tableau 1.
  3. Stockez l’ADNc transcrit inversement à -80 °C ou passez à l’étape qPCR.
    REMARQUE : Les échantillons d’ADNc ont été conservés jusqu’à 4 mois sans dégradation notable, car l’ADNc est plus stable que l’ARN. Les échantillons peuvent probablement être conservés plus longtemps, à condition que les cycles de gel-dégel soient réduits au minimum.
PasTempérature (°C)Temps (min)Cycles
Recuit25101
Transcription inversée50101
Inactivation enzymatique8551
Tenir4∞1

Tableau 1 : Conditions du thermocycleur pour la transcription inverse. Ces conditions sont associées à une transcriptase inverse spécifique, hautement processive et thermostable. Les conditions de fonctionnement peuvent varier en fonction de l’enzyme et du kit utilisés.

6. PCR quantitative en temps réel

  1. Avant de commencer les réactions, préparez des solutions mères d’ADNc à la concentration souhaitée en diluant avec de l’eau de qualité moléculaire. Dans ces expériences, 1 μL d’ADNc sera utilisé à 5 ng/μL pour des réactions de 5 ng/puits. Conservez toutes les solutions et les échantillons d’ADNc sur de la glace.
    REMARQUE : Les plaques TaqMan array (format 0,1 ml) sont recommandées pour s’adapter aux réactions de 5 à 50 ng d’ADNc par puits. Faire des aliquotes d’ADNc est utile pour limiter les cycles de gel-dégel. Dans cette étude, les échantillons ont été limités à un maximum de 5 cycles de gel-dégel.
  2. Préparez un master mix fonctionnel composé d’Advanced Master Mix et d’analyses des recommandations commerciales. Voir la section 7 pour un exemple de préparation. Conservez toutes les solutions et les échantillons d’ADNc sur de la glace.
    REMARQUE : Une paire de sondes avec deux colorants différents est couramment utilisée par puits. Par exemple, dans cette étude, Crygs-FAM-MGB a été utilisé comme sonde de gène d’intérêt, et Ppia-VIC-MGB comme contrôle interne. Les recommandations commerciales pour les concentrations finales de la sonde et de l’amorce sont respectivement de 250 nM et 900 nM. Si une cible est très fortement exprimée, une sonde à amorce limitée peut être nécessaire pour éviter l’épuisement des réactifs de réaction.
  3. Chargez le stock d’ADNc (1 μL) dans les puits appropriés sur la plaque qPCR, suivi du mélange maître de travail (9 μL). Mélangez les solutions en pipetant lentement de haut en bas tout en ajoutant le mélange principal. Assurez-vous que la goutte d’ADNc est mélangée à la solution et évitez les bulles.
    REMARQUE : Selon la sensibilité de la cible, la plaque peut devoir être chargée sur de la glace.
  4. Scellez la plaque qPCR en appliquant soigneusement un couvercle adhésif optique. Utilisez un applicateur de film adhésif pour lisser le couvercle et assurer une étanchéité autour de chaque puits.
  5. Plaques vortex à 1000 tr/min pendant 10 s pour mélanger.
  6. Centrifuger les plaques à 1000 x g pendant 2 min à température ambiante pour s’assurer qu’il n’y a pas de bulles d’air au fond des puits.
  7. Chargez la plaque dans un thermocycleur PCR quantitatif et exécutez-la en utilisant les cycles indiqués dans le tableau 2.
    REMARQUE : Les protocoles qPCR conventionnels sont généralement limités à 40 cycles. Il est peu probable que l’augmentation du nombre de cycles produise des résultats significatifs, car en 40 cycles, une seule copie cible peut théoriquement produire environ 1 trillion d’amplicons19.
PasTempérature (°C)Temps(s)Cycles
Inactivation de l’uracile-N-glycosylase (UNG)501201
Dénaturation951201
Dénaturation95145
Recuit6020
Tenir4∞1

Tableau 2 : Conditions du thermocycleur pour la réaction en chaîne par polymérase quantitative. Ces conditions sont adaptées à une série spécifique d’essais commerciaux d’expression génique. Les paramètres par défaut sont utilisés, à l’exception de l’augmentation des cycles d’amplification de 40 à 45.

7. Exemple de calcul de volume pour la qPCR

REMARQUE : Un code source R pour un calculateur de volume pour les équations décrites ci-dessous est disponible dans le fichier supplémentaire 1. Cette calculatrice est destinée aux sondes Taqman et au master mix répertoriés dans la table des matériaux.

  1. Déterminez le nombre de puits à pipeter et calculez un excédent minimum de 12,5 %. Cette constante excessive (kExcès) compense l’erreur de pipetage et garantit qu’il y a suffisamment de solution. Pour cet exemple, 96 puits seront utilisés comme cible pour la préparation des échantillons.
    Équation:
    figure-protocol-1
    Exemple:
    figure-protocol-2
    REMARQUE : Si l’excédent de 12,5 % n’est pas un entier, un moyen facile d’obtenir de « bons » chiffres dans les étapes suivantes est d’arrondir au puits le plus proche et d’ajuster kl’excédent en conséquence.
  2. Calculez le volume de mixage principal de travail. Dans ces expériences, 1 μL d’ADNc et 9 μL de mélange maître fonctionnel sont utilisés par puits. Les volumes d’ADNc et de mixage principal peuvent être ajustés selon les besoins.
    Équation:
    figure-protocol-3
    Exemple:
    figure-protocol-4
  3. Calculez le modificateur de concentration (kConc). Ce modificateur est utilisé pour créer un mélange principal de travail plus concentré qui se diluera à 1x lorsqu’il sera mélangé avec de l’ADNc.
    Équation:
    figure-protocol-5
    Exemple:
    figure-protocol-6
  4. Calculez le volume de la sonde (20x).
    Équation:
    figure-protocol-7
    Exemple:
    figure-protocol-8
  5. Calculer le volume du stock de mélange principal (2x).
    Équation:
    figure-protocol-9
    Exemple:
    figure-protocol-10
  6. Amenez le mélange maître de travail au volume calculé en utilisant la qualité moléculaire H2O.
    Équation:
    figure-protocol-11
    figure-protocol-12
    figure-protocol-13
    figure-protocol-14
    figure-protocol-15
    Exemple:
    figure-protocol-16
    figure-protocol-17
    figure-protocol-18
    figure-protocol-19
    figure-protocol-20

Fichier supplémentaire 1 : Un code source R pour un calculateur de volume. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

L’épithélium et les fibres du cristallin ont été isolés chez des souris de type sauvage âgées de 6 à 7 semaines. Trois souris ont été utilisées pour ces expériences, et 2 capsules de lentille ou 2 masses de cellules de fibres de chaque souris ont été regroupées pour une répétition biologique. Comme décrit dans le protocole, l’ARN a été extrait à l’aide de la séparation de phase du réactif TRIzol. En moyenne, une paire de masses en vrac d’épithélium du cristallin et de fibres a donné 0,8 μg (ET ± 0,2) et 9,7 μg (ET ± 2,3)...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Les étapes présentées ici démontrent la capacité d’isoler l’ARN à partir de compartiments de lentille séparés qui peuvent être transcrits avec succès en ADNc pour les méthodes de biologie moléculaire. En raison de la nature sensible des méthodes d’analyse, il est essentiel que le cristallin soit exempt de tissus attachés au stade de la dissection. Cela peut nécessiter quelques itérations de roulement de l’objectif sur un Kimwipe pour obtenir une propreté adéquate. Il faut veiller à ne pa...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été financé par la subvention R01 EY032056 (à CC) du National Eye Institute.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Centrifugeuse et rotorFisher Scientific14285554PM
Chloroforme, grade HPLCAlfa Aesar22920
Éthanol (190 proof)Laboratoires de décontamination2801
Éthanol (200 proof)Bioréactifs FisherRéf. BP2818
Fisherbrand Pilon à granulésFisher Scientific12-141-363
Pince incurvée ; Pince à épiler pour étudiant #7Instruments de précision mondiaux501981
pinces, droites ; Dumont #5Outils scientifiques fins11252-40
pinces, droites ; Pince à épiler d’étudiant #4Instruments de précision mondiaux501978
Kimwipes, petitKimberly-Clark34155Lingette délicate
Applicateur de film adhésif MicroAmpBiosystèmes appliqués4333183
MicroAmp EnduraPlate Plaque de réaction optique à 96 puits avec code-barresBiosystèmes appliqués4483485
MicropipettesEppendorf  ; 01-671-120
Microscope, DissectionCarl ZeissSteREO Découverte.V8
Couvercle adhésif optique MiniAmpBiosystèmes appliqués4360954
Thermocycleur MiniAmpBiosystèmes appliquésN° A37834
Mélangeur vortex à plaques MixMateEppendorf5353000529
Eau de qualité moléculaireFisher ScientificBP28191
Spectrophotomètre UV-Vis Nanodrop One MicrovolumeThermo ScientificND-ONE-W
MiniPlateaux Nunc MicroWellFisher Scientific12-565-154Plateau de dissection
PCR TubesVWR201007-012
Boîte de Pétri, 60 mm x 15 mmFisher ScientificFB0875713A
Saline tamponnée au phosphate, 1x Dulbecco’sGibco14190-136
Pointes de pipette, 10 & micro ; L GraduéScientifique américain1161-3700
Pointes de pipette, 1250 & micro ; L XL GraduéScientifique américain1161-1720
Pointes de pipette, 200 & micro ; Profil L GraduéScientifique américain1163-1700
Système de PCR en temps réel QuantStudio 3Biosystèmes appliquésRéférence A28567
Transcriptase inverse, SuperScript IV VILO  ;Invitrogen11756050Transcriptase inverse hautement processive et thermostable
Kit de nettoyage et de concentration d’ARN 5ZymoZR1013
Eau sans RNaseBioréactifs FisherBP2819
RNaseZapSigmaR2020Solution de décontamination de la RNase
SealRite Microcentrifugeuse Tubes de 1,5 mLScientifique américain1615-5500
Vannas SuperFine 8 cmInstruments de précision mondiaux501778Ciseaux
TaqMan FAST Advanced Master Mix pour qPCRBiosystèmes appliqués4444557
Sonde d’expression génique TaqMan (FAM) (MTO)ThermoFisher Scientific4448892
TRIzolInvitrogen15596026Solution acide-guanidinium-phénol
Mélangeur VortexThermo Scientific88880017

Références

  1. Lovicu, F. J., Robinson, M. L. Development of the Ocular Lens. , Cambridge University Press. (2004).
  2. Bassnett, S., Winzenburger, P. A. Morphometric analysis of fibre cell growth in the developing chicken lens. Exp Eye Res. 76 (3), 291-302 (2003).
  3. Kuszak, J. R. The ultrastructure of epithelial and fiber cells in the crystalline lens. Int Rev Cytol. 163, 305-350 (1995).
  4. Yamamoto, N., Majima, K., Marunouchi, T. A study of the proliferating activity in lens epithelium and the identification of tissue-type stem cells. Med Mol Morphol. 41 (2), 83-91 (2008).
  5. Bassnett, S. On the mechanism of organelle degradation in the vertebrate lens. Exp Eye Res. 88 (2), 133-139 (2009).
  6. Bassnett, S. The fate of the Golgi apparatus and the endoplasmic reticulum during lens fiber cell differentiation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (9), 1793-1803 (1995).
  7. Bassnett, S. Lens organelle degradation. Exp Eye Res. 74 (1), 1-6 (2002).
  8. Bassnett, S., Beebe, D. C. Coincident loss of mitochondria and nuclei during lens fiber cell differentiation. Dev Dyn. 194 (2), 85-93 (1992).
  9. Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. Biological glass: Structural determinants of eye lens transparency. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 366 (1568), 1250-1264 (2011).
  10. Vrensen, G. F., Graw, J., De Wolf, A. Nuclear breakdown during terminal differentiation of primary lens fibres in mice: A transmission electron microscopic study. Exp Eye Res. 52 (6), 647-659 (1991).
  11. Counis, M. F., et al. Analysis of nuclear degradation during lens cell differentiation. Cell Death Differ. 5 (4), 251-261 (1998).
  12. Piatigorsky, J. Lens differentiation in vertebrates. A review of cellular and molecular features. Differentiation. 19 (3), 134-153 (1981).
  13. Al-Khudari, S., Donohue, S. T., Al-Ghoul, W. M., Al-Ghoul, K. J. Age-related compaction of lens fibers affects the structure and optical properties of rabbit lenses. BMC Ophthalmol. 7, 19(2007).
  14. World Report on Vision. , World Health Organization. Geneva. (2019).
  15. Hashemi, H., et al. Global and regional prevalence of age-related cataract: A comprehensive systematic review and meta-analysis. Eye (Lond). 34 (8), 1357-1370 (2020).
  16. Cheng, C., Gong, X. Diverse roles of eph/ephrin signaling in the mouse lens. PLoS One. 6 (11), e28147(2011).
  17. Ibaraki, N. A brighter future for cataract surgery. Nat Med. 3 (9), 958-960 (1997).
  18. Scullica, L., Grimes, P., Mcelvain, N. Further autoradiographic studies of the lens epithelium. Normal and x-irradiated rat eyes. Arch Ophthalmol. 70, 659-665 (1963).
  19. Caraguel, C. G., Stryhn, H., Gagne, N., Dohoo, I. R., Hammell, K. L. Selection of a cutoff value for real-time polymerase chain reaction results to fit a diagnostic purpose: Analytical and epidemiologic approaches. J Vet Diagn Invest. 23 (1), 2-15 (2011).
  20. 60/280 and 260/230 ratios. , Thermo Scientific. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CAD/Product-Bulletins/T123-NanoDrop-Lite-Interpretation-of-Nucleic-Acid-260-280-Ratios.pdf (2009).
  21. Beyer, E. C., Kistler, J., Paul, D. L., Goodenough, D. A. Antisera directed against connexin43 peptides react with a 43-kd protein localized to gap junctions in myocardium and other tissues. J Cell Biol. 108 (2), 595-605 (1989).
  22. Gong, X., Cheng, C., Xia, C. H. Connexins in lens development and cataractogenesis. J Membr Biol. 218 (1-3), 9-12 (2007).
  23. Leonard, M., Zhang, L., Bleaken, B. M., Menko, A. S. Distinct roles for n-cadherin linked c-src and fyn kinases in lens development. Dev Dyn. 242 (5), 469-484 (2013).
  24. Leonard, M., et al. Modulation of n-cadherin junctions and their role as epicenters of differentiation-specific actin regulation in the developing lens. Dev Biol. 349 (2), 363-377 (2011).
  25. Logan, C. M., et al. N-cadherin regulates signaling mechanisms required for lens fiber cell elongation and lens morphogenesis. Dev Biol. 428 (1), 118-134 (2017).
  26. Maddala, R., Nagendran, T., Lang, R. A., Morozov, A., Rao, P. V. Rap1 gtpase is required for mouse lens epithelial maintenance and morphogenesis. Dev Biol. 406 (1), 74-91 (2015).
  27. Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Front Cell Dev Biol. 10, 983178(2022).
  28. Paul, D. L., Ebihara, L., Takemoto, L. J., Swenson, K. I., Goodenough, D. A. Connexin46, a novel lens gap junction protein, induces voltage-gated currents in nonjunctional plasma membrane of xenopus oocytes. J Cell Biol. 115 (4), 1077-1089 (1991).
  29. Rong, P., et al. Disruption of gja8 (alpha8 connexin) in mice leads to microphthalmia associated with retardation of lens growth and lens fiber maturation. Development. 129 (1), 167-174 (2002).
  30. Terrell, A. M., et al. Molecular characterization of mouse lens epithelial cell lines and their suitability to study RNA granules and cataract associated genes. Exp Eye Res. 131, 42-55 (2015).
  31. White, T. W., Bruzzone, R., Goodenough, D. A., Paul, D. L. Mouse cx50, a functional member of the connexin family of gap junction proteins, is the lens fiber protein mp70. Molecular Biology of the Cell. 3 (7), 711-720 (1992).
  32. Xia, C. H., et al. Altered cell clusters and upregulated Aqp1 in connexin 50 knockout lens epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (11), 27(2024).
  33. Beyer, E. C., Paul, D. L., Goodenough, D. A. Connexin43: A protein from rat heart homologous to a gap junction protein from liver. J Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2621-2629 (1987).
  34. Gong, X., et al. Disruption of Alpha3 connexin gene leads to proteolysis and cataractogenesis in mice. Cell. 91 (6), 833-843 (1997).
  35. Xu, L., Overbeek, P. A., Reneker, L. W. Systematic analysis of E-, N- and P-cadherin expression in mouse eye development. Exp Eye Res. 74 (6), 753-760 (2002).
  36. Nishina, S., et al. Pax6 expression in the developing human eye. Br J Ophthalmol. 83 (6), 723-727 (1999).
  37. Wistow, G., et al. Gamman-crystallin and the evolution of the betagamma-crystallin superfamily in vertebrates. FEBS J. 272 (9), 2276-2291 (2005).
  38. Cheng, C. Tissue, cellular, and molecular level determinants for eye lens stiffness and elasticity. Front Ophthalmol (Lausanne). 4, 1456474(2024).
  39. Huynh, P. N., Cheng, C. Spatial-temporal comparison of eph/ephrin gene expression in ocular lenses from aging and knockout mice. Front Ophthalmol (Lausanne). 4, 1410860(2024).
  40. Zelenka, P. S., Gao, C. Y., Saravanamuthu, S. S. Preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation. J Vis Exp. (31), e1519(2009).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Masse cellulaire des fibrescristallin de souriscellules pith liales du cristallincellules fibreuses du cristallinmicrodissectionpurification par colonne de centrifugationexpression g nique diff rentielleexpression de la connexine
Isolement de l’ARN à partir de l’épithélium du cristallin oculaire de souris et de masses massives de cellules fibreuses
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.