Cette étude présente une méthode pour évaluer la fonction de PAK5 dans l’ESCC, montrant que sa surexpression prédit un mauvais pronostic et favorise la progression tumorale via l’axe de signalisation PAK5-GAREM1.
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Article de recherche
Cette étude présente une méthode pour évaluer la fonction de PAK5 dans l’ESCC, montrant que sa surexpression prédit un mauvais pronostic et favorise la progression tumorale via l’axe de signalisation PAK5-GAREM1.
Le carcinome épidermoïde œsophagien (ESCC) est une cause majeure de mortalité liée au cancer à l’échelle mondiale, en particulier en Asie. En raison de l’absence de symptômes précoces, la plupart des patients sont diagnostiqués à des stades avancés, ce qui limite l’efficacité du traitement et détériore le pronostic. Comprendre les mécanismes sous-jacents à l’ESCC et identifier les biomarqueurs ou cibles thérapeutiques sont essentiels pour améliorer les résultats des patients. La protéine kinase 5 activée par P21 (PAK5), membre de la famille des protéiniques kinases activées par les mitogènes, a été impliquée dans diverses malignités en régulant le cycle cellulaire, la migration et l’invasion. Cependant, son rôle dans l’ESCC reste incertain. Cette étude a évalué l’expression de PAK5 dans les tissus ESCC et les tissus normaux adjacents à l’aide d’immunohistochimie et a réalisé une analyse de survie de Kaplan-Meier pour évaluer l’association entre PAK5 et le pronostic. Des modèles cellulaires ESCC avec surexpression et knockdown de PAK5 ont été établis, et des tests fonctionnels, incluant CCK-8, formation de colonies et tests Transwell, ont été réalisés. De plus, le séquençage de l’ARNm a été effectué pour identifier les cibles en aval et les voies de signalisation régulées par PAK5. Ces résultats ont montré que l’expression de PAK5 était significativement élevée dans les tissus ESCC par rapport aux tissus normaux et était associée à un pronostic défavorable. Les analyses fonctionnelles ont révélé que PAK5 favorisait la prolifération cellulaire ESCC, la formation de colonies, la migration et l’invasion, tandis que l’analyse transcriptomique a mis en avant GAREM1 comme un effecteur clé en aval. Ces résultats indiquent que PAK5 contribue à la progression des CCES et pourrait servir de biomarqueur pronostique et de cible thérapeutique.
À l’échelle mondiale, le cancer de l’œsophage figure parmi les cancers les plus mortels. En Chine, le carcinome épidermoïde œsophagien (CCE) représente le sous-type histologique prédominant. Bien que des avancées thérapeutiques aient été réalisées, le pronostic pour les patients ESCC reste sombre, se manifestant par un taux de survie à 5 ans de seulement 10 % à 25% 1. Cela est en grande partie dû aux défis de la détection précoce et à la disponibilité limitée de thérapies moléculairesefficaces 2. Contrairement à d’autres tumeurs solides où les thérapies ciblées ont montré un potentiel significatif, ces approches en ESCC en sont encore à leurs débuts, entravées par une rareté de cibles moléculaires exploitables.
PAK5, un PAK de groupe II, intègre la dynamique cytosquelettique et la signalisation pro-survie et a été associé à la chimiorésistance dans plusieurs cancers 3,4,5,6,7,8,9,10,11. Étant donné le rôle important de la signalisation MAPK dans la biologie ESCC et la réponsethérapeutique 1,2,12, il a été émis l’hypothèse que PAK5 est surrégulé dans l’ESCC et favorise des phénotypes malins par la modulation de la signalisation MAPK, impliquant potentiellement GAREM1 comme adaptateur/régulateur 13,14,15,16. L’IHC quantitatif, la perturbation génétique fonctionnelle et le profilage transcriptomique ont été utilisés pour tester cette hypothèse.
La prise en charge de l’ECCC implique généralement une combinaison d’œsophagectomie, de chimiothérapie et de radiothérapie. Bien que l’œsophagectomie puisse être curative, elle présente un risque élevé demorbidité 4,8. De plus, la chimiothérapie et la radiothérapie ne parviennent souvent pas à éliminer toutes les cellules cancéreuses, entraînant résistance, récidive etmétastases 8,9. L’immunothérapie est récemment devenue un axe majeur en oncologie, démontrant son efficacité dans le traitement des cancers avancés. Cet intérêt croissant met en lumière le besoin pressant de nouveaux biomarqueurs pouvant aider au diagnostic précoce et à la planification du traitement pour l’ESCC. Des études antérieures ont montré que d’autres membres de la famille PAK, tels que PAK1 et PAK4, favorisent la prolifération, l’invasion et la résistance à la thérapie dans l’ESCC, soulignant l’importance de cette famille de kinases dans la biologie des ESCC. Cependant, le rôle de PAK5, un PAK de groupe II moins étudié, reste mal défini, ce qui motive l’étudeactuelle 17,18.
La kinase 5 activée par P21 (PAK5), membre de la sous-famille PAK II, a été identifiée pour la première fois comme kinase spécifique au cerveau en 2002. Situé sur le chromosome 20p12, PAK5 code pour une protéine d’environ 80 kDa et se trouve principalement dans les mitochondries et le noyau, où il joue divers rôles dans la régulation cellulaire 10,11,13. Ses fonctions dans les mitochondries incluent le métabolisme et la régulation de l’énergie, tandis que sa présence nucléaire est liée à la transcription génique et au contrôle du cycle cellulaire. Bien que PAK5 soit moins étudié que ses homologues, il est considéré comme crucial pour le neurodéveloppement, la survie cellulaire et la progression ducancer 10. Notamment, PAK5 a été impliqué dans la régulation du cytosquelette, les mécanismes anti-apoptotiques et la proliférationcellulaire 12. Sa régulation à la hausse dans les cellules néoplasiques a été liée à une résistance émergente aux médicaments, ce qui résonne avec les résultats associant la surexpression de PAK5 à une résistance accrue des cellules tumorales àla chimiothérapie 10,11,13,14. Pourtant, la fonction précise du PAK5 dans la progression de l’ESCC reste insaisissable. Cette étude explore l’influence de PAK5 sur le milieu transcriptomique de l’ESCC et ses implications fonctionnelles. Un profilage transcriptomique a été réalisé pour identifier les altérations de l’expression génique associées à l’activité de PAK5 dans les cellules ESCC. De plus, un modèle cellulaire ESCC avec modulation contrôlée PAK5 a été généré pour élucider son rôle dans la croissance tumorale et le potentiel métastatique. Contrairement aux stratégies conventionnelles de découverte de biomarqueurs dans l’ESCC qui reposent principalement sur le Western blotting ou les mesures de transcripts monomodalité, le flux de travail actuel intègre l’immunohistochimie quantitative, le profilage transcriptomique et les tests fonctionnels. Cette approche combinée permet une validation moléculaire et phénotypique simultanée, fournissant une vision mécaniste tout en améliorant la pertinence biologique. De plus, le protocole met l’accent sur la reproductibilité expérimentale, en utilisant des échantillons jumelés de tumeurs et de tissus adjacents, des procédures standardisées d’immunocoloration et des entrées d’ARN de haute qualité (nombre d’intégrité ARN ≥ 7) pour le séquençage. Ces caractéristiques renforcent la robustesse et l’applicabilité des tests dans les laboratoires, en particulier pour les études cherchant à définir des réseaux régulateurs cliniquement significatifs pilotés par les kinases dans l’ESCC.
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Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique du Second Hôpital affilié de l’Université Médicale de Hainan (Approbation n° LW2022602), et le consentement éclairé a été obtenu de chaque participant conformément à la Déclaration d’Helsinki. Les réactifs et l’équipement utilisés dans cette étude sont listés dans le tableau des matériaux.
1. Collecte d’échantillons de patients et de tissus
Un total de 40 patients avec une CCE pathologiquement confirmée ont été inscrits, tous avec une fonction hépatique et rénale normale avant l’opération. Des échantillons tumoraux (groupe T) et des tissus normaux adjacents (groupe N ; ≥2 cm du bord tumoral) ont été prélevés immédiatement après une résection chirurgicale. Les tissus ont été fixés dans du paraformoldéhyde (PFA) à 4 % dans du PBS à température ambiante pendant 7 jours avant l’implantation de la paraffine.
2. Coloration immunohistochimique
Les blocs incrustés de paraffine étaient sectionnés à 5 μm et cuits à 60 °C pendant 1 heure. Les sections ont été déparaffinées avec un substitut de xylène, réhydratées par de l’éthanol gradué, puis soumises à une récupération antigénique dans un tampon de citrate de sodium de 10 mM (pH 6,0) à 95-98 °C pendant 20 minutes. L’activité de la peroxydase endogène a été éteinte avec du peroxyde d’hydrogène à 3 % pendant 10 minutes, suivie d’un blocage avec un sérum normal à 5 % pendant 30 minutes à température ambiante. Les sections ont été incubées toute la nuit (12-16 h) à 4 °C avec l’anticorps primaire anti-PAK5 (dilution 1:100, voir Tableau des matériaux). Après les lavages au PBS, les lames ont été incubées avec un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort pendant 30 minutes à température ambiante, développées avec du DAB jusqu’à l’apparition de la couleur (1 à 5 minutes, surveillées au microscope pour éviter une surcoloration), puis contre-colorées à l’hématoxyline pendant 30 à 60 secondes. Les coupes ont été déshydratées, montées et imagées au microscope en champ clair. L’intensité de coloration et la proportion de cellules positives ont été quantifiées à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image avec au moins cinq champs aléatoires par section (200× grossissement). La méthode de quantification a adopté le calcul du score H, avec la formule : H-score = ∑ (intensité de coloration × pourcentage de cellules positives) (intensité notée comme 0 = négative, 1 = faible, 2 = modérée, 3 = forte ; pourcentage catégorisé comme 0-25 %, 26-50 %, 51-75 %, 76-100 %). Pour garantir la fiabilité, deux pathologistes indépendants ont effectué un score à l’aveugle, avec un accord inter-observateurs κ valeur ≥ 0,75. Les critères de contrôle qualité ont été strictement appliqués : les contrôles positifs (tissu ESCC PAK5 connu comme positifs) et les témoins négatifs (anticorps primaires remplacés par le PBS) doivent passer la validation ; l’intensité de coloration de fond doit être inférieure à un seuil prédéfini (par exemple, H-score < 50) ; le coefficient de variation (CV) des résultats de coloration entre les lots en double doit être de <20 % pour exclure la variabilité expérimentale.
3. Lignées cellulaires et culture
Les cellules KYSE-150 (ESCC humaine) et HEK-293 (emballage viral) ont été authentifiées par profilage en tandem court (STR) et ont été confirmées exemptes de mycoplasme. Les cellules KYSE-150 ont été cultivées dans un milieu RPMI-1640 complété avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine (100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine). Les cellules HEK-293 ont été maintenues en DMEM complétées par les mêmes additifs. Les cellules ont été subcultivées à 0,25 % de trypsine-EDTA lorsqu’elles atteignaient 70 % à 80 % de confluence, et ont été ensemencées à des densités appropriées 24 heures avant chaque expérience.
4. Construction et infection du vecteur lentiviral
Les vecteurs lentiviraux ont été conçus pour surexprimer soit PAK5 (pLV-EF1α-PAK5-PGK-Puro), soit pour faire taire PAK5 (pLV-U6-shRNA-PAK5-PGK-Puro). Les cellules HEK-293 ont été ensemencées dans des plats de 10 cm et transfectées à 70 %-80 % de confluence avec le plasmide de transfert, les plasmides d’emballage (gag/pol et rev) et le plasmide d’enveloppe (VSV-G) à un ratio 4:3:1 à l’aide d’un réactif de transfection à base de lipides, avec une quantité totale d’ADN de ~20 μg par plat de 10 cm. Le substrat a été remplacé 6 à 8 heures après la transfection. Les surnatants viraux ont été collectés à 48 h et 72 h, centrifugés à 500 × g pendant 10 minutes pour éliminer les débris, filtrés à travers un filtre de 0,45 μm, puis concentrés ou stockés à −80 °C. Pour la transduction, les cellules KYSE-150 ont été ensemencées un jour avant l’infection et exposées à un surnageant viral à une multiplicité d’infections (MOI) de 5 à 10 en présence de 8 μg/mL de polybrene. Le MOI a été défini comme le ratio des unités infectieuses par rapport au nombre de cellules cibles. Une pré-expérience a été menée pour estimer le MOI en utilisant le comptage GFP ou qPCR, et un MOI de 5 à 10 a été sélectionné. Le milieu a été remplacé après 12-16 heures, et une courbe de mort de puromycine a été établie en traitant les cellules non transduites avec des concentrations de puromycine allant de 0 à 4 μg/mL pendant 72 à 96 heures afin de déterminer la concentration létale minimale. La concentration sélectionnée pour la sélection était de 1-2 μg/mL, et la concentration de maintien était de 0,5 à 1 μg/mL. Les cellules ont été sélectionnées avec de la puromycine (1-2 μg/mL) à partir de 48 heures plus tard. La surexpression ou le silence de PAK5 a été vérifié par RT-qPCR à l’aide d’amorces spécifiques pour PAK5 (5′-CCAAAGCCTATGGTGGGACCC-3′, 5′-AGGCCGTTGATGGAGGTTTC-3′) et GAPDH (5′-GTGGACATCCCCGCAAGAC-3′, 5′-AAAGGGTGTTAACGCAACTA-3′). L’expression relative de PAK5 a été calculée à l’aide de la méthode 2−ΔΔCt . Toutes les expériences ont été réalisées avec au moins trois répliques biologiques.
5. Essai de viabilité des cellules CCK-8
La viabilité cellulaire a été évaluée à l’aide du Kit de Comptage Cellulaire-8 (CCK-8), basé sur la réduction du réactif WST-8 par des déshydrogénases cellulaires. Des cellules KYSE-150 à croissance logarithmique ont été ensemencées à 2 000 cellules par puits dans des plaques de 96 puits dans un milieu complet de 100 μL. À 0 h, 24 h, 48 h, 72 h et 96 h, 10 μL de réactif CCK-8 (contenant WST-8) étaient ajoutés à chaque puits. Après incubation à 37 °C pendant 2 heures, l’absorption à 450 nm (A450) a été mesurée avec un lecteur de microplaques. Des puits vierges contenant uniquement un milieu étaient inclus. Chaque groupe expérimental contenait au moins trois répliques biologiques, et chaque mesure était effectuée avec cinq répliques techniques.
6. Essai de formation de la colonie
Les suspensions monocellules de KYSE-150 ont été ensemencées à 1 000 cellules par puits dans des plaques à 6 puits et cultivées pendant 14 jours, avec un remplacement du milieu tous les 2-3 jours. Les colonies ont été fixées avec 4 % de PFA pendant 15 minutes, colorées à 0,1 % de violet cristallin dans 20 % de méthanol pendant 15 minutes, rincées à l’eau, puis séchées à l’air. Les colonies contenant plus de 50 cellules ont été comptées à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image, et le taux de formation des colonies a été calculé.
7. Essai d’invasion de Transwell
Les inserts avec des pores de 8 μm ont été pré-recouverts d’une matrice membranaire basale (50 μL par insert, dilution 1:8) et incubés à 37 °C pendant 1 h ; Le contrôle qualité a été effectué avant la sémination des cellules : des inserts vierges (sans cellules) et des inserts témoins négatifs (sans chimioattractant) ont été installés pour vérifier la validité du test, et l’uniformité de la couche de matrice membranaire basale a été confirmée par inspection visuelle (ou mesure de poids pour un contrôle plus strict). Les cellules ont été privées de sérum dans un milieu FBS à 1 % pendant 6 à 12 heures, et 2 × cellules 10⁵ par mL (200 μL par insert) ont été ensemencées dans la chambre supérieure. La chambre inférieure contenait 600 μL de milieu avec 20 % de FBS comme chimioattrant. Après 24 heures d’incubation, les cellules non envahies de la surface supérieure ont été retirées, et celles envahies sur la surface inférieure ont été fixées au méthanol pendant 10 minutes et colorées à 0,1 % de violet cristallin pendant 15 minutes. Les cellules colorées ont été imagées au microscope en champ clair et comptabilisées dans au moins cinq champs microscopiques aléatoires par insert (200× grossissement) ; Le comptage a été réalisé à l’aveugle (le personnel comptage n’était pas au courant des affectations de groupe) afin d’éviter les biais subjectifs.
8. Détection cytométrique en flux de l’apoptose
Les cellules ont été prélevées (y compris les cellules flottantes), lavées deux fois avec PBS, puis remises en suspension dans un tampon de liaison à 1 × 106 cellules/mL. Annexine V-FITC (5 μL) et iodure de propidium (5 μL) ont été ajoutés à 100 μL de la suspension, suivis d’une incubation à température ambiante pendant 15 minutes dans l’obscurité ; après incubation, un tampon de liaison de 400 μL a été ajouté à chaque échantillon. Avant l’analyse cytométrique en flux, l’ajustement de compensation était effectué à l’aide de témoins à coloration unique (cellules Annexin V-FITC à une seule coloration et cellules à une seule coloration PI) afin d’éliminer le débordement de fluorescence, et la grille FSC/SSC était réglée pour sélectionner des cellules uniques (excluant les débris cellulaires et les agrégats). Les échantillons ont été analysés en moins d’une heure sur un cytomètre à flux équipé d’un laser de 488 nm, avec au moins 10 000 événements par échantillon. Les indices apoptotiques ont été quantifiés à l’aide d’un logiciel d’analyse de cytométrie en flux : un seuil de filtrage uniforme a été appliqué sur tous les échantillons afin d’assurer la cohérence, et les proportions des cellules apoptotiques précoces (Annexin V⁺/PI⁻) et des cellules apoptotiques tardives (Annexin V⁺/PI⁺) ont été rapportées séparément pour caractériser le profil apoptotique de chaque groupe.
9. Séquençage de l’ARN et analyse bioinformatique
L’ARN total a été extrait et évalué pour sa pureté (A260/280 entre 1,8 et 2,1) et son intégrité (RIN ≥7 comme seuil de contrôle qualité). L’ARNm a été purifié à l’aide de billes d’oligo(dT), fragmenté à 94 °C pendant 5 à 7 minutes, puis retranscrit en ADNc. Les bibliothèques étaient préparées par réparation de terminale, ligation d’adaptateur et amplification PCR (8 à 12 cycles), puis séquencées sur une plateforme Illumina pour générer des lectures en binaire de 150 pb à une profondeur de 30 à 50 millions de paires de lectures par échantillon. Les lectures étaient découpées et alignées sur le génome de référence humain à l’aide de STAR ou HISAT2. Les décomptes de gènes ont été obtenus avec featureCounts, et une analyse différentielle de l’expression a été réalisée avec DESeq2, appliquant des seuils de FDR < 0,05 et |log2 multiplie change| ≥ 1. L’analyse d’enrichissement fonctionnel des gènes différenciellement exprimés a été réalisée à l’aide de clusterProfiler pour l’ontologie génique et les voies KEGG (avec la correction de FDR < par Benjamini-Hochberg (BH) à 0,05), et des réseaux d’interactions protéine-protéine ont été construits à l’aide de la base de données STRING.
10. Analyse statistique
Les données continues ont été exprimées en moyenne ± de la DS provenant d’au moins trois expériences indépendantes. Des comparaisons entre deux groupes ont été réalisées avec des tests t non appariés à deux queues, et des comparaisons entre trois groupes ou plus ont été réalisées avec l’ANOVA unidirectionnelle suivie du test post-hoc de Tukey. Des tests non paramétriques ont été appliqués lorsque cela était approprié. Les distributions de survie ont été estimées par analyse de Kaplan-Meier avec des tests log-rank. Pour les données RNA-seq, la correction par tests multiples a été réalisée en utilisant la méthode de Benjamini-Hochberg. Les valeurs p exactes sont indiquées dans des légendes de figures ; La signification statistique a été prise en compte à p < 0,05, avec * indiquant p < 0,05 et **indiquant p < 0,01.
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PAK5 est fortement exprimé dans l’ESCC et est associé à un pronostic néfaste
La Figure 1 illustre le flux de travail global, de la validation clinique de PAK5 à l’analyse fonctionnelle et transcriptomique, qui identifie GAREM1 comme cible en aval. Pour tester l’hypothèse selon laquelle PAK5 favorise la progression de l’ESCC en modulant la voie MAPK via GAREM1, les schémas d’expression de PAK5 dans les tissus ESCC et leur associa...
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Cette étude propose un examen approfondi du rôle de PAK5 dans la progression du carcinome épidermoïde œsophagien (ECC) en combinant échantillons cliniques, tests fonctionnels et analyses transcriptomiques. Ces résultats élargissent la compréhension de l’implication de PAK5 dans l’ESCC, mettant en lumière son potentiel à la fois comme marqueur pronostique et comme cible thérapeutique.
La surexpression marquée de PAK5 dans les tissus ESCC et son association avec...
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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrent ni relations personnelles qui auraient pu sembler influencer le travail rapporté dans cet article.
Ce travail a été soutenu par la Fondation des sciences naturelles provinciale de Hainan de Chine (Subvention n° 822QN474).
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| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Kit de détection d’apoptose Annexin V-FITC | Beyotime Biotechnology | C1062S | Kit de coloration pour détection d’apoptose |
| Anticorps anti-PAK5 | Abcam | ab110069 | Anticorps primaire pour l’IHC, dilution 1:100 |
| Système automatisé d’électrophorèse | Agilent | Bioanalyseur 2100 | Évaluation de l’intégrité de l’ARN |
| Kit de synthèse cDNA | Invitrogen | 1896649 | Kit de transcription inversée |
| Solution violette cristalline | Sigma-Aldrich | C3886 | Colorant pour colonies et invasion |
| Médium DMEM | Gibco (Thermo Fisher) | 11965092 | Milieu de culture cellulaire |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | Gibco (Thermo Fisher) | 16000044 | Supplément de culture cellulaire |
| Cytomètre en débit | BD Biosciences | FACSCanto II | Instrument d’analyse cellulaire |
| GraphPad Prism | Logiciel GraphPad | Version 8 | Logiciels d’analyse statistique et de graphiques |
| H& Kit de coloration E | Solarbio | G1120 | Solution de coloration à l’hématoxyline et à l’éosine |
| IgG anti-Rat conjugué HRP | Abcam | ab150165 | Anticorps secondaire pour l’IHC |
| Séquenceur Illumina NovaSeq | Illumina | NovaSeq 6000 | Plateforme de séquençage à haut débit |
| Lignée cellulaire KYSE-150 | Banque de cellules RIKEN | RCB2057 | Lignée cellulaire du carcinome épidermoïde œsophagien humain |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher | L3000008 | Réactif de transfection |
| Lecteur de microplaques | Bio-Tek Instruments | ELx808 | Instrument de mesure d’absorbance |
| DynabeadTM Oligo(dT)25s | Thermo Fisher Scientific | 61005 | Pour la purification de l’ARNm |
| Pénicilline-Streptomycine | Gibco (Thermo Fisher) | 15140122 | Antibiotiques pour la culture cellulaire |
| Iodure de propidium (PI) | Sigma-Aldrich | P4864 | Colorant ADN |
| RPMI-1640 Moyen | Gibco (Thermo Fisher) | 11875093 | Milieu de culture cellulaire |
| Spectrophotomètre | Thermo Fisher | NanoDrop ND-1000 | Mesure de la concentration et de la pureté de l’ARN |
| Logiciel SPSS | IBM | Version 23 | Logiciels d’analyse statistique |
| Inserts Transwell | Corning | 3422 | Inserts d’assay d’invasion cellulaire |
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