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Génération d’organoïdes cutanés planaires poilus dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme à l’aide d’un système de culture à interface air-liquide

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DOI :

10.3791/69088

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17 octobre 2025

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1Department of Anatomy and Embryology, Leiden University Medical Center, 2The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), Leiden University Medical Center, 3CEA, Inserm, IRIG, UA13 BGE, Biomics, University of Grenoble Alpes

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une méthode de production d’organoïdes cutanés contenant des follicules pileux à partir de cellules souches pluripotentes humaines induites à l’aide d’un système de culture planaire et physiologiquement pertinent à l’interface air-liquide pour reproduire l’architecture et la fonction de la peau.

Résumé

Les organoïdes cutanés (SO) contenant des follicules pileux dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) fournissent un modèle in vitro sophistiqué pour étudier les interactions intercellulaires au sein du microenvironnement cutané. Initialement développés dans une configuration kystique inversée, où le derme est exposé à l’environnement et l’épiderme tourné vers l’intérieur vers le centre organoïde, les SO peuvent ensuite être transférés vers une configuration plane dans un système de culture d’interface air-liquide (ALI), qui ressemble davantage à la physiologie de la peau humaine. Ce manuscrit présente un protocole complet pour générer et sélectionner des SO kystiques qui peuvent être disséqués en SO planaires et développés davantage dans un système de culture ALI. Le protocole comprend des points de contrôle définis pour l’évaluation qualitative macroscopique aux stades critiques du développement des organoïdes, détaille les étapes techniques requises pour aplatir les SO kystiques en peau plane, spécifie les conditions optimales pour la culture de l’ALI et démontre les résultats par l’analyse moléculaire. Au jour 27, la coloration par immunofluorescence avec des marqueurs spécifiques de la lignée a révélé un épithélium pigmenté pluristratifié avec des appendices cutanés, y compris des follicules pileux et des structures semblables à des glandes sébacées. Ce protocole fournit une méthode robuste pour générer des SO planaires avec des appendices, offrant un modèle in vitro physiologiquement pertinent. Ce système prend en charge diverses applications dans la recherche sur la peau et a déjà été utilisé avec succès pour modéliser l’infection par des agents pathogènes, les lésions tissulaires induites par les rayons ultraviolets et les réponses aux médicaments.

Introduction

La peau forme une barrière protectrice cruciale entre les organismes et leur environnement, tout en régulant la température corporelle, l’équilibre hydrique et les informations sensorielles. Il est composé de trois couches principales : l’épiderme, un épithélium kératinocytaire stratifié à surface cornée ; le derme, un tissu conjonctif riche en matrice extracellulaire, en fibroblastes, en nerfs, en vaisseaux sanguins et en cellules immunitaires ; et l’hypoderme, qui est principalement constitué d’adipocytes sous-cutanés. La fonction de la peau humaine dépend également d’appendices spécialisés tels que les follicules pileux (HF), les glandes sébacées et les glandes sudoripares1.

Les affections cutanées sont parmi les affections médicales les plus courantes dans le monde 2,3. Historiquement, la plupart des études axées sur la peau ont été menées à l’aide de modèles animaux4, qui reproduisent la complexité physiologique de l’organe dans un contexte systémique. Cependant, d’importantes différences inter-espèces4, ainsi que des préoccupations éthiques croissantes, ont conduit au développement de modèles de peau humaine physiologiquement pertinents.

Les modèles conventionnels de peau humaine se divisent en deux catégories : l’épiderme humain reconstruit, qui se compose de kératinocytes stratifiés, et la peau humaine reconstruite, qui intègre en outre un compartiment dermique sous-jacent composé de fibroblastes intégrés dans une matrice de collagène5. Bien que les deux types de modèles aient considérablement fait progresser notre compréhension de la physiologie de la peau, ils n’ont pas la fidélité architecturale et la diversité cellulaire de la peau humaine native. L’une des principales limites de ces modèles est l’absence d’appendices cutanés tels que les HF, ce qui les rend inadaptés à la recherche et aux tests de médicaments liés aux troubles cutanés impliquant la croissance et la régénération des cheveux6. Bien que des systèmes plus avancés intégrant des HF aient été signalés, ils ne parviennent pas à récapituler pleinement la complexité de la structure et du microenvironnement HF ou s’appuient sur des technologies complexes telles que la bio-impression ou le micromoulage 7,8,9,10.

Un nouveau modèle de peau qui répond à plusieurs de ces défis est l’organoïde cutané (SO), généré à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSCs)11. Mimant le développement embryonnaire, les hiPSC peuvent être dirigées vers les lignées d’ectoderme de surface crânienne et de crête neurale crânienne, s’auto-organisant en structures kystiques qui ressemblent étroitement à la peau humaine. Ces OS contiennent presque tous les types de cellules cutanées non immunitaires, organisées en un épiderme stratifié et un derme riche en matrice extracellulaire. Il est important de noter que les SO favorisent le développement des appendices cutanés : les HF et les glandes sébacées. Compte tenu de l’évolutivité pratiquement illimitée des hiPSC, les OS permettent un génie génétique sophistiqué et le développement de nouveaux outils fonctionnels. En tant que tels, les OS représentent une avancée majeure dans le domaine et sont prometteurs pour des applications en biologie du développement, en modélisation des maladies, en tests de médicaments et en médecine régénérative.

Cependant, une limitation considérable subsiste : les SOs forment des structures kystiques inversées dans lesquelles l’épiderme est situé à l’intérieur du kyste dermique, à l’abri des forces mécaniques et immergé dans un milieu aqueux. Cette configuration est non seulement physiologiquement imprécise, mais empêche également l’établissement d’une interface air-liquide (ALI). Par conséquent, les SOs kystiques ont une application limitée pour les études impliquant la barrière épidermique, les forces mécaniques ou les traitements apicaux directs. Pour résoudre ce problème, une méthode reproductible pour aplatir mécaniquement les SO kystiques et ensuite les cultiver sous forme de peau plane dans une condition ALI est présentée ci-dessous. Cette approche, initialement rapportée par Jung et al., réorganise l’architecture tissulaire de sorte que l’épiderme apical est exposé à l’air, favorisant ainsi une stratification supplémentaire et une fonction barrière12. Les organoïdes planaires et pileux qui en résultent conservent l’architecture complexe de la peau humaine tout en reflétant une orientation tissulaire physiologiquement précise, permettant un accès expérimental à la surface apicale. Bien que la procédure soit longue (~100 jours) et implique des étapes techniquement difficiles, en particulier lors de la dissection de SO kystiques en SO planaires, elle peut être particulièrement intéressante pour les chercheurs qui travaillent déjà avec des SO ou d’autres équivalents de la peau humaine qui souhaitent augmenter la pertinence physiologique de leurs systèmes modèles.

Protocole

La figure 1 présente le flux de travail pour générer des OS planaires à l’aide d’un système de culture ALI. La première section décrit la génération de SOs kystiques à partir d’hiPSC sur la base de la méthodologie mise au point par Karl R. Koehler11, avec des modifications mineures (Figure 2). La deuxième section détaille la procédure de développement ultérieur des SO kystiques en SO planaires à l’aide d’un système de culture ALI tel que décrit précédemment12, avec des modifications (Figure 3). Tous les produits chimiques et matériaux sont répertoriés dans le tableau des matériaux. Trois lignes hiPSC décrites précédemment (LUMCi001-A, LUMCi004-A et WT2) ont été utilisées pour générer des SOs (https://hpscreg.eu/)13.

1. Génération de SO kystiques

La figure 2 présente les morphologies attendues et aberrantes aux étapes clés.

  1. Agrégation de cellules (Jour -2)
    1. Cultivez les hiPSC dans une plaque standard à 6 puits jusqu’à ce qu’ils atteignent une confluence de 70 à 80 %.
    2. Lavez les cellules avec 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco. Ajouter 1 mL de réactif de dissociation cellulaire (CDR) et incuber à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant ~6 min pour détacher les hiPSC sans les détacher de la matrice (éviter la surdigestion).
    3. Aspirer le CDR et ajouter 1 mL de milieu d’entretien hiPSC (hiMM) contenant 10 μM d’inhibiteur de ROCK. Détachez doucement les cellules en les pipetant de haut en bas à l’aide d’une pipette P1000 et préparez une suspension cellulaire à 3,5 × 103 cellules/mL.
    4. Versez 100 μL de la suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque à fond en U à 96 puits à très faible fixation à l’aide d’une pipette multicanaux. Centrifuger la plaque à 110 × g pendant 6 min à température ambiante et incuber à 37 °C avec 5 % de CO2.
  2. Dilution de l’inhibiteur de ROCK (Jour -1)
    1. Préparez hiMM contenant 100 μg/mL de supplément d’antibiotique-antimycosique (SAA).
    2. Distribuer 100 μL par puits et incuber à 37 °C avec 5 % de CO2.
  3. Induction de l’ectoderme de surface (Jour 0)
    1. Décongelez le volume approprié de matrice de membrane basale sur de la glace avant de passer à l’étape suivante. Préparer le milieu minimal hiPSC (hiMinM) complété par une matrice de membrane basale (2 %), BMP4 (2,5 ng/mL), SB431542 (10 μM) et bFGF (4 ng/mL) (appelé hiMinM+SFB) sur de la glace.
      REMARQUE : Il peut être nécessaire d’ajuster la concentration de BMP4 en fonction de la lignée cellulaire utilisée (voir la discussion).
    2. Prélever les agrégats de cellules dans un tube à fond rond de 2 mL à l’aide d’une pointe de pipette P200 à large orifice.
      REMARQUE : Utilisez des embouts à large orifice disponibles dans le commerce. Choisissez un orifice d’un diamètre intérieur d’au moins 2 mm pour minimiser les dommages aux agrégats. Vous pouvez également chauffer un scalpel à l’aide d’un stérilisateur à boucle infrarouge et l’utiliser pour créer un large orifice à partir d’une pointe de pipette conventionnelle.
    3. Laissez les agrégats se déposer au fond du tube. Aspirez soigneusement le milieu et ajoutez 2 mL de hiMinM pour laver les agrégats. Répétez le lavage pour un total de 3 fois.
    4. Transférez les agrégats de cellules en hiMinM+SFB froid dans un puits d’une plaque prérefroidie à 6 puits à l’aide d’une pointe de pipette P1000 à large orifice. Ensuite, transférez chaque agrégat dans 100 μL de hiMinM+SFB sur une plaque à très faible fixation à fond en U de 96 puits à l’aide d’une pointe de pipette P200 à large orifice. Remettez la plaque dans l’incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2.
      REMARQUE : Utilisez un stéréomicroscope placé sous un capot à flux d’air laminaire (LAF) pour cette étape.
  4. Induction de populations de cellules non épithéliales (jour 3)
    1. Préparez du hiMinM contenant du LDN193189 (1 μM), du bFGF (250 ng/mL) et du SAA (100 μg/mL). Versez 25 μL dans chaque puits à l’aide d’une pipette multicanaux.
    2. Agitez doucement la plaque pour assurer une répartition uniforme du fluide. Remettez la plaque dans l’incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2.
  5. Apport en nutriments (jour 6)
    1. Préparez du hiMinM contenant des AAS (100 μg/mL). Versez 75 μL dans chaque puits à l’aide d’une pipette multicanaux.
    2. Agitez doucement la plaque pour assurer une répartition uniforme du fluide. Remettez la plaque dans l’incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2.
  6. Rafraîchissement moyen (Jour 8 et Jour 10)
    1. Préparez du hiMinM contenant des AAS (100 μg/mL). Prélever avec précaution 100 μL de fluide de chaque puits à l’aide d’une pipette multicanaux. Versez 100 μL de fluide frais dans chaque puits à l’aide d’une pipette multicanaux.
    2. Agitez doucement la plaque pour assurer une répartition uniforme du fluide. Remettez la plaque dans l’incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2.
  7. Transition vers des plaques à 24 puits à faible fixation (jour 12)
    1. Décongelez le volume approprié de matrice de membrane basale sur de la glace avant de passer à l’étape suivante. Préparez le milieu de maturation organoïde (OMM) à l’aide d’un milieu avancé (49 % v/v), d’un milieu neural basal (49 % v/v), d’un supplément de glutamine (1x), d’un supplément de B-27 moins de vitamine A (0,5x), d’un supplément de N2 (0,5x), de 2-mercaptoéthanol (0,1 mM) et d’un SAA (100 μg/mL). Préparez le volume approprié d’OMM froid contenant 1 % de matrice de membrane basale (OMM1 % M) et conservez-le sur de la glace.
      REMARQUE : Utilisez un équipement de protection individuelle et travaillez dans un endroit bien ventilé lorsque vous manipulez du 2-mercaptoéthanol.
    2. Prélever les agrégats cellulaires dans un tube à fond rond de 2 mL à l’aide d’une pointe de pipette P1000 à large orifice.
    3. Laissez les agrégats se déposer au fond du tube. Aspirez soigneusement le fluide. Ajouter 1,5 mL de milieu avancé pour laver les agrégats. Répétez le lavage pour un total de 3 fois.
    4. Transférez les agrégats de cellules en OMM1 %M froid dans un puits d’une plaque prérefroidie à 6 puits à l’aide d’une pointe de pipette P1000 à large orifice. Ensuite, transférez chaque agrégat dans 500 μL d’OMM1 %M sur une plaque à faible fixation de 24 puits à l’aide d’une pointe de pipette P1000 à large orifice. Remettez la plaque dans l’incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2.
      REMARQUE : Utilisez un stéréomicroscope placé sous un capot LAF pour cette étape.
  8. Rafraîchissement moyen (Jour 15)
    1. Décongelez le volume approprié de matrice de membrane basale sur de la glace avant de passer à l’étape suivante. Préparez le volume approprié d’OMM1 %M froid. Gardez sur de la glace.
    2. À l’aide des pointes P1000, retirez soigneusement 250 μL de milieu de chaque puits. Ensuite, ajoutez 250 μL d’OMM1 %M dans chaque puits. Remettez la plaque dans l’incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2 sur un agitateur orbital réglé à 65 tr/min.
  9. Entre le jour 18 et le jour 45, effectuez un changement demi-moyen (250 μL) avec OMM les lundis, mercredis et vendredis.
  10. Entre le jour 45 et le jour 90, effectuez un demi-changement moyen (250 μL) avec OMM les lundis et mercredis et un changement complet moyen le vendredi.

2. Transition des OS kystiques aux SO planaires

REMARQUE : Les SO kystiques présentent une morphologie inversée, l’épiderme tourné vers l’intérieur vers le centre de l’organoïde et le derme en contact avec l’environnement extérieur. Entre le jour 70 et le jour 90, en fonction de la lignée cellulaire et de l’efficacité de la différenciation, la différenciation suprabasale précoce de l’épiderme est bien avancée et des chevilles à cheveux sont développées. C’est à ce stade que les SO kystiques sont transférés vers un système de culture ALI pour obtenir un tissu qui ressemble davantage à la peau humaine native.

  1. Sélection des OS kystiques entre le jour 70 et le jour 90 pour la transition vers les SO planaires
    1. Choisissez des SO kystiques d’un diamètre d’au moins 5 mm et d’une teneur minimale en sous-produits (cellules mésenchymateuses qui s’accumulent à un pôle du kyste et peuvent également contenir du cartilage). Utilisez la présence de placodes/piquets de cheveux comme indicateur de qualité du développement des organoïdes cutanés (Figure 1A et Figure 2B).
      REMARQUE : Aplatissez 2 à 4 SO planaires de chaque SO kystique, en fonction de leur taille.
  2. Préparation de l’insert enrobé de collagène (format 12 puits)
    1. Préparez une solution de NaOH (1 M) en dissolvant la quantité appropriée de pastilles de NaOH dans de l’eau distillée. Stérilisez la solution de NaOH à l’aide d’un filtre à membrane de 0,2 μm de taille poreuse.
      REMARQUE : Utilisez un équipement de protection individuelle et travaillez dans un endroit bien ventilé lorsque vous manipulez une solution de NaOH (1 M).
    2. Sur glace, diluez la solution de collagène de type I à une concentration finale de 2 mg/mL en utilisant 10 fois PBS (jusqu’à une concentration finale de 1 fois), du NaOH (5 mM) et de l’eau distillée pour ajuster le volume final. Répartissez 150 μL de la solution de collagène dans chaque insert placé dans une plaque standard à 12 puits. Incuber la plaque à 37 °C pendant 30 min pour permettre au gel de collagène de polymériser.
  3. Aplatissement du SO kystique (Figure 3)
    REMARQUE : Utilisez un stéréomicroscope placé sous un capot LAF pour cette étape.
    1. Placez le SO kystique sélectionné avec une petite quantité de milieu sur le couvercle d’une boîte de Pétri de 10 cm à l’aide d’une pipette P1000 à large orifice. Excisez soigneusement les sous-produits de l’OS à l’aide d’un scalpel stérile. Utilisez une pince stérile du côté opposé pour stabiliser l’organoïde lors de l’excision (Figure 3A).
      REMARQUE : À ce stade, le SO kystique ressemble à un ballon dégonflé avec deux couches de peau positionnées l’une sur l’autre.
    2. Exciser à environ 1 mm des extrémités de l’organoïde adjacentes à la première incision à l’aide d’un scalpel (figures 3B et F). Dépliez délicatement la couche supérieure de la peau à l’aide d’une pince stérile (Figure 3C,G).
    3. Coupez le morceau de tissu en 2 à 4 morceaux selon la taille. Transférez délicatement chaque morceau de tissu et placez-le dans un insert enduit de collagène, l’épiderme vers le haut, à l’aide d’une pince stérile (Figure 3D,H).
      REMARQUE : Évaluez les chevilles sous un stéréomicroscope pour assurer une orientation correcte de l’épiderme.
    4. Transférez l’insert sur une plaque standard à 12 puits contenant 600 μL d’OMM. Remettez la plaque dans l’incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2 (Figure 3E).
  4. Maintenance à long terme de la culture de l’interface air-liquide
    1. Entre le jour 1 et le jour 21 après l’aplatissement, effectuez un changement complet de milieu (600 μL) avec OMM les lundis, mercredis et vendredis. Remettez la plaque dans l’incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2 et 95 % d’humidité relative.
    2. Entre le jour 21 et le jour 27 après l’aplatissement, placez la plaque dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2 sans humidité pour renforcer la barrière cutanée. Effectuez quotidiennement un changement complet de milieu (800 μL) avec OMM.

Résultats

L’optimisation et les points de contrôle pour la génération de SO kystiques ont été décrits de manière approfondie14. La méthode présentée ici se concentre donc sur les points de contrôle clés à évaluer lors du développement des organoïdes kystiques (Figure 2A), la sélection de ceux qui conviennent à la transition vers les OS planaires (Figure 2B) et les critères utilisés pour évaluer la qualité des SO planaires résultants (Figure 1B-D et Figure 4).

La première étape clé dans le développement des SO kystiques est la formation d’un seul agrégat cellulaire dense qui incorpore la majorité des cellules présentes dans le puits au Jour 0 (Figure 2A). Ceci est réalisé grâce à une manipulation soigneuse et rapide des hiPSC, combinée à une centrifugation efficace, ce qui permet une distribution homogène des cellules au centre du puits (Figure 2A, Jour -2). L’induction correcte de l’ectoderme de surface conduit à la formation d’un épithélium mince et clair sur la couche la plus externe de l’agrégat au jour 3 (Figure 2A), qui se développe ensuite, après induction de cellules mésenchymateuses, en agrégats kystiques transparents contenant un noyau sombre de cellules mésenchymateuses au jour 8. Entre le jour 12 et le jour 20, le kyste épithélial est recouvert d’une fine couche de cellules mésenchymateuses qui s’accumulent à un pôle du kyste (Figure 2A, jour 12). La co-induction réussie des cellules épithéliales et mésenchymateuses aboutit finalement à un épithélium stratifié, permettant la formation de placodes et de chevilles pileux, qui deviennent visibles entre les jours 50 et 80 (Figure 2A,B). En sélectionnant des OS appropriés en fonction de ces points de contrôle développementaux, la variabilité morphologique et de taille peut être minimisée au moment de la transition vers les SO planaires.

La présence de placodes ou de chevilles dans les cheveux est le principal critère d’inclusion pour sélectionner les SO kystiques pour un développement ultérieur en SO planaires. L’absence de placodes visibles résulte généralement d’un défaut de stratification épidermique, qui apparaît alors extrêmement mince (Figure 2B, jour 50, panneau du milieu). Pour l’aplatissement, seuls les gros kystes (d’au moins 5 mm de diamètre) avec des sous-produits concentrés à un pôle et un minimum de sous-produits sont utilisés, tandis que ceux avec des sous-produits non polarisés sont exclus (figure 2B).

Une fois dans leur configuration plane, le contrôle de qualité primaire des OS repose sur le suivi macroscopique de la croissance des HF au stéréomicroscope. Les HF s’allongent progressivement tout au long des 27 jours de culture de l’ALI, les glandes sébacées devenant visibles vers le 14e jour et la pigmentation augmentant progressivement avec le temps (figures 1B et C). En raison des contraintes spatiales imposées par la membrane de l’insert située juste sous le gel de collagène mince, seuls les HF situés à la périphérie du SO planaire peuvent se développer complètement, et ils le font dans une orientation parallèle à l’insert (Figure 1C). Notamment, la tige du cheveu dépasse rarement de la surface de la peau. Pour évaluer davantage la qualité des SO planaires développés, ils peuvent être intégrés dans de la paraffine ou de l’OCT, sectionnés et colorés pour examiner leur composition et leur morphologie. La coloration H&E révèle que leur structure ressemble beaucoup à celle de la peau humaine (Figure 4A), avec un épithélium entièrement stratifié et un derme séparé par une membrane basale. La coloration par immunofluorescence à l’aide de marqueurs spécifiques pour les différentes couches de l’épiderme, les glandes sébacées et les mélanocytes confirme en outre l’architecture tissulaire semblable à celle de la peau humaine des SO planaires (Figure 1D et Figure 4B).

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Figure 1 : Flux de travail pour la génération d’OS planaires contenant des HF à partir de hiPSC à l’aide d’un système de culture ALI. Une représentation schématique et des images représentatives des étapes clés sont présentées. (A) Génération de SO kystiques, essentiellement comme décrit précédemment10, jusqu’à ce que des placodes/chevilles capillaires visibles se forment vers le jour 80. (B) Les SO kystiques sont incisés et aplatisés, avec le côté de l’épiderme vers le haut, sur un insert de culture cellulaire enrobé de collagène de type I. Les cultures ALI sont maintenues pendant 21 jours dans des conditions humides, suivies de 6 jours dans des conditions sèches. (C) Vue à fort grossissement d’une région illustrée en (B), illustrant la croissance des follicules pileux, le développement de la structure semblable à celle des glandes sébacées (pointes de flèches) et la pigmentation progressive au fil du temps. (D) Images confocales de coupes SO planes au jour 27 après l’aplatissement, marquées avec un anticorps anti-collagène de type IV associé soit au rouge du Nil, qui marque les structures semblables à celles des glandes sébacées, soit à l’anticorps anti-COUCHEL, qui colore les mélanocytes. Les noyaux sont contre-colorés avec du DAPI. Barres d’échelle : 200 μm (A) ; 500 μm (B,C) ; 50 μm (D). Abréviations : SOs = organoïdes cutanés ; HF = follicules pileux ; hiPSC = cellules souches pluripotentes induites humaines ; ALI = interface air-liquide ; Col IV = collagène de type IV ; PMEL = protéine prémélanasome ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Images représentatives de la morphologie des agrégats cellulaires aux étapes clés de la production de SO. (A) Images représentatives des SO kystiques avec des morphologies appropriées (panneaux de gauche) et inadéquates (panneaux du milieu et de droite) à différents stades. Au jour -2, les agrégats cellulaires doivent présenter une distribution uniforme (panneau de gauche), tandis qu’une mauvaise manipulation des plaques après centrifugation peut perturber la distribution des cellules (panneau de droite). Au jour 0, les agrégats bien formés apparaissent sous forme d’amas cellulaires compacts et denses (panneau de gauche), tandis qu’une faible viabilité cellulaire entraîne une mort cellulaire généralisée et une perte des structures 3D compactes (panneau de droite). Au jour 3, une couche épithéliale externe distincte devient visible (panneau de gauche), son absence peut indiquer que la concentration de BMP4 doit être optimisée (panneau de droite). Au jour 12, les cellules mésenchymateuses s’accumulent à un pôle et migrent pour envelopper le kyste épithélial (panneau de gauche), tandis qu’une différenciation épithéliale excessive (panneau du milieu) ou mésenchymateuse (panneau de droite) empêche une bonne stratification épithéliale. Au jour 50, les OS présentent une morphologie bipolaire, avec de la peau kystique d’un côté et des sous-produits, principalement du cartilage, de l’autre (panneau de gauche). Une différenciation épithéliale excessive (panneau moyen) ou mésenchymateuse (panneau droit) entrave le bon développement de la peau. (B) Images représentatives de SO kystiques avec des pinces à cheveux visibles vers le jour 80. Notez la proportion variable de sous-produits (à gauche de la courbe pointillée) par rapport à l’peau. Les trois panneaux les plus à gauche permettent de générer 2 à 4 SO planaires, tandis que le panneau le plus à droite montre un SO de qualité insuffisante pour l’aplatissement. Barres d’échelle : 500 μm pour le jour -2, le jour 50 et le jour 80 ; 200 μm pour le jour 0, le jour 3 et le jour 12. Abréviation : SO = organoïde de peau. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Représentation schématique des étapes techniques de production des OS planaires. Effectuer l’aplatissement des SO kystiques au stéréomicroscope à l’intérieur d’une cagoule LAF. (A) Exciser la perche accumulant les sous-produits du SO kystique à l’aide d’un scalpel stérile. (B) Coupez les membres supérieurs et inférieurs de l’OS pour faciliter le dépliage des tissus. (C) Coupez le tissu planaire en 2 à 4 morceaux. Transférez et aplatissez chaque morceau, côté épidermique vers le haut, sur un insert enduit de collagène à l’aide d’une pince stérile. (D) Placer l’insert de culture contenant le tissu aplati dans une plaque standard de 12 puits contenant 600 μL de milieu. (E) Incuber la plaque à 37 °C avec 5 % de CO2. (F) Vue transversale schématique de l’organoïde cutané représenté en (B). (G) Vue transversale schématique de l’organoïde cutané représenté en (C). (H) Image d’un SO planaire placé sur un gel de collagène de type I versé sur un insert de culture cellulaire positionné dans une plaque à 12 puits contenant 600 μL de milieu. Abréviations : SO = organoïde de peau ; LAF = flux d’air laminaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Caractérisation des SO planaires dérivés des hiPSC. (A) Images représentatives en fond clair de l’SO planaire coloré par H&E aux jours 1 et 27 après l’aplatissement. Au jour 27, les SO planaires montrent une maturation cutanée avec un épiderme pluristratifié et des HF contenant des structures glandulaires sébacées (pointes de flèches). (B) Les images confocales de coupes SO planes colorées avec de l’intégrine anti-β4 et des anticorps anti-kératine 10 ou anti-loricrine montrent une différenciation suprabasale précoce (cellules KRT10+) au jour 1 et une différenciation tardive (couche LOR+) au jour 27. Les noyaux sont contre-colorés avec du DAPI. Barres d’échelle : 50 μm (A) ; 100 μm (B). Abréviations : SO = organoïde de peau ; hiPSC = cellule souche pluripotente induite par l’homme ; H&E = hématoxyline et éosine ; β4 = intégrine b4 ; KRT10 = kératine 10 ; LOR = loricrine ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Le protocole décrit ici surmonte une limitation clé du système SO kystique en restaurant l’orientation et l’environnement des tissus natifs par l’aplatissement des tissus et l’exposition de l’épiderme apical à l’air. Cette méthode préserve la complexité cellulaire et structurelle intrinsèque de l’organoïde, favorise une organisation physiologiquement pertinente et fournit un accès direct à la surface épidermique pluristratifiée pour la manipulation expérimentale.

Plusieurs étapes du protocole sont essentielles pour obtenir des SO planaires de haute qualité, en commençant par la génération de SO kystiques de haute qualité. Les contrôles de qualité clés et les points de modification potentiels du protocole ont été décrits en détail avant12. En bref, le point de départ devrait être des cultures hiPSC bien maintenues et indifférenciées à 70-80 % de confluence, montrant des cellules serrées avec un rapport nucléaire/cytoplasmique élevé. La génération de SO kystiques nécessite une modulation précise de la signalisation BMP4 lors de l’induction de l’ectodermede surface 12. Comme la sensibilité du BMP4 peut varier entre les lignes de hiPSC, un titrage peut être nécessaire pour des résultats optimaux. Il est recommandé d’analyser les concentrations de BMP4 entre 2,5 et 15 ng/mL, car aucun cas réussi n’a été signalé en dehors de cette plage. La cohérence de la source de réactifs est également importante ; Par conséquent, les stocks en vrac d’un seul fournisseur doivent être préparés et entreposés dans les conditions recommandées et utilisés avant leur date de péremption afin d’assurer une activité biologique complète et de minimiser la variabilité.

La sélection de SO kystiques avec une morphologie et une taille appropriées est cruciale pour un aplatissement réussi des SO. La maturation des SO kystiques et par conséquent la formation de chevilles et de placodes capillaires peuvent varier entre les lignes hiPSC, par conséquent, le moment de l’aplatissement peut varier du jour 70 au jour 90. L’ajout de CHIR99021, un inhibiteur de GSK3 et un agoniste de signalisation WNT, au jour 3 de la formation de SO kystique peut être envisagé, car il a été démontré qu’il augmente la taille des organoïdes et réduit la formation de cartilage en favorisant la prolifération et en inhibant la migration de la crête neurale12. Bien que prometteur, nous n’avons pas observé de résultats cohérents avec cette modification dans nos cultures.

Le processus d’aplatissement nécessite une dextérité manuelle et une familiarité avec les tissus. Notamment, lors du transfert du fragment de peau sur l’insert enduit, il faut veiller à ce que l’orientation correcte des tissus soit correcte. Il est recommandé de vérifier l’orientation à l’aide d’une pince fine sous un stéréomicroscope et d’ajuster doucement le tissu jusqu’à ce que la face apicale soit tournée vers le haut. Lorsqu’ils sont correctement positionnés, les pinces/placodes pour cheveux doivent être orientés vers le bas. Après le transfert des SO planaires à la culture ALI, les HF commencent généralement à montrer une croissance notable et une pigmentation de la tige du cheveu en quelques jours.

Les principales limites du modèle décrit sont le temps et le niveau élevé d’entretien requis, ainsi que l’immaturité du modèle. Le développement des SO kystiques dotés de piquets de cheveux dure entre 70 et 90 jours et est suivi de 4 semaines de culture ALI. Ce délai prolongé, combiné à une procédure d’aplatissement laborieuse, rend le système moins adapté aux applications à haut débit, en particulier par rapport aux équivalents en peau humaine disponibles dans le commerce. Bien que des optimisations mineures puissent réduire légèrement le temps de culture, une réduction substantielle est peu probable. La grande diversité cellulaire et structurelle de la peau dépend d’une séquence complexe d’interactions épithéliales-mésenchymateuses et de signaux mécaniques, qui ne peuvent probablement pas être accélérés par l’ajout de facteurs exogènes in vitro 15,16,17,18. La formation des SO kystiques et leur progression vers la forme plane nécessitent un niveau élevé d’entretien. L’une des périodes les plus intensives en manipulation, à l’exception des 18 premiers jours de culture kystique, se produit lorsque les SO planaires sont maintenus dans une atmosphère peu humide et nécessitent un réapprovisionnement quotidien en milieu moyen. À l’instar d’autres modèles dérivés d’hiPSC, les SO conservent un phénotype de type fœtal in vitro. De plus, les glandes sudoripares et les muscles pili arrecteurs sont largement absents chez les SOs14, probablement en raison du manque de vascularisation, de cellules immunitaires et de forces mécaniques telles que le stress de cisaillement, l’étirement et la friction, qui sont tous essentiels à une bonne maturation 15,16,17,18,19. Certaines de ces limites peuvent être résolues en augmentant la complexité du modèle. La co-culture avec des macrophages autologues dérivés d’hiPSC17, l’intégration d’un système de perfusion9 ou l’application d’un étirement mécanique17 peuvent aider à promouvoir la maturité du modèle20,21.

Il convient de noter que le format d’insertion transpuits limite quelque peu la croissance vers le bas des HF dans les SO planaires. Par conséquent, les HF ont tendance à se propager latéralement et peuvent être exposés à l’air. Étant donné que les HF sont normalement protégés dans la peau in vivo, cela devrait être pris en compte lors de la conception des expériences. La modification du revêtement de l’insert en appliquant une couche d’hydrogel plus épaisse peut aider à atténuer ce problème. De plus, les tiges des cheveux dépassent rarement de la surface de la peau dans ce modèle. Nos observations indiquent que les HF dans les SO planaires restent en anagène, la phase de croissance active, jusqu’au jour 27 de la culture ALI. Compte tenu de la durée prolongée de l’anagène dans les IC humaines, cela n’est pas tout à fait inattendu. Bien que la culture à long terme puisse éventuellement favoriser la transition de phase, cela est peu probable en l’absence d’indices systémiques. L’identification et la supplémentation des signaux moléculaires nécessaires au cycle folliculaire peuvent permettre l’induction artificielle des phases catagène et télogène.

En résumé, le protocole de génération de SO planaires permet un large éventail d’approches expérimentales qui ne sont pas réalisables ou pertinentes dans le SO kystique. Les SO planaires ont déjà été utilisés avec succès pour modéliser les infections bactériennes11 et virales22, les lésions tissulaires induites par les rayons ultraviolets22 et les réponses médicamenteuses associées 12,22,23. La capacité d’accéder à la surface apicale d’un équivalent cutané complexe et physiologiquement pertinent représente une avancée substantielle pour le domaine et ouvre la porte à une variété de nouvelles applications dans la recherche sur la peau.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Nous remercions nos collègues de l’hôtel hiPSC, centre médical de l’Université de Leiden, pour la fourniture de lignes hiPSC. Ce travail a été soutenu par le Centre de médecine des cellules souches de la Fondation Novo Nordisk, soutenu par la Fondation Novo Nordisk, Danemark (numéro de subvention NNF21CC0073729) à K.R. K.R. est chargé de recherche à l’Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
DMEM avancé/F12Thermo Fisher Scientific#12634010appelé médium avancé dans le texte.
ALK5, inhibiteur. TGFb type 1, SB431542Tocris Bioscience#1614Aliquot, magasiner à -20 & degrés ; C et   ; Maintenez-vous à 4 degrés ; C pour un maximum de 7 jours   ;
Anticorps anti-CD104 clone monoclonal de rat 439-9BBD Biosciences#555719NA
Anticorps polyclonal anticollagène de type IVMerckMillipore#Ab769NA
Anticorps polyclonal anti-cytokératine 10 du lapinBiolégende#905401NA
Anticorps polyclonal anti-loricrin du lapinBiolégende#905101NA
Anticorps monoclonal anti-PMEL de sourisNovus Biologicals#NBP2-29407  ;NA
Supplément de B-27, sans vitamine AThermo Fisher Scientific#12587010Aliquot, magasiner à -20 & degrés ; C  ;
Inserts de culture cellulaireGreiner Bio-one#66564112 puits, taille des pores 0,4 & micro ; m; transparent (48 inserts/boîte) ; https://shop.gbo.com/en/row/products/bioscience/3d-cell-culture/thincert/3d-thincert-cell-culture-inserts/665641.html
Collagène de type ICorning#354249Gardez la solution d’origine à 4 °C ; C
Scalpel jetable stérile 0507 n° 21Swann Morton#0507NA
Dulbecco » s Solution Saline Tamponnée au phosphate (DPBS)Thermo Fisher Scientific#14190094NA
Moyen Essential 6 (E6)Thermo Fisher Scientific#A1516401appelée hiPSC médium minimal (hiMinM) et nbsp ; dans le texte.
FasudilLC Labs#F-4660Une solution 1000x d’origine et la stocke à -20 °C. Une fois décongelé, gardez à 4 degrés C pour un maximum de 14 jours   ;
Dissociation des cellules douces   ; RéactifTechnologies des cellules souches#100-0485NA
Supplément GlutaMAXThermo Fisher Scientific#35050038NA
Grade de base du prenium FGF-2 humainMiltenyi Biotec#130-093-842Aliquot, magasiner à -80 °C ; C et   ; Maintenez-vous à 4 degrés ; C pour un maximum de 7 jours   ;
LDN 193189 dihydrochlorureTocris#6053Aliquote, photosensible, à conserver à -20 °C ; C  ;
Matrice de membrane basale réduite par facteur de croissance MatrigelCorning#354230Aliquot, magasiner à -20 & degrés ; C et   ; Maintenez-vous à 4 degrés ; C pour un maximum de 7 jours   ;
2-MercaptoéthanolThermo Fisher Scientific#21985023Substance dangereuse, toxique, corrosive, irritante, danger pour la santé et l’environnement.
NaOHMerck#567530-250MGSubstance dangereuse, corrosive et irritante. Préparez une solution de façon improvisée.
Milieu neurobasalThermo Fisher Scientific#21103049appelé milieu basal neural   ; dans le texte.
Normocine 50 mg/mlInvivogen#ant-nr-1désigné comme complément antibiotique-antimycotique, dans le test. Aliquot, magasiner à -20 & degrés ; C et   ; Maintenez-vous à 4 degrés ; C pour un maximum de 14 jours   ;
Microplaque Nunclon Sphera 96-Puits à fondThermo Fisher Scientific#174929NA
Nunclon Sphera 174930 multidish à 24 puitsThermo Fisher Scientific#174930NA
Supplément N2Thermo Fisher Scientific#17502048Aliquot, stockez à -20 degrés ; C  ;
Secoueur orbitalThermo Fisher Scientific#88881102NA
Pénicilline-StreptomycineThermo Fisher Scientific#15070063NA
Protéine BMP4 humaine recombinanteR& Systèmes D#314-BP-010Aliquot, magasiner à -80 °C ; C et   ; Maintenez-vous à 4 degrés ; C pour un maximum de 7 jours   ;
StemFlex (SF) moyenThermo Fisher Scientific#A3349401appelé milieu de maintenance hiPSC (hiMM) et nbsp ; dans le texte.
SteriMax smart  ;- Stérilisateur à boucle infrarougeWLD-TEC#4.002.000  ;Optionnel
BrucellesMerck#T4537-1EAStyle 5 ; Acier inoxydable fin à aiguilles, anti-magnétique
VitronectineTechnologies des cellules souches#07180NA

Références

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Mots-clés

Cellules souches pluripotentes induitesFormation de follicules pileuxOrgano des cutan s planairesMarquage par immunofluorescenceDiff renciation pidermiqueInduction m senchymateuseGlandes s bac esMod le cutan in vitro

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