Analyse automatisée d’images de fluorescence de C. elegans à l’aide de SegElegans

Résumé

Nous fournissons ici des instructions sur l’utilisation efficace de SegElegans, un système d’apprentissage profond que nous avons développé pour la segmentation automatisée de vers individuels dans des images de microscopie à grand champ, pour une utilisation ultérieure dans des logiciels d’analyse d’images tels qu’ImageJ. Nous fournissons des moyens d’utiliser le système à la fois en ligne et hors ligne.

Résumé

La microscopie, en particulier celle qui est fluorescente, est un outil fréquemment utilisé dans la recherche sur C. elegans . L’analyse des données issues d’expériences de microscopie peut toutefois s’avérer assez fastidieuse et chronophage. Ainsi, l’automatisation est souhaitable. Nous avons développé SegElegans, un système de réseau neuronal convolutif à deux têtes basé sur U-net qui est spécialement conçu pour la segmentation automatisée des vers, même dans des images avec un grand nombre d’individus qui se touchent ou se chevauchent. La première partie de SegElegans se compose d’un encodeur et de deux décodeurs. L’encodeur, basé sur le modèle SmaAt AT, applique des couches de convolution doubles suivies d’un module d’attention par bloc convolutif (CBAM). Les deux décodeurs utilisent des LSTM convolutifs : l’un effectue la segmentation sémantique des images du ver (corps, bord, arrière-plan ou chevauchement), tandis que l’autre extrait un squelette linéaire le long de chaque ver. La deuxième partie est un algorithme de post-traitement qui combine les sorties des deux décodeurs et les utilise pour générer des segmentations d’instance précises. Ces segmentations peuvent ensuite être transmises à ImageJ ou à d’autres outils d’analyse d’images appropriés. Nous vous présentons ici des instructions sur la façon d’accéder à ce système et de l’exécuter. Nous fournissons une implémentation en ligne, basée sur le cloud computing, ainsi que deux méthodes pour utiliser les modèles SegElegans hors ligne, sur une machine locale, si le matériel requis est disponible.

Introduction

Caenorhabditis elegans est un organisme modèle eucaryote largement utilisé dans les domaines de la biologie cellulaire et moléculaire ^1,2,3. Il s’agit d’un petit ver nématode vivant dans le sol (~1 mm pour les adultes de type sauvage) avec un cycle de vie rapide (~ trois semaines) et un grand nombre de descendants (généralement génétiquement identiques au parent hermaphrodite autofertilisant). Malgré sa relative simplicité, l’animal n’en reste pas moins un organisme multicellulaire complexe avec des tissus et des organes définis et d....

Protocole

Les sections suivantes contiennent des instructions détaillées sur la façon d’utiliser efficacement SegElegans (Figure 2). Ils comprennent des instructions sur l’acquisition d’images préparatoires (section 1), sur la façon d’exécuter le modèle en ligne (section 2) ou hors ligne (sections 3-5) et sur l’importation de retours sur investissement dans ImageJ ou d’autres outils (section 6). Étant donné que l’évaluation des images à travers le modèle nécessite un PC doté d’une unité de traitement graphique (GPU) compatible CUDA disposant d’au moins 6 Go (idéalement plus) de mémoire vive vidéo (VRAM), il est con....

Résultats

En suivant ce protocole, les chercheurs devraient être en mesure d’extraire des segmentations de vers de haute qualité, même pour l’analyse d’images de fluorescence sans bordures de vers visibles. Comme nous l’avons vu dans la section 6 du protocole, ces segmentations peuvent être importées directement dans ImageJ et utilisées pour la mesure rapide de propriétés pertinentes telles que l’intensité des rapporteurs fluorescents (couramment utilisés pour la quantification de l’expression) ou.......

Discussion

La méthodologie présentée ici devrait permettre aux utilisateurs d’analyser les expériences de microscopie de C. elegans dans un délai nettement plus rapide sans aucune perte de précision. Comme il extrait des segmentations à partir d’images-guides en fond clair indépendamment de la fluorescence réelle (comme discuté dans la section 1 du protocole), il peut être utilisé avec n’importe quelle souche et pour toute application nécessitant de mesurer les phénotypes par ver. Il peut .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Ordinateur avec accès Internet (exemple : Dell Vostro Desktop)	Plusieurs (Dell par exemple)	;-	Cela permettra de faire fonctionner SegElegans en ligne via le cloud computing comme recommandé et en utilisant des logiciels d’analyse d’images tels qu’ImageJ.
Unité de traitement graphique compatible CUDA avec au moins 6 Go de VRAM (exemple : MSI Geforce RTX  ; RTX3050 Ventus 2X 6 Go) (Optionnel)	NVIDIA + plusieurs fabricants (Micro Star International par exemple)	https://developer.nvidia.com/cuda-gpus	Cela permettra d’exécuter des SegElegans hors ligne sur une machine locale. les chipsets GPU compatibles CUDA sont disponibles ici : https://developer.nvidia.com/cuda-gpus La VRAM dépend de l’implémentation réelle du chipset dans un GPU par le fabricant. AVERTISSEMENT : Vous aurez besoin d’une carte CUDA coûteuse et puissante, bien au-delà des exigences minimales (16+ Go de VRAM) pour égaler les performances obtenues par la version cloud computing.
Microscope à épifluorescence (Invitrogen EVOS FL Auto 2)	ThermoFisher Scientific & nbsp ;	AMAFD2000 par exemple	Nous recommandons d’utiliser un système capable d’acquérir automatiquement des images à partir de champs lumineux et d’un ou plusieurs canaux de fluorescence presque simultanément.
ImageJ (Optionnel)	NIH	https://imagej.net/software/fiji/downloads	Nous recommandons la distribution fidjienne, disponible ici : https://imagej.net/software/fiji/downloads
PC compatible GPU NVIDIA (exemple : Dell Vostro Desktop) (optionnel) & nbsp ;	Plusieurs (Dell par exemple)	;-	Cela est nécessaire en conjonction avec le GPU pour faire tourner des SegElegans hors ligne sur une machine locale. Un GPU nécessitera du matériel compatible Windows avec les emplacements PCI appropriés sur la carte mère, de la place pour la carte et une alimentation suffisamment puissante.
SegElegans	-	https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOnline/tree/v1.0  ;	Voir le manuscrit pour les instructions complètes.