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Article de méthode

Analyse automatisée d’images de fluorescence de C. elegans à l’aide de SegElegans

1.1K vues

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DOI :

10.3791/69094

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10 octobre 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Basic Sciences, Faculty of Medicine, University of Crete, 2Institute of Molecular Biology and Biotechnology, Foundation for Research and Technology-Hellas, 3Instituto de Automática e Informática Industrial, Universitat Politècnica de València

Dans cet article

Résumé

Nous fournissons ici des instructions sur l’utilisation efficace de SegElegans, un système d’apprentissage profond que nous avons développé pour la segmentation automatisée de vers individuels dans des images de microscopie à grand champ, pour une utilisation ultérieure dans des logiciels d’analyse d’images tels qu’ImageJ. Nous fournissons des moyens d’utiliser le système à la fois en ligne et hors ligne.

Résumé

La microscopie, en particulier celle qui est fluorescente, est un outil fréquemment utilisé dans la recherche sur C. elegans . L’analyse des données issues d’expériences de microscopie peut toutefois s’avérer assez fastidieuse et chronophage. Ainsi, l’automatisation est souhaitable. Nous avons développé SegElegans, un système de réseau neuronal convolutif à deux têtes basé sur U-net qui est spécialement conçu pour la segmentation automatisée des vers, même dans des images avec un grand nombre d’individus qui se touchent ou se chevauchent. La première partie de SegElegans se compose d’un encodeur et de deux décodeurs. L’encodeur, basé sur le modèle SmaAt AT, applique des couches de convolution doubles suivies d’un module d’attention par bloc convolutif (CBAM). Les deux décodeurs utilisent des LSTM convolutifs : l’un effectue la segmentation sémantique des images du ver (corps, bord, arrière-plan ou chevauchement), tandis que l’autre extrait un squelette linéaire le long de chaque ver. La deuxième partie est un algorithme de post-traitement qui combine les sorties des deux décodeurs et les utilise pour générer des segmentations d’instance précises. Ces segmentations peuvent ensuite être transmises à ImageJ ou à d’autres outils d’analyse d’images appropriés. Nous vous présentons ici des instructions sur la façon d’accéder à ce système et de l’exécuter. Nous fournissons une implémentation en ligne, basée sur le cloud computing, ainsi que deux méthodes pour utiliser les modèles SegElegans hors ligne, sur une machine locale, si le matériel requis est disponible.

Introduction

Caenorhabditis elegans est un organisme modèle eucaryote largement utilisé dans les domaines de la biologie cellulaire et moléculaire 1,2,3. Il s’agit d’un petit ver nématode vivant dans le sol (~1 mm pour les adultes de type sauvage) avec un cycle de vie rapide (~ trois semaines) et un grand nombre de descendants (généralement génétiquement identiques au parent hermaphrodite autofertilisant). Malgré sa relative simplicité, l’animal n’en reste pas moins un organisme multicellulaire complexe avec des tissus et des organes définis et distincts, qui, grâce à sa petite taille et à sa transparence, peut être étudié in vivo sans qu’il soit nécessaire de recourir àdes traitements invasifs ou à d’autres traitements invasifs4. La capacité du ver pour l’étude in vivo par microscopie peut être encore amplifiée par l’utilisation de rapporteurs fluorescents, qui permettent de distinguer facilement les cellules individuelles ou même de visualiser directement les organites/composants subcellulaires tels que les mitochondries, les gouttelettes lipidiques ou les agrégats de protéines, et de processus tels que la transduction du signal, l’expression des gènes, la fusion des vésicules, autophagie, potentiels d’action neuronale et musculaire, etc.5,6,7,8,9,10,11. De plus, le nématode se prête également très bien à la manipulation génétique par mutagenèse12, transgenèse par micro-injection ou bombardement de microparticules13, édition CRISPR14 et, surtout, lorsqu’il s’agit d’un dépistage génétique facile et rentable, ARNi15. Cette manipulation permet l’étude approfondie des gènes et de leur rôle dans le nématode lui-même, tout en faisant, grâce à l’homologie génétique significative que C. elegans présente avec d’autres organismes modèles, des découvertes fondamentales pertinentes jusqu’aux humains16,17. Enfin, cette homologie/conservation fait également du ver un terrain d’essai initial idéal pour les médicaments et les agents chimiques, permettant l’élucidation des mécanismes de l’activité des médicaments, l’identification des variations génétiques potentielles modifiant l’activité et la découverte d’interactions indésirables potentielles et d’effets hors cible 18,19,20.

Tous les avantages mentionnés ci-dessus ont fait de C. elegans un modèle attrayant pour les études de biologie cellulaire et moléculaire, en particulier pour les scientifiques intéressés par la surveillance in vivo et souvent en temps réel des processus par microscopie. De telles études impliquent généralement une quantité importante d’analyse d’images à l’aide d’un logiciel spécial, l’option la plus largement utilisée étant ImageJ 21,22,23. Une caractéristique commune de l’analyse à l’aide d’un tel logiciel est la nécessité pour l’utilisateur/chercheur de spécifier des régions d’intérêt (ROI) pour l’analyse à l’aide d’outils de sélection. Très fréquemment, chaque ver individuel d’une image sera sélectionné comme son propre retour sur investissement, dans le but d’acquérir des informations par ver sur des caractéristiques morphologiques simples (telles que les dimensions corporelles) ou des lectures expérimentales plus « avancées » telles que les niveaux d’expression d’un gène (mesurés avec un rapporteur fluorescent), la lecture d’un rapporteur ratiométrique, le nombre et la taille des gouttelettes lipidiques, la formation des agrégats protéiques, la morphologie des organites individuels et leurs réseaux, etc.5,8,10,24,25,26,27. Ces sélections par ver sont généralement effectuées manuellement, car les méthodes de sélection automatique basées sur des algorithmes de traitement d’image standard ne sont généralement pas assez capables de distinguer les formes et les caractéristiques du ver, en particulier dans les images en fond noir où les contours des vers ne sont pas clairement visibles ou dans les images en fond clair avec un nombre important d’animaux qui se touchent et se chevauchent. Le processus manuel est cependant lent (20 s à 1 min par ver selon la précision nécessaire et l’expérience de l’utilisateur), laborieux et sujet à des biais et des erreurs de l’utilisateur.

Une approche alternative et beaucoup plus puissante pour la génération de ROI individuels de C. elegans (une tâche généralement appelée segmentation dans le domaine de la vision par ordinateur) consiste à l’automatiser à l’aide de techniques d’apprentissage profond / réseau neuronal. Les réseaux neuronaux convolutifs basés principalement sur le masque R-CNN28 et les architectures U-net29 ont produit des résultats décents dans des tâches de segmentation sur divers systèmes modèles biologiques 30,31,32 y compris chez C. elegans 33,34,35,36,37,38,39 , mais aucun n’a apporté de solution satisfaisante au problème de la génération de segmentations du corps entier qui distinguent correctement les animaux individuels (segmentation d’instance) dans des images à haute résolution avec un grand nombre de vers qui se touchent ou se chevauchent carrément. Afin de répondre à ce besoin, nous avons développé SegElegans, un modèle d’apprentissage profond spécialement conçu et optimisé pour cette tâche40.

SegElegans est composé de deux parties principales (Figure 1). La première partie est un réseau neuronal convolutif à deux têtes U-net. Il est composé d’un bloc d’encodeur et de deux blocs de décodeur. Le bloc d’encodeur est basé sur le modèle SmaAt AT41 et utilise des blocs de double convolution pour chaque couche alimentant un module d’attention de bloc convolutif (CBAM)42. Les deux blocs décodeurs sont basés sur le réseau convolutif de mémoire à long terme (LSTM)43. Un décodeur est chargé de catégoriser chaque pixel des images comme une partie du corps principal d’un ver, une partie du bord d’un ver, une partie de l’arrière-plan ou une partie d’une zone où les vers se chevauchent (c’est ce qu’on appelle généralement la segmentation sémantique). L’autre décodeur est chargé de dessiner un « squelette » linéaire sur toute la longueur de chaque ver. La deuxième partie est un algorithme de post-traitement qui combine les sorties des deux décodeurs et les utilise pour générer des segmentations d’instance précises. Il identifie d’abord les segments de chevauchement réel en comparant la sortie de la segmentation sémantique à celle du squelette. Ensuite, il génère la segmentation d’instance directement pour les vers sans chevauchement ou en l’assemblant à partir de segments pour ceux qui se chevauchent40. Ces segmentations sont enregistrées sous forme de masques binaires ainsi que de ROI compatibles avec ImageJ.

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Protocole

Les sections suivantes contiennent des instructions détaillées sur la façon d’utiliser efficacement SegElegans (Figure 2). Ils comprennent des instructions sur l’acquisition d’images préparatoires (section 1), sur la façon d’exécuter le modèle en ligne (section 2) ou hors ligne (sections 3-5) et sur l’importation de retours sur investissement dans ImageJ ou d’autres outils (section 6). Étant donné que l’évaluation des images à travers le modèle nécessite un PC doté d’une unité de traitement graphique (GPU) compatible CUDA disposant d’au moins 6 Go (idéalement plus) de mémoire vive vidéo (VRAM), il est conseillé à la plupart des utilisateurs (à condition qu’ils aient accès aux services de Google) d’utiliser la version en ligne du modèle qui satisfait et dépasse ces exigences matérielles grâce au cloud computing (Section 1 > Section 2 > Section 6). Alternativement, les utilisateurs qui ont accès à un matériel suffisamment puissant et à une compréhension de base de l’utilisation de la ligne de commande/du terminal (ou les utilisateurs qui n’ont pas accès aux options de cloud computing susmentionnées) peuvent trouver l’exécution du modèle localement plus pratique (Section 1 > Section 3 > Section 4 ou 5 > Section 6).

1. Acquisition d’échantillons et d’images-guides

  1. Utilisez SegElegans pour acquérir des segmentations de vers adultes à partir de n’importe quelle souche de vers, quels que soient les rapporteurs fluorescents qu’ils expriment ou non. Si le phénotype(s)/les données d’intérêt sont mesurés dans des images en fond clair, acquérez-les normalement à l’aide d’un microscope à grand champ et d’un logiciel compatible, à l’aide d’un objectif 4x ou similaire.
    REMARQUE : SegElegans peut analyser des images avec une large gamme de luminosité et de contraste, bien qu’il soit préférable qu’il n’y ait pas de pixels clairs ou sombres saturés. En ce qui concerne les dimensions, le système a été entraîné avec des images de 1328 x 1048, mais doit fonctionner avec n’importe quelle image d’une taille d’au moins 512 x 512.
  2. Si le ou les phénotypes/données d’intérêt sont mesurés dans des images en fond noir (typique lors de l’utilisation d’un ou plusieurs rapporteurs ou colorants fluorescents transgéniques), acquérez des images en fond clair en même temps que les données à utiliser comme images guides (comme expliqué à l’étape 1.1). Assurez-vous que les images-guides correspondent parfaitement aux images en fond noir du ou des canaux de fluorescence dans l’espace et aussi près que possible dans le temps, idéalement en utilisant les options d’acquisition multicanaux fournies par le logiciel d’exploitation du microscope. Enregistrez les images de guidage dans un dossier distinct des images de données en fond noir correspondantes, en utilisant le même nom pour les deux.

2. Exécution de la version en ligne de SegElegans

  1. Connectez-vous à un compte Google sur un navigateur Web. Il est recommandé de créer un nouveau compte de laboratoire dédié à cet effet.
  2. Entrez dans Google Drive (https://drive.google.com) et téléchargez le dossier avec les images en fond clair (données ou guide). Comme mentionné précédemment, si des images guides sont utilisées pour générer des retours sur investissement pour les images en fond noir, n’incluez pas ces images de données en fond noir dans ce dossier.
  3. Allez dans https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOnline/tree/v1.0 et cliquez sur le fichier SegElegans Body Prediction Interface.ipynb . Cliquez sur le bouton Ouvrir dans Colab en haut du fichier qui s’ouvre. Le bloc-notes/l’interface Jupyter pour SegElegans s’ouvrira sur Google Colab.
  4. Exécutez le bloc de code 1 en appuyant sur le bouton play (figure-protocol-1) sous le titre. Accordez au runtime l’autorisation d’exécuter le code et d’observer la sortie une fois l’exécution terminée (une coche verte apparaît à côté du bouton de lecture). Colab doit exécuter automatiquement le bon runtime compatible CUDA et afficher une table de sortie NVIDIA-SMI. Sinon, forcez l’utilisation d’un runtime GPU T4 via le menu Runtime > Change de type d’exécuture .
  5. Exécutez le bloc de code 2 pour charger le contenu de Google Drive dans le runtime. Acceptez toutes les boîtes de dialogue de confirmation et accordez toutes les autorisations demandées.
  6. Exécutez les blocs de code 3 puis 4. Le bloc 3 prendra quelques minutes à terminer, alors assurez-vous que la coche verte est apparue avant de passer au 4.
  7. Ouvrez l’icône avec l’onglet du dossier à gauche de l’interface Colab. Les fichiers chargés dans le runtime s’affichent, y compris le contenu importé de Drive sous la forme /content/drive/MyDrive. Faites un clic droit sur le dossier contenant les images, copiez le chemin et collez-le dans la forme de saisie test_images du bloc de code 5. Assurez-vous qu’il ressemble à ceci : /content/drive/MyDrive/Imagefolder. De même, spécifiez un chemin d’accès pour la sortie de l’analyse (par exemple, /content/drive/MyDrive/Imagefolder/Output). Notez que les chemins d’accès dans cet environnement utilisent une barre oblique pour séparer les dossiers (/).
  8. Exécuter le bloc de code 5.
  9. Spécifiez l’extension exacte des images à analyser par le modèle sous la forme fournie du bloc de code 6. Aux fins de cette entrée, « .tif », « . TIF » et « .tiff » sont traités comme des extensions différentes.
  10. N’ajustez pas l’entrée batch_crop_img dans le bloc de code 6 si le système s’exécute dans le runtime GPU T4 par défaut (qui est fourni gratuitement à tous les utilisateurs pendant un nombre limité d’heures par jour, en fonction des niveaux d’utilisation). Réduisez-le si le runtime pose des problèmes de disponibilité de la mémoire.
  11. Exécuter le bloc de code 6. Cela prendra un certain temps, alors assurez-vous que la coche verte est apparue avant de continuer.
  12. Exécuter le bloc de code 7. N’ajustez pas ses entrées pour le runtime T4 par défaut, mais réduisez le nombre de sous-processus ou désactivez carrément le traitement parallèle si des problèmes de disponibilité de la mémoire apparaissent. Cela prendra également beaucoup de temps.
  13. Accédez à Google Drive dans une autre fenêtre ou un autre onglet du navigateur et accédez au dossier de sortie désigné dans la version 2.7.
    REMARQUE : À ce stade, SegElegans a terminé l’évaluation initiale et le post-traitement des segmentations et a créé plusieurs sous-dossiers avec des sorties. 0_summary résultats contiennent des graphiques résumant la sortie de chaque image, avec un numéro d’index attribué à chaque ver. 1_complete_mask contient les masques binaires organisés pour toutes les segmentations que l’algorithme a jugées bonnes pour l’analyse. 1_edge_small_mask contient des masques binaires pour toutes les segmentations que l’algorithme a décidé de rejeter car les animaux sont trop petits ou partiellement masqués au bord de l’image. 1_overlap_mask contient des masques binaires pour toutes les segmentations de vers qui présentaient des chevauchements réels et qui ne sont, par défaut, pas ajoutés à la sortie organisée. 1_all_rois_results contient les segmentations de TOUS les 3 types, quelle que soit la curation, au format ImageJ (fichiers zip avec ROI).
  14. À ce stade, choisissez l’une des trois options suivantes :
    1. Utilisez les retours sur investissement fournis dans 1_all_rois_results dans ImageJ et rejetez les retours indésirables après l’importation (voir protocole section 6).
    2. Acceptez les bons masques sélectionnés sans aucune correction manuelle (et sans inclure de vers qui se chevauchent) (passez à la version 2.16).
    3. Ajustez manuellement la curation en sélectionnant les vers (y compris ceux qui se chevauchent) à inclure dans la sortie (passez à la version 2.15).
  15. Afin d’ajuster manuellement la curation, utilisez le bloc de code 8. Examinez les résultats de la curation initiale à partir des graphiques récapitulatifs du dossier 0_summary résultats . Pour chaque image à corriger, entrez le nom complet (avec extension) de l’image d’entrée d’origine dans le formulaire « name_image_change » et les numéros des masques à conserver (à partir du graphique récapitulatif), séparés par des virgules dans le formulaire « index_images ». Exécuter le bloc de code 8. Répétez cette étape pour toute autre image qui nécessite une correction.
  16. Après la correction ou si les utilisateurs choisissent d’accepter la curation initiale sans corrections (et sans les vers qui se chevauchent), exécutez le bloc de code 9. Un nouveau sous-dossier appelé 2_curated_rois_results sera créé dans le dossier outputs de Google Drive. Il comprend toutes les segmentations finales au format ImageJ (fichiers zip avec ROI).
  17. Afin d’exécuter à nouveau le processus pour un autre dossier d’images, réinitialisez le runtime via le menu Runtime > Redémarrer la session et recommencez depuis le début.

3. Préparation de la version hors ligne de SegElegans avant la première utilisation

  1. Comme alternative à l’exécution de SegElegans en ligne sur Colab, une version hors ligne de SegElegans est disponible pour les utilisateurs qui ne peuvent pas ou préfèrent ne pas utiliser les services de cloud computing de Google. Cela nécessite un PC (Windows ou Linux) doté d’un GPU compatible CUDA (https://developer.nvidia.com/cuda-gpus) disposant d’au moins 6 Go de VRAM (bien que 16 soient recommandés s’ils sont disponibles et abordables).
    REMARQUE : Les instructions suivantes dans les sections 3 à 5 sont axées sur Windows, mais le logiciel peut également fonctionner sur des systèmes basés sur Linux avec quelques petites modifications dans les commandes utilisées.
  2. Téléchargez le programme d’installation de la boîte à outils CUDA à partir de https://developer.nvidia.com/cuda-downloads en suivant les instructions pour obtenir la version appropriée pour le périphérique utilisé.
    REMARQUE : SegElegans a été testé avec les versions 12.9 et 13.0 de la boîte à outils et la version 11 de CUDA sous Windows, mais les futures versions devraient conserver la rétrocompatibilité.
    1. Installez la boîte à outils en suivant les instructions de l’installateur lui-même. Visual Studio n’est pas nécessaire.
  3. Téléchargez la version appropriée de l’installateur Python pour l’appareil à partir de https://www.python.org/downloads/. Installez Python, en suivant les instructions de l’installateur lui-même et en vous assurant que python.exe est ajouté à PATH.
    REMARQUE : SegElegans a été construit et testé sur Python 3.13, mais les futures versions devraient conserver la rétrocompatibilité.
  4. Allez à https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOffline/releases/tag/v1 . Cliquez sur le lien Code source (zip) pour télécharger le paquet avec les fichiers nécessaires à la configuration et à l’exécution de SegElegans localement.
  5. Extrayez le fichier zip. Placez-le dans un dossier de haut niveau, voire de niveau supérieur, tel que C :\SegElegans. Le contenu du fichier zip se trouve déjà dans un sous-dossier SegElegansOffline-1.
  6. Ouvrez l’invite de commande Windows (cmd.exe). Tapez la commande python -m venv « fullsegeleganspath » où « fullsegeleganspath » est le chemin d’accès complet, entre guillemets, dans le sous-dossier SegElegansOffline-1 .
    REMARQUE : Par exemple, si le fichier zip a été extrait dans C :\SegElegans, le chemin complet est C :\SegElegans\SegElegansOffline-1 et la commande sera python -m venv « C :\SegElegans\SegElegansOffline-1 » . Notez que les chemins d’accès dans cet environnement utilisent une barre oblique inverse pour séparer les dossiers (« \ »).
  7. Dans l’invite de commande, utilisez les commandes standard pour naviguer dans le dossier SegElegansOffline-1 et exécutez la commande Scripts\activate. Une étiquette (SegElegansOffline-1) doit apparaître avant le curseur de l’invite suivante, indiquant que l’environnement Python est maintenant actif.
  8. À l’intérieur de l’environnement actif (SegElegansOffline-1), exécutez la commande pip install -r requirements.txt . Le processus prendra un certain temps.
  9. Entrez et exécutez la commande python assemblenetworks.py .
    REMARQUE : SegElegans est maintenant prêt à fonctionner. Deux façons d’y parvenir sont fournies : un script rapide qui fournira automatiquement toutes les segmentations sous forme de ROI ImageJ sans la possibilité de corriger manuellement la curation (section 4), et un notebook Jupyter local qui fournira la possibilité de présenter et de corriger la curation (section 5). Cette dernière approche est recommandée pour la plupart des utilisateurs.

4. Exécuter la version hors ligne de SegElegans avec un script rapide

  1. Ouvrez l’invite de commande Windows (cmd.exe). Comme décrit à l’étape 3.7, accédez au dossier d’environnement SegElegans et activez-le.
  2. Afin d’utiliser le script rapide, dans l’invite de commande avec l’environnement actif (SegElegansOffline-1), entrez et exécutez la commande python SegElegansBodyQuickEval.py -i « pathtoinputfolder » -x où « pathtoinputfolder » est le chemin complet, entre guillemets, vers le dossier contenant les images en fond clair (par exemple « D :\Data\Experiment12365\Condition 1 ») et est l’extension de fichier précise des images que les utilisateurs souhaitent analyser (Exemple « . TIF"). Tapez la commande python SegElegansBodyQuickEval.py -h pour obtenir des instructions sur les paramètres supplémentaires qui peuvent être modifiés pour accélérer le traitement par le script si l’appareil peut le gérer.
    REMARQUE : Dans ce cas, le dossier de sortie sera créé à l’intérieur du dossier d’entrée (donc pour l’exemple ci-dessus : « D :\Data\Experiment12365\Condition 1\Output »). À l’intérieur, il y a une série de sous-dossiers. 0_summary résultats contiennent des graphiques résumant la sortie de chaque image, avec un numéro d’index attribué à chaque ver. 1_complete_mask contient les masques binaires organisés pour toutes les segmentations non chevauchantes que l’algorithme a jugées bonnes pour l’analyse. 1_edge_small_mask contient des masques binaires pour toutes les segmentations que l’algorithme a décidé de rejeter car les animaux sont trop petits ou partiellement masqués au bord de l’image. 1_overlap_mask contient des masques binaires pour toutes les segmentations de vers qui présentaient des chevauchements réels. 1_all_rois_results contient les segmentations de TOUS les 3 types, quelle que soit la curation, au format ImageJ (fichiers zip avec ROI). Comme il n’y a pas de moyen de corriger manuellement la curation ici, 2_curated_rois_results inclut par défaut toutes les segmentations jugées bonnes par l’algorithme ET toutes les segmentations qui se chevauchent au format ImageJ (fichiers zip avec ROI).

5. Exécuter la version hors ligne de SegElegans avec un notebook Jupyter

  1. Ouvrez l’invite de commande Windows (cmd.exe). Comme décrit à l’étape 3.7, accédez au dossier d’environnement SegElegans et activez-le.
  2. Pour utiliser l’interface Jupyter, dans l’invite de commande avec l’environnement actif (SegElegansOffline-1), entrez et exécutez la commande jupyter notebook. Cela ouvrira une fenêtre/un onglet de navigateur Web avec un site hébergé localement. Dans l’écran initial, sélectionnez le fichier SegElegansOfflineJupyterInterface.ipynb.
  3. Exécutez le code dans le bloc de code 1 en le sélectionnant (cliquez à gauche à l’extérieur du code réel) et en appuyant sur le bouton play (figure-protocol-2) de la barre d’outils ci-dessus. Un message de confirmation apparaîtra sous le bloc de code lorsque l’exécution sera terminée.
  4. Exécuter le bloc de code 2. Cela générera des formulaires de saisie dans la lecture sous le bloc de code. Remplissez les formulaires générés avec le chemin d’accès au dossier d’entrée contenant les images en fond clair (Exemple : « D :\Data\Experiment12365\Condition 1 »), le chemin souhaité pour la sortie de l’analyse (Exemple : « D :\Data\Experiment12365\Condition 1\Output »), et l’extension de fichier précise des images à analyser (Exemple « ). TIF"). Ajustez les paramètres supplémentaires fournis (augmentez le nombre de sous-cultures par lot à 9 ou 16 et exécutez plusieurs processus parallèles de post-traitement) si l’appareil est suffisamment capable.
  5. Exécuter le bloc de code 3.
  6. Exécuter le bloc de code 4. Cela prendra un certain temps, alors assurez-vous qu’il est complet avant de continuer.
  7. Exécuter le bloc de code 5. Encore une fois, cela prendra un certain temps. Après cela, accédez au dossier de sortie désigné ci-dessus.
    REMARQUE : À ce stade, SegElegans a terminé l’évaluation initiale et le post-traitement des segmentations et a créé plusieurs sous-dossiers avec des sorties. 0_summary résultats contiennent des graphiques résumant la sortie de chaque image, avec un numéro d’index attribué à chaque ver. 1_complete_mask contient les masques binaires organisés pour toutes les segmentations que l’algorithme a jugées bonnes pour l’analyse. 1_edge_small_mask contient des masques binaires pour toutes les segmentations que l’algorithme a décidé de rejeter car les animaux sont trop petits ou partiellement masqués au bord de l’image. 1_overlap_mask contient des masques binaires pour toutes les segmentations de vers qui présentaient des chevauchements réels et qui ne sont par défaut pas ajoutés à la sortie organisée. 1_all_rois_results contient les segmentations de TOUS les 3 types, quelle que soit la curation, au format ImageJ (fichiers zip avec ROI).
  8. Comme pour la version en ligne de SegElegans, utilisez l’une des trois options répertoriées ci-dessous :
    1. Utilisez les retours sur investissement fournis dans 1_all_rois_results dans ImageJ et rejetez les retours indésirables après l’importation (voir protocole section 6).
    2. Acceptez les bons masques sélectionnés automatiquement sans aucune correction manuelle (et sans inclure de vers qui se chevauchent) (passez à l’étape 5.11).
    3. Ajustez manuellement la curation en sélectionnant les vers (y compris ceux qui se chevauchent) à inclure dans la sortie (passez à l’étape 5.9).
  9. Afin d’ajuster manuellement la curation, utilisez les blocs de code 6 et 7. Exécutez d’abord 6. Cela créera des formulaires de saisie dans l’affichage sous le code.
  10. Examinez les résultats de la curation initiale à partir des graphiques récapitulatifs du sous-dossier 0_summary résultats . Pour chaque image à corriger, entrez le nom complet de l’image INPUT (avec extension) dans le formulaire Image à corriger : et les numéros des masques à conserver (à partir du graphique récapitulatif) séparés par des virgules dans le formulaire Masques à conserver :. Exécutez le bloc de code 7 et assurez-vous que l’exécution est terminée. Répétez cette étape pour toute autre image qui nécessite une correction.
  11. Une fois la correction de curation terminée ou si les utilisateurs choisissent d’accepter la curation initiale sans corrections (et sans les vers qui se chevauchent), exécutez le bloc de code 8. Un nouveau sous-dossier sera créé dans le dossier des sorties désigné, appelé 2_curated_rois_results. Il comprend toutes les segmentations finales au format ImageJ (fichiers zip avec ROI).
  12. Afin d’exécuter à nouveau le processus pour un autre dossier d’images, réinitialisez le runtime via le menu Noyau > Redémarrer le noyau et Effacer les sorties de toutes les cellules et recommencer depuis le début.

6. Importer les segmentations dans ImageJ (ou alternatives)

  1. Ouvrez l’une des images de données réelles sur ImageJ.
  2. Ouvrez le fichier zip correspondant avec les ROI de cette image. Cela chargera les sélections dans le gestionnaire de retour sur investissement ImageJ. S’il s’agit d’un retour sur investissement de la sortie 2_curated_rois_results , ils sont prêts à être analysés avec les méthodes souhaitées normalement utilisées (de préférence avec l’utilisation de macros pour automatiser et accélérer davantage le processus).
  3. S’il s’agit d’un retour sur investissement de la sortie 1_all_rois_results , supprimez les segmentations indésirables du gestionnaire de retour sur investissement. Sélectionnez-les et appuyez sur le bouton Supprimer dans la fenêtre du gestionnaire elle-même. N’appuyez pas sur la touche Suppr du clavier, car cela supprimerait le contenu de la sélection dans l’image.
  4. Si un logiciel autre qu’ImageJ est nécessaire pour l’analyse, le format ROI ne sera probablement pas compatible. Dans ce cas, importez des segmentations sous la forme universellement utilisée de masques binaires, qui sont fournies dans les dossiers 1_complete_mask et 1_overlap_mask . Consultez les instructions du logiciel récepteur pour savoir comment effectuer cette importation.

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Résultats

En suivant ce protocole, les chercheurs devraient être en mesure d’extraire des segmentations de vers de haute qualité, même pour l’analyse d’images de fluorescence sans bordures de vers visibles. Comme nous l’avons vu dans la section 6 du protocole, ces segmentations peuvent être importées directement dans ImageJ et utilisées pour la mesure rapide de propriétés pertinentes telles que l’intensité des rapporteurs fluorescents (couramment utilisés pour la quantification de l’expression) ou...

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Discussion

La méthodologie présentée ici devrait permettre aux utilisateurs d’analyser les expériences de microscopie de C. elegans dans un délai nettement plus rapide sans aucune perte de précision. Comme il extrait des segmentations à partir d’images-guides en fond clair indépendamment de la fluorescence réelle (comme discuté dans la section 1 du protocole), il peut être utilisé avec n’importe quelle souche et pour toute application nécessitant de mesurer les phénotypes par ver. Il peut ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Les travaux dans le laboratoire des auteurs sont financés par le Secrétariat général pour
Recherche et Innovation du Ministère grec du Développement,
Union européenne - NextGenerationEU (code du projet : TAEDR-0535850, acronyme :
BrainPrecision) dans le cadre de l’action « Actions phares en
Domaines scientifiques interdisciplinaires présentant un intérêt particulier pour la connexion
au tissu productif », dans le cadre du Programme national pour la reprise et la résilience
Plan « Grèce 2.0 », l’Agence exécutive de la recherche de la Commission européenne
Pôle d’excellence « CHAngeing » (GA-101087071) et la Fondation hellénique
pour la Recherche et l’Innovation (H.F.R.I.) dans le cadre du « 1er Appel à projets H.F.R.I.
Projets de recherche visant à soutenir les membres du corps professoral et les chercheurs
l’acquisition d’équipement de recherche coûteux » (numéro de projet :
HFRI-FM17C3-0869, NeuroMitophagie).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Ordinateur avec accès Internet (exemple : Dell Vostro Desktop)Plusieurs (Dell par exemple)  ;-Cela permettra de faire fonctionner SegElegans en ligne via le cloud computing comme recommandé et en utilisant des logiciels d’analyse d’images tels qu’ImageJ.
Unité de traitement graphique compatible CUDA avec au moins 6 Go de VRAM (exemple : MSI Geforce RTX  ; RTX3050 Ventus 2X 6 Go) (Optionnel)NVIDIA + plusieurs fabricants (Micro Star International par exemple)https://developer.nvidia.com/cuda-gpusCela permettra d’exécuter des SegElegans hors ligne sur une machine locale.
les chipsets GPU compatibles CUDA sont disponibles ici :
https://developer.nvidia.com/cuda-gpus
La VRAM dépend de l’implémentation réelle du chipset dans un GPU par le fabricant.
AVERTISSEMENT : Vous aurez besoin d’une carte CUDA coûteuse et puissante, bien au-delà des exigences minimales (16+ Go de VRAM) pour égaler les performances obtenues par la version cloud computing.
Microscope à épifluorescence (Invitrogen EVOS FL Auto 2)ThermoFisher Scientific & nbsp ;AMAFD2000 par exempleNous recommandons d’utiliser un système capable d’acquérir automatiquement des images à partir de champs lumineux et d’un ou plusieurs canaux de fluorescence presque simultanément.
ImageJ (Optionnel)NIHhttps://imagej.net/software/fiji/downloadsNous recommandons la distribution fidjienne, disponible ici :
https://imagej.net/software/fiji/downloads
PC compatible GPU NVIDIA (exemple : Dell Vostro Desktop) (optionnel) & nbsp ;Plusieurs (Dell par exemple)  ;-Cela est nécessaire en conjonction avec le GPU pour faire tourner des SegElegans hors ligne sur une machine locale.
Un GPU nécessitera du matériel compatible Windows avec les emplacements PCI appropriés sur la carte mère, de la place pour la carte et une alimentation suffisamment puissante.
SegElegans-https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOnline/tree/v1.0  ;Voir le manuscrit pour les instructions complètes.

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