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Article de méthode

Isolement et purification des cardiomyocytes adultes de souris par perfusion de Langendorff et sédimentation gravitationnelle

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DOI :

10.3791/69102

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31 mars 2026

 ,  , 
1Deqing People's Hospital, 2School of Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, 3Anesthesiology Department, Shanxi Provincial People's Hospital Affiliated Shanxi Medical University

Dans cet article

Résumé

Cette étude vise à optimiser et à rationaliser la procédure d’extraction des cardiomyocytes de souris adultes, dans le but ultime d’améliorer les méthodologies de recherche sur les maladies cardiovasculaires. Ce protocole permet d’obtenir efficacement des cardiomyocytes à haute viabilité et pureté dans un temps de traitement réduit, permettant des expérimentations plus fiables et accélérant les avancées thérapeutiques.

Résumé

Les maladies cardiovasculaires restent un défi majeur pour la santé mondiale, créant un besoin crucial de modèles in vitro fiables. Cette étude présente un protocole optimisé pour l’isolement et la culture des cardiomyocytes adultes de souris afin de répondre aux limites de faible viabilité et de contamination non cardiomyocytaire dans les méthodes existantes. Le protocole repose sur la perfusion de Langendorff rétrograde, utilisant l’héparine sodique pour l’anticoagulation et employant seule la collagénase de type II (1,2 mg/mL) pour la digestion. Les cardiomyocytes étaient purifiés par sédimentation gravitationnelle et cultivés sur des surfaces recouvertes de laminine. Cette méthode a constamment donné 8,75 ± 0,36 × 105 cardiomyocytes par cœur avec une forte proportion de cellules en forme de bâtonnet (91,2 % ± 2,11 %), et une haute pureté (le pourcentage de cellules cTNT⁺DAPI⁺ par rapport aux cellules DAPI⁺ était d’environ 97,47 % ± 1,365 %), qui présentait des structures sarcomériques claires. En fournissant une méthode standardisée et reproductible pour obtenir des cardiomyocytes adultes de haute qualité, ce protocole comble efficacement le fossé entre les études in vitro et la pertinence physiopathologique, soutenant ainsi la recherche cardiovasculaire avancée.

Introduction

Les maladies cardiovasculaires restent la principale cause de mortalité dans lemonde 1. Les cardiomyocytes, en tant que centre de la recherche cardiaque, ont longtemps servi d’outils essentiels pour l’étude de la physiologie et de la pathologiecardiaques 2. Bien que les lignées cellulaires de cardiomyocytes disponibles dans le commerce et les cardiomyocytes humains dérivés des cellules souches pluripotentes récemment popularisés (hPSC-CM) offrent des avantages plus importants en termes d’accessibilité et de facilité de manipulation 3,4,5, les cardiomyocytes primaires isolés ex vivo démontrent une corrélation structurelle et fonctionnelle supérieure avec les mécanismes physiologiques et pathologiques cardiaques. Par conséquent, maîtriser les techniques d’isolement in vitro des cardiomyocytes est d’une importance capitale.

Les cardiomyocytes présentent des transformations morphologiques et fonctionnelles distinctes tout au long du développement. Notamment, ces cellules conservent leur potentiel prolifératif pendant le développement embryonnaire et la période néonatale (dans les 7 jours suivant la naissance), mais cette capacité régénératrice est définitivement perduepar la suite 6. Par maturation postnatale, les cardiomyocytes subissent un remodelage morphologique important, acquérant finalement leur phénotype adulte caractéristique à l’âge de 2 mois – présentant une morphologie en forme de bâtonnet et une structure sarcomérique trèsorganisée 7,8. Ces caractéristiques dépendantes du stade du développement soulignent l’importance cruciale d’utiliser les cardiomyocytes adultes de souris pour les études mécanistes de la physiopathologie cardiaque.

L’acquisition fiable de cardiomyocytes à haute fidélité, en particulier des cellules d’origine adulte qui imitent fidèlement la physiologie cardiaque humaine, est essentielle pour faire avancer ce domaine. Les protocoles d’isolement actuels pour les cardiomyocytes murins adultes rencontrent plusieurs défis persistants : (i) viabilité cellulaire compromise, (ii) caractéristiques de population hétérogènes, et (iii) procédures techniquement exigeantes – qui entravent collectivement les progrès dela recherche 9,10. Cela souligne l’urgence d’optimiser les méthodologies d’isolation afin d’obtenir à la fois un rendement et une pureté accrus, fournissant ainsi des plateformes cellulaires plus physiologiquement pertinentes pour l’investigation des maladies cardiovasculaires.

Grâce à l’optimisation systématique des paramètres de perfusion, des protocoles de digestion enzymatique et des formulations de réactifs, cette étude a permis d’établir avec succès une méthodologie améliorée pour isoler et cultiver les cardiomyocytes murins adultes. Le protocole optimisé délivre des cardiomyocytes avec une intégrité morphologique bien préservée, caractérisés par des rapports élevés en forme de bâtonnet et des structures sarcomériques clairement visibles. Ces avancées offrent une plateforme expérimentale solide pour une investigation approfondie de la physiopathologie cardiomyocytaire, facilitant de manière significative la recherche sur les maladies cardiovasculaires axée sur les mécanismes cellulaires myocardiques.

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Protocole

Toutes les procédures animales de cette étude ont été strictement réalisées conformément aux directives du Comité de soins et d’utilisation des animaux institutionnels (IACUC) approuvées par le Comité d’éthique de l’Hôpital Populaire de Deqing. L’étude utilisait des souris mâles C57BL/6 âgées de 8 à 12 semaines achetées auprès de GemPharmatech Co., Ltd. Tous les animaux étaient hébergés dans des installations barrières de qualité SPF avec des paramètres environnementaux respectant les normes nationales (température ambiante 22 ± 2 °C, humidité relative 50 ± 10 %, cycle lumière/obscurité de 12/12 heures). Tout au long des expériences, cette étude a rigoureusement respecté les principes « 3R » (Remplacement, Réduction, Affinement) et a mis en œuvre des procédures standard, incluant l’anesthésie et l’analgésie afin de minimiser la souffrance animale.

REMARQUE : En résumé, le cœur intact est rapidement excisé de la cavité thoracique murine et soumis à une perfusion rétrograde avec une solution de collagénase de type II via l’appareil de Langendorff pour digérer enzymatiquement la matrice extracellulaire. Après une digestion complète des tissus, le myocarde ramolli est soigneusement dissocié en une suspension unicellulaire. La suspension cellulaire résultante est filtrée séquentiellement pour éliminer les fragments de tissu non digérés, suivie d’une sédimentation gravitationnelle pour enrichir des cardiomyocytes viables. Les cardiomyocytes purifiés peuvent ensuite être utilisés pour des applications expérimentales ultérieures.

1. Préparation du dispositif de perfusion Langendorff

REMARQUE : Le système Langendorff a un volume total de tubes de 15,5 mL. Le débit de perfusion est de 3,5 mL/min pour la perfusion cardiaque et de 10-15 mL/min pour le rinçage du système.

  1. Rincer le système de perfusion Langendorff avec 50 mL d’éthanol à 75 %.
    REMARQUE : Effectuez un nettoyage mensuel des tubes en verre avec 1 M HCl pour assurer la stérilité.
  2. Rincez avec 250 mL de ddH2Ostérile pour éliminer les résidus d’éthanol et éliminer les bulles d’air.
  3. Réglez la température du bain-marie à 42 °C. Allumez la pompe pour initier le chauffage circulant et remplissez la cavité externe du tube serpentine avec de l’eau tiède.
    REMARQUE : Cela garantit que la perfusée atteint le cœur à 37 °C.

2. Préparation des tampons

  1. Préparez le tampon de solution de Krebs-Bicarbonate (KB), le tampon de perfusion (PB), le tampon de digestion (DB), le milieu de placage des myocytes (MPM) et le milieu de culture des myocytes (MCM) selon les formulations listées dans le tableau 1.
    REMARQUE : Préparez frais le jour de l’utilisation.
  2. Prérefroidissez 10 mL de tampon KB sur glace.
  3. Remplissez la lumière avec du PB. Réglez le débit à 3,5 mL/min et mesurez la température de l’effluent (37 °C est optimal).
  4. Flushez 7 mL de DB dans la canalisation, puis fermez la ligne de perfusion.
  5. Préparez une solution d’héparine sodique (0,5 %, 62,5 KU) et chargez 300 μL dans une seringue d’insuline.
  6. Ajoutez 10 mL de beurre de cacahuète et 10 mL de KB dans deux boîtes de Petri séparées et pré-refroidissez sur glace.
  7. Placez une passoire à cellules de 100 μm sur le couvercle d’un tube centrifugeuse de 50 mL, pré-humidifiez-le avec 1 mL de KB, puis fixez-le sur un tube centrifugeuse de 50 mL.

3. Extraction et canulation cardiaques

REMARQUE : Dans ce protocole, des gants stériles, des instruments, de la gaze et des tige-cotons ont été utilisés tout au long de la procédure afin de minimiser la contamination externe. Bien que la technique aseptique complète soit essentielle pour la culture cellulaire primaire, elle servait ici à soutenir le bien-être animal et l’intégrité des tissus pour les analyses histologiques et moléculaires ultérieures, plutôt que de maintenir la stérilité pour l’isolement cellulaire.

  1. Anesthésiez la souris par injection intrapéritonéale de 80 mg/kg de pentobarbital sodium (de qualité pharmaceutique) combinée à 5 UI/g d’héparine sodique de poids corporel. Surveillez de près jusqu’à ce qu’une anesthésie profonde soit obtenue. Pincez les orteils de la souris et observez la disparition du réflexe de pincement pour confirmer le succès de l’anesthésie.
  2. Enlever les poils thoraciques à l’aide d’une crème dépilatoire.
  3. Fixez la souris sur une plaque en mousse et désinfectez la peau de la poitrine avec de l’alcool à 75 %.
  4. Soulevez la peau thoracique avec une pince et faites une incision au niveau du processus xiphoïde.
  5. Élever le xiphoïde et couper les côtes bilatéralement vers les régions axillaires, puis transpercer complètement le diaphragme.
    REMARQUE : Évitez d’endommager le cœur.
  6. Immobilisez le sternum et les côtes à l’aide de pinces hémostatiques pour exposer complètement le cœur.
  7. Absorbez le sang et déplacez doucement le foie vers les membres postérieurs avec du tissu. Utilisez soigneusement des cotons-tiges pour manipuler le cœur afin d’exposer la veine cave inférieure.
  8. Injectez 300 μL de solution d’héparine sodique (de l’étape 2.5) dans la veine cave inférieure à l’aide de la seringue d’insuline préparée.
    REMARQUE : Veillez à éviter l’introduction de bulles d’air.
  9. Exciser le tissu thymique, puis sectionner les veines et artères environnantes. Transférez immédiatement le cœur dans un tampon de PB pré-refroidi (à partir de l’étape 2.6).
    REMARQUE : L’ablation du thymus améliore la visibilité aortique. Préserver un segment aortique lors de l’excision. La contraction myocarde a été ralentie par une solution de PB pré-refroidie. L’excision cardiaque sous anesthésie permet une euthanasie humaine.
  10. À l’aide d’une microforceps, saisir l’aorte et la monter sur la canule du système de perfusion de Langendorff. Sécuriser avec une suture en soie 5-0.
    REMARQUE : Effectuez cette étape rapidement. Assurez-vous que le système de perfusion est éteint lors du montage du cœur.

4. Perfusion cardiaque

  1. Activez le système de perfusion et lancez le chronométrage pendant 2 minutes et 30 secondes. Pendant cette période, l’effluent est constitué d’un tampon PB et ne nécessite pas de collecte.
  2. À la fin de l’intervalle de 2 minutes et 30 secondes, commencez à collecter et à recirculer le tampon de la base de données tout en chronométrant 15 minutes.
    REMARQUE : Surveillez l’état myocardique – une digestion optimale s’explique par une réduction de l’élasticité tissulaire et une translucidité accrue. Si la digestion semble incomplète, la durée peut être modérément prolongée, mais ne doit pas dépasser 20 minutes au total pour éviter les dommages des cardiomyocytes.
  3. Après la période chronométrée, passez du tampon DB au PB et poursuivez la perfusion pendant 4 minutes et 30 secondes supplémentaires. L’effluent durant cette phase contient un tampon DB ; Récupérez-le.
  4. Interrompez la perfusion en éteignant le système après le dernier intervalle de synchronisation.

5. Dissociation et purification cellulaire

  1. Retirez le cœur de la canule et transférez-le dans le tampon KB pré-refroidi (préparé à l’étape 2.6).
    REMARQUE : La digestion enzymatique a été interrompue par le transfert immédiat du cœur dans le tampon KB. Cela dilue rapidement l’enzyme résiduelle, empêchant la surdigestion et assurant une forte viabilité cellulaire.
  2. À l’aide de ciseaux fins, exciser soigneusement les tissus auriculaires et aortiques, en ne conservant que le myocarde.
  3. Dissociez mécaniquement le tissu myocardique en petits fragments (<1 mm3) à l’aide de microforceps.
  4. Soufflez doucement les fragments de tissu à l’aide d’un compte-gouttes de 2 mL pour obtenir une suspension unicellulaire.
    REMARQUE : Faites preuve d’une extrême prudence lors du soufflage pour préserver la morphologie cardiomyocytaire en forme de tige. Évitez d’utiliser des pointes de pipette standard, car leur ouverture étroite peut perturber mécaniquement l’intégrité cellulaire.
  5. Filtrez la suspension à cellules résultante à travers la tamoire de cellules 100 μm pré-humidifiée (assemblée à l’étape 2.7) dans un tube de 50 mL.
  6. Transférez la suspension filtrée dans un tube de 15 mL et laissez les cardiomyocytes se déposer par sédimentation gravitationnelle (15 min, 4 °C).
    REMARQUE : La surface basale réduite des tubes de 15 mL améliore considérablement l’efficacité de la récupération cellulaire par rapport aux tubes de 50 mL.
  7. Aspirez soigneusement le surnageant, resuspendez les cardiomyocytes en pellets dans 10 mL de tampon KB glacé à l’aide d’une pipette de transfert de 2 mL, puis répétez la sédimentation (15 min, 4 °C).
  8. Répétez les étapes 5.4-5.7 pour obtenir une préparation purifiée de cardiomyocytes intacts en forme de tige adaptés aux applications.

6. Culture cellulaire

  1. Enrobez les plats de culture avec 10 μg/mL de laminine et incubez à 37 °C pendant 2 heures.
    REMARQUE : Pour minimiser les dommages mécaniques aux cardiomyocytes en forme de bâtonnet et réduire le temps de traitement prolongé associé au placage différentiel, cette étude a utilisé un revêtement laminin au lieu du placage différentiel, une stratégie qui non seulement améliore l’efficacité de l’attache cellulaire mais préserve également les caractéristiques physiologiques natives des cardiomyocytes.
  2. Resuspendez les cardiomyocytes dans 4 mL de MPM préchauffé (37 °C). Après avoir retiré la solution de laminine, semez les cardiomyocytes dans les plats enduits. Incubez à 37 °C avec 2 % de CO2 pendant 1 heure. Observez la morphologie, la taille et la densité cellulaires au microscope.
  3. Après l’incubation, décantez soigneusement le MPM et remplacez-le par un MCM préchauffé (37 °C). Maintenir l’incubation à 37 °C avec 2 % deCO2 pendant 24 heures.
  4. Après 24 heures, examinez les cardiomyocytes pour l’intégrité structurelle et la morphologie.
    REMARQUE : Maintenez une technique aseptique stricte tout au long de la procédure.
    ATTENTION : La collagénase de type II peut provoquer des allergies respiratoires, des irritations cutanées et oculaires. Veillez à opérer dans un endroit bien ventilé et à éviter d’inhaler de la poussière ni de toucher la peau et les muqueuses. Tous les tissus cardiaques de souris jetés, échantillons de sang et tout matériel jetable ayant été en contact avec eux doivent être collectés comme déchets biohazardés dans des contenants dédiés et étanches marqués du symbole de danger biologique. Ces matériaux sont ensuite soumis à des procédures centralisées de décontamination et d’élimination.

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Résultats

La procédure d’isolement et de culture des cardiomyocytes adultes de souris est illustrée dans le protocole, avec l’instrumentation requise et la configuration des tubes illustrées à la Figure 1. L’évaluation morphologique a révélé que les cardiomyocytes fraîchement isolés, ainsi que ceux cultivés pendant 1 h et 24 h, présentaient tous une morphologie caractéristique en forme de bâtonnet ou fusiforme avec des stries clairement visibles (Figures 2A-C<...

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Discussion

Cette étude constitue une avancée méthodologique significative dans la recherche cardiovasculaire en établissant un protocole optimisé pour l’isolement et la culture des cardiomyocytes chez la souris adulte. Grâce à un raffinement systématique de la composition tampon et des paramètres de digestion enzymatique, cette approche améliore considérablement la fiabilité du système de culture tout en améliorant à la fois la pureté et la viabilité des cardiomyocytes. Ces avancées techniques offr...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Nous remercions chaleureusement le soutien financier apporté par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 82400312).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
BDMAladdin Scientific Corporation, Shanghai, ChineD111028
BSAAladdin Scientific Corporation, Shanghai, ChineB265994
C57BL/6 souris   ;GemPharmatech Co., Ltd8&ndash ; Garçon de 12 semaines  ;
CaCl2Aladdin Scientific Corporation, Shanghai, ChineC431202
Collagénase de type IIWorthington Biochemical Corporation (États-Unis)LS004176LOT# :43D23502  ;   ; Unités d’activité enzymatique : 270u/mg dw
FBSBeyotime Biotechnology, ChineC0226
GlucoseAladdin Scientific Corporation, Shanghai, ChineD639737
HEPESSigma-AldrichH7006
KClAladdin Scientific Corporation, Shanghai, ChineP112134
KH2PO4Aladdin Scientific Corporation, Shanghai, ChineP104075
L-glutamineThermo Fisher Scientific25030081
MEMThermo Fisher Scientific11095080
MgSO4Aladdin Scientific Corporation, Shanghai, ChineM116444
Na2HPO4Aladdin Scientific Corporation, Shanghai, ChineS274390
NaClAladdin Scientific Corporation, Shanghai, ChineC111547
NaH2PO4Aladdin Scientific Corporation, Shanghai, ChineS108339
NaHCO3Aladdin Scientific Corporation, Shanghai, ChineS112338
Pénicilline-streptomycine (100x)Beyotime Biotechnology, ChineC0222
Microscope primovert en culture cellulaire inversée   ;Carl Zeiss
TaurineAladdin Scientific Corporation, Shanghai, ChineT103829

Références

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