Le test sur les tissus animaux utilise la détection par scintillation nucléaire pour déterminer l’activité enzymatique de la glycogène synthase en mesurant l’incorporation du glucose radiomarqué dans le glycogène.
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Article de méthode
Évaluation radiochimique de l’activité de l’enzyme glycogène synthase dans les tissus animaux
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le glycogène est un métabolite important pour de nombreuses cellules eucaryotes, essentiel au stockage et à la libération rapide de l’énergie. La construction de la molécule dépend de la glycogène synthase, une enzyme hautement régulée dont la fonction principale est de faciliter la fixation séquentielle des unités de glucose dans un polymère de glycogène en croissance. Cette enzyme est activée allostériquement par le glucose-6-phosphate et inhibée à plusieurs endroits par phosphorylation. La connaissance de l’activité enzymatique de la glycogène synthase est un élément clé de la compréhension du métabolisme du glycogène, des niveaux d’énergie musculaire et des troubles métaboliques tels que le diabète et les maladies de stockage du glycogène. Il s’agit d’une méthode très sensible et efficace pour déterminer l’activité de la glycogène synthase dans les tissus musculaires animaux en mesurant la quantité de glucose intégré, à partir de [14C]-UDP-glucose radiomarqué, dans des molécules de glycogène. Cette procédure utilise du 14Cradioactif et nécessitera l’autorisation appropriée et un espace de laboratoire pour l’utilisation et l’élimination. Cette procédure nécessitera également l’accès à un compteur à scintillation liquide.
Introduction
Le glycogène, un polysaccharide hautement ramifié composé d’unités de glucose, sert de réserve d’énergie importante dans divers tissus, notamment les muscles, le foie et le cerveau1. Sa synthèse et sa dégradation sont orchestrées par un système complexe d’enzymes spécialisées et de protéines régulatrices. L’enzyme glycogène synthase (GYS), dont il existe deux isoformes (GYS1 et GYS2), est essentielle à sa biosynthèse. GYS1 est une enzyme régulatrice directement responsable de la création de glycogène à partir du glucose dans les cellules non hépatiques, tandis que GYS2 fonctionne dans le foie. Ce processus, connu sous le nom de glycogenèse, est l’ajout séquentiel d’une unité individuelle de glucose à une chaîne de glycogène en croissance. Le GYS catalyse le transfert du glucose de l’intermédiaire uridine diphosphate glucose (UDP-glucose) à l’extrémité d’une chaîne glycogène, créant ainsi une liaison alpha-1,4-glycosidique2. En coordination avec l’enzyme de ramification du glycogène, cette réaction étend les molécules de glycogène, fournissant à la fois un stockage et une libération d’énergie efficaces.
Des techniques de dosage existent pour mesurer l’activité de l’enzyme, l’un des groupes de méthodes les plus courants étant constitué de celles de la variété spectrophotométrique 3,4. Ces tests reposent généralement sur un système de réactions couplées indirectes et mesurent l’absorbance du produit en aval, le NADH, à 340 nm. Une unité de NADH est consommée pour chaque unité d’UDP libérée de l’UDP-glucose par la glycogène synthase, produisant une excitation mesurable qui est directement corrélée à l’activité de la glycogène synthase 5,6. Bien que les tests de spectrophotométrie soient relativement peu coûteux et accessibles, ils présentent l’inconvénient mineur de s’appuyer sur une réaction indirecte et des inconvénients majeurs d’interférence par la turbidité de l’échantillon et une sensibilité plus faible, en particulier un problème pour les échantillons plus petits ou les échantillons avec de la glycogène synthase peu ou fortement phosphorylée. Des tests fluorométriques, utilisant les réactions couplées décrites ci-dessus, ont été mis au point pour améliorer la sensibilité des tissus musculaires de l’homme7 et de la souris8. D’autres techniques existent pour quantifier la glycogène synthase, telles que l’immunoblot9 et l’immunohistochimie10 ; Cependant, ces techniques ne sont capables de quantifier que la quantité physique d’enzyme et, au mieux, peuvent déduire l’activité de la phosphorylation, mais pas quantifier directement l’activité enzymatique11.
Parmi ces techniques de dosage enzymatique, les méthodes radiochimiques restent les plus largement utilisées pour déterminer l’activité de la glycogène synthase dans les tissus de mammifères en raison de leur absence d’interférence par la turbidité de l’échantillon et de leur grande sensibilité 8,9. Ces tests incorporent du glucose radiomarqué à partir d’UDP-glucose marqué avec 14C12 ou 3H13 dans le glycogène, ce qui permet de mesurer directement l’activité enzymatique sur une période de temps déterminée. Dans la procédure suivante, un échantillon de tissu contenant de la glycogène synthase est exposé à l’UDP-glucose et à l’amorce de glycogène. La glycogène synthase catalyse la réaction indiquée dans l’équation ci-dessous :
UDP-[14C]glucose + (glycogène)n → (glycogène)n+1[14C] + UDP
Après un certain temps, la réaction est terminée et le glycogène contenant du glucose radiomarqué est soit précipité sur du papier filtre12 (comme décrit ci-dessous), soit soumis à une filtration sur gel telle que décrite par Niederwanger et al.14 et mesuré à l’aide d’un détecteur à scintillation. Cette méthode comprend également une réaction identique distincte qui comprend le glucose-6-phosphate (G6P), un activateur allostérique de la glycogène synthase. Dans des conditions où les niveaux de G6P sont suffisants, l’activité de la glycogène synthase est activée au maximum, ce qui met en évidence le potentiel absolu d’activité de la glycogène synthase d’un échantillon donné. La méthode décrite ici a été modifiée de Suzuki et ses collègues15 à un format de 96 puits et est optimisée pour une utilisation dans le tissu musculaire de la souris ; Cependant, le protocole peut être modifié pour d’autres tissus et espèces animales.
Malgré les considérations inhérentes au coût et à la sécurité associées aux matières radioactives, les essais radiochimiques offrent des avantages importants par rapport aux solutions de rechange non radioactives, à condition que des instruments soient disponibles. La procédure suivante détaille un moyen très sensible et robuste de déterminer l’activité de la glycogène synthase, une enzyme clé dans le métabolisme du glycogène, dans les tissus musculaires animaux.
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Protocole
Toutes les procédures ont été approuvées par le comité de protection et d’utilisation des animaux de l’Université Ball State. Cohortes masculines et féminines de B6 ; Des souris sauvages 129-Gaatm1Rabn/J, âgées de 3 mois, sont utilisées comme exemple représentatif dans ce manuscrit. Les réactifs et l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.
1. Préparation avant le dosage
- Prélever les tissus par luxation cervicale16 et les congeler immédiatement dans le N2 liquide pour préserver les réserves de glycogène et les conserver dans du N2 liquide ou un congélateur à très faible teneur jusqu’au début du test.
- Préparer les solutions mères avant le début de l’essai de glycogène synthase (tableau 1).
- Déterminer le nombre d’échantillons de souris répétés et de témoins souhaités pour l’essai. Chaque échantillon de souris nécessite quatre répétitions au total, deux pour chaque réaction (présence ou absence de G6P) (voir la figure 1 et le tableau 2).
- Coupez le papier de chromatographie en bandes de 4 cm. Le glycogène se fixe à ce papier et reste lié pendant le processus de lavage. À l’aide de la largeur (6 mm) d’une déchiqueteuse de papier, déchiquetez le papier de chromatographie en minces segments individuels.
- À l’aide d’un crayon, étiquetez les bandes de papier désignées avec l’identification de la souris, les blancs et les totaux. Évitez d’utiliser de l’encre.
- Chargez les papiers de chromatographie dans le gabarit de bloc de bois. Chaque modèle peut contenir jusqu’à 12 papiers, ce qui correspond à une rangée d’une plaque de 96 puits.
- Procurez-vous des pinces à papier de chromatographie (dessus de presse-papiers).
- Préparez une pince pour chaque rangée de réaction en serrant les bords des papiers de chromatographie, en laissant la majorité de la surface des papiers exposée. Assurez-vous que les bords étiquetés sont visibles.
- Étiquetez les tubes microfuges de 1,7 mL avec identification de l’échantillon. Deux tubes par échantillon ; un pour l’homogénat et un pour le surnageant.
- Avant le début de l’essai, préparer les mélanges réactionnels + et - G6P, voir le tableau 3 pour plus d’informations. Préparez 2 400 μL d’aliquotes de chaque mélange réactionnel.
2. Réaction radiochimique de l’activité de la glycogène synthase
ATTENTION : Cette étape contient l’utilisation de [14C]-UDP-glucose, qui est une matière radioactive. Manipuler, stocker et éliminer d’une manière approuvée par la Commission de réglementation nucléaire (NRC).
- Ajouter 30 μL de glucose [14C]-UDP (0,1 μCi/μL) à 2 400 μL d’aliquotes des deux mélanges réactionnels (+/- G6P) pour une concentration finale de 0,0012 μCi/μL. Cette recette convient pour 18 échantillons.
REMARQUE : Le volume de glucose [14C]-UDP peut être modifié pour économiser l’utilisation et assurer une sensibilité adéquate. Par exemple, utilisez 50 μL pour le tissu cérébral de souris et 25 μL pour le cœur de souris. - Mélanges de réaction vortex et aliquote de 50 μL dans chaque puits d’une plaque de 96 puits qui contiendra des échantillons, des blancs et des totaux (tableau 2). Ensuite, couvrez d’une pellicule et placez à 4 °C.
- Préparez les inhibiteurs de protéase à décongeler à température ambiante. Ces inhibiteurs sont détaillés dans le tableau 4 avec des informations supplémentaires.
- Masser 30 à 50 mg de tissu congelé. ~30 mg est optimal pour les échantillons de muscle squelettique et de cœur ; ~50 mg pour le cerveau. Conservez les tissus et les tubes de microfuge dans le N2 liquide et pesez rapidement les tissus pour vous assurer qu’ils restent congelés. Utilisez un pilon refroidi pour broyer davantage les tissus.
- Préparez le tampon d’homogénéisation avec des inhibiteurs de protéase sur de la glace.
- Un échantillon à la fois, déplacer le tube contenant le tissu du N2 liquide à la glace avec un capuchon froid pendant 1 min. Ajoutez un bouchon froid (bouchon de tube avec trois petits trous refroidis dans le liquide N2) dans le tube d’échantillon encore dans le liquide N2. Cela permet d’éviter la perte de tissu lorsque le liquide résiduel N2 dans le tube s’évapore. Une fois sortis du N2 liquide, les échantillons doivent rester dans la glace.
- Une fois sur la glace, ajoutez un volume (10-30 μL/mg de tissu) de tampon d’homogénéisation à l’échantillon et homogénéisez l’échantillon avec Tissue-Tearor. Une fois ces deux étapes terminées, passez à l’échantillon suivant.
REMARQUE : Le volume de tampon ajouté aux échantillons peut être optimisé en fonction de la source du tissu. Par exemple : 30 μL/mg pour le muscle squelettique, 15 μL/mg pour le cœur et 10 μL/mg pour le cerveau. - Centrifuger les échantillons pendant 5 min à 4 °C à 3 600 g et transférer le surnageant dans un tube de microfuge propre. Attention à ne pas toucher la pastille. Vortex et ajoutez ~150 μL aux puits correspondants dans une plaque de 96 puits à fond en V sur de la glace. Conservez le reste comme surnageant pour le test de Bradford (voir étape 2.15)
REMARQUE : Si vous le souhaitez, des aliquotes d’échantillons supplémentaires peuvent être conservées pour des tests ultérieurs tels que l’immunoblottage.
ATTENTION : Les étapes 2.9 à 2.14 nécessitent la manipulation de 14°C. Éliminer tous les matériaux contaminés d’une manière approuvée par la NRC. - Retirez la plaque de mélange réactionnel à 4 °C et chauffez-la à 30 °C sur le thermocycleur avec le film retiré. Pendant ce temps, prélever 1 L d’éthanol à 66 % à -20 °C et l’ajouter dans un bécher de lavage à l’aide d’une tige d’agitation sur une plaque d’agitation.
- Amorcer la réaction en ajoutant 25 μL de surnageant d’échantillon dans les puits de réaction et 25 μL de tampon d’homogénéisation dans les puits blancs et totaux. Utilisez une pipette multicanaux pour ajouter à 1 rangée sur la plaque de réaction à la fois, en attendant au moins 1 minute entre les rangées. Notez l’heure à laquelle la réaction a été initiée pour chaque rangée. Voir le tableau 2 pour plus d’informations. Utilisez une pipette multicanaux et assurez-vous d’ajouter des volumes égaux de liquide.
- Attendez 10-15 min pour que la réaction se produise ; Cependant, le temps d’exécution doit être identique entre les lignes.
- Aspirez 55 μL de chaque puits à l’aide d’une pipette multicanaux et distribuez sur les papiers de chromatographie respectifs préparés précédemment. Mélangez la réaction en pipetant de haut en bas avant l’aspiration. Repérez le liquide au centre des papiers de chromatographie.
- Retirez les papiers contenant les totaux de la pince à l’aide d’une pince après avoir repéré le liquide du puits. Ceux-ci peuvent être disposés sur du papier d’aluminium en toute sécurité pour sécher. Plongez tous les autres papiers de chromatographie dans le bain d’agitation à 66 % d’éthanol. Le glycogène est insoluble dans l’éthanol à 66 %, tandis que le [14C]-UDP-glucose est soluble et se lave des papiers de chromatographie.
- Répétez les étapes 2.11 et 2.12 pour chaque rangée de la plaque de réaction. Assurez-vous que le temps de réaction de chaque rangée est le même en enregistrant les heures de début et de fin de la réaction.
- Une fois que tous les rangs ont été ajoutés à l’agitation à 66 % d’éthanol, laver pendant 15 min.
REMARQUE : Au cours de cette étape et des étapes de lavage subséquentes, des aliquotes d’échantillons peuvent être préparées pour des essais complémentaires, tels que le test de Bradford, chargés de déterminer le volume total de protéines pour la normalisation, ce qui est nécessaire pour calculer l’activité enzymatique. - Éliminez l’éthanol à 66 % sans perdre les papiers de chromatographie. Laver avec 1 L d’éthanol neuf à 66 % pendant 30 min. Cet éthanol à 66 % peut être à température ambiante.
- Répétez l’étape précédente pour un total de trois lavages à l’éthanol à 66 % de 30 minutes.
REMARQUE : Si vous le souhaitez, l’éthanol à 66 % de l’étape finale de lavage peut être conservé et stocké à -20 °C pour les tests ultérieurs. - Après avoir éliminé l’éthanol à 66 %, immergez tous les papiers de chromatographie dans le bécher de lavage dans de l’acétone. L’acétone facilite le processus de séchage.
- Retirez les papiers de chromatographie de l’acétone et posez-les sur du papier d’aluminium. Conservez ou jetez l’acétone.
- Sécher les papiers de chromatographie sous une lampe chauffante pendant 15 min.
REMARQUE : Les papiers secs peuvent être stockés indéfiniment. Les documents peuvent être stockés en toute sécurité jusqu’à ce qu’ils soient prêts à passer à la détection de scintillation.
3. Mesure de l’activité avec détection de scintillation
- À l’aide d’une pince, déplacer les papiers de chromatographie dans des flacons à scintillation conservés dans des supports à scintillation. Notez l’orientation des échantillons de papier.
- Ajouter 5 ml de liquide à scintillation dans chaque flacon à l’aide de la pompe du couvercle. Vissez les bouchons pour chaque flacon.
- Chargez les échantillons dans le détecteur à scintillation et chargez le rack d’arrêt derrière les échantillons. Assurez-vous que le programme de surveillance de 14°C est sélectionné. Démarrez la détection en sélectionnant Comptage automatique.
- Imprimer les résultats
- Éliminer les tubes à scintillation et leur contenu d’une manière approuvée par le CNRC.
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Résultats
Conformément au protocole, une impression créée à partir du détecteur à scintillation contiendra la quantité mesurée de rayonnement ionisant émise par chaque papier de chromatographie contenant un flacon, directement corrélée au niveau d’activité de la glycogène synthase. Le détecteur à scintillation calculera le nombre par minute (CPM) de rayonnement détecté pour chaque échantillon, blanc et total sur une période de temps définie. Convertissez d’abord le CPM en DPM (désintégrations par ...
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Discussion
La mesure de l’activité de l’enzyme glycogène synthase est un outil précieux pour surveiller le métabolisme du glycogène dans divers états métaboliques et pathologiques. La mesure en l’absence et en présence de glucose-6-phosphate (G6P) offre un aperçu de l’état régulateur de l’enzyme et un indice indirect de l’état de phosphorylation. Le test d’incorporation de glucose [U-14C]-UDP est une technique efficace et bien documentée pour mesurer l’activité enzymatique de la glycogèn...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Le financement a été fourni en partie par l’Université Ball State, l’École de médecine de l’Université de l’Indiana-Muncie et Aro Biotherapeutics.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| [14C] Uridine 5-diphospho-glucose | Produits chimiques radiomarqués américains | ARC 0154 | |
| 31 Article de chromatographie ETCHR | Whatman | 3031 915 | |
| Hydrate d’hydrochlorure de benzamidine | Sigma | B6506 | |
| Bêta mercaptoéthanol | Sigma | M3148 | |
| Bain sec | Torey Pines Scientific | SC25 | |
| Éthanol (200 proof) | PharmcoAaper | 111000200 | |
| Acide éthylène glycol tétraacétique (EGTA) | Sigma | E4378 | |
| Acide éthylédiamine tétraacétique (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| Glucose-6-phosphate sel de sodium | Sigma | G7879 | |
| Glycogène provenant du foie de lapin (Type III) | Sigma | G8876 | |
| Microplate, fond plat, 96 puits | Greiner | 655101 | |
| Microplaque, PCR, puits à 96 | DOT Scientific | 951-PCR | |
| Compteur à scintillation polyvalent | Beckman Coulter | LS 6500 | |
| Dihydrate de fluorure de potassium | Sigma | 221872 | |
| Cocktail inhibiteur de protéase | GoldBio | GB-108-2 | |
| Cocktail de scintillation | Produits de recherche International | 111195 | |
| Fioles à scintillation | Produits de recherche International | 125509 | |
| Fluorure de sodium | Sigma | S7920 | |
| Déchireur tissulaire | Produits Biospec | Modèle 398 | |
| Tosyllysine Chlorométhyl Cétone (TLCK) | Sigma | T7254 | |
| Base de Trizma (99,9 %) | Sigma | T1503 | |
| Chlorhydrate de Trizma | Sigma | T3253 | |
| Uridine 5-diphospo-glucose | Sigma | U-4625 |
Références
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Réimpressions et autorisations
