Modèle d’amputation du membre postérieur du rat sous le genou et réinnervation musculaire ciblée immédiate

Résumé

Ce protocole montre comment effectuer une amputation sous le genou chez les rats et réaliser immédiatement une réinnervation musculaire ciblée (iTMR) afin d’étudier des stratégies pour traiter et prévenir la douleur liée à l’amputation et mieux comprendre les mécanismes de la douleur associés à l’amputation.

Résumé

La douleur liée à l’amputation réduit la qualité de vie du patient, contribue à la consommation d’opioïdes et peut diminuer la rééducation fonctionnelle ainsi que l’utilisation de prothèses. Les modèles précliniques qui produisent de manière fiable une douleur post-amputation tout en préservant la mobilité sont essentiels pour étudier les mécanismes biologiques sous-jacents à ces résultats. Ici, nous présentons un protocole chirurgical détaillé et reproductible pour rongeurs utilisant des rats de Sprague-Dawley pour modéliser l’amputation du membre postérieur sous le genou. La procédure consiste à isoler et à transecter les branches du nerf sciatique, y compris les nerfs tibial, périonier commun et sural, produisant ainsi une pathologie nerveuse prolongée après amputation ainsi que des comportements liés à la douleur. Les rats se récupèrent bien de cette intervention et peuvent marcher immédiatement après l’opération sans difficulté à manger ou boire. Les animaux peuvent ensuite être évalués par des mesures de douleur réflexives et spontanées. Les comportements douloureux résultant de cette procédure sont robustes au fil du temps, et des comportements douloureux réflexes standards peuvent être obtenus à partir du moignon. Il est important de noter qu’une mobilité préservée permet des tests comportementaux longitudinaux sans confondre les troubles moteurs. Bien que ce protocole soit centré sur l’amputation, il peut être facilement adapté pour intégrer la réinnervation musculaire ciblée (TMR) comme intervention post-amputation, en cooptant les nerfs transectés vers les branches motrices voisines des nerfs jusqu’au biceps fémoral et au semimembranose, permettant d’étudier les interventions de réinnervation et leurs effets sur la douleur post-amputation. Nous avons déjà utilisé ce modèle avec succès pour évaluer les différences spécifiques au sexe dans les comportements douloureux après amputation et pour étudier les effets de la TMR. Ce protocole offre une plateforme robuste et flexible pour étudier la douleur liée à l’amputation, la formation des névromes et les résultats fonctionnels, avec une applicabilité aux études translationnelles visant à améliorer la douleur post-amputation.

Introduction

La douleur chronique est l’une des complications les plus invalidantes après une amputation majeure d’un membre, touchant jusqu’à 70 % des^{patients 1,2,3}. Les stratégies conventionnelles de gestion de la douleur telles que les interventions pharmacologiques, la kinésithérapie, les blocs nerveux et les thérapies psychologiques offrent souvent un soulagement limité ou^{transitoire 4}. Ainsi, il subsiste un besoin clinique important de stratégies efficaces de gestion de la douleur à long terme.

La réinnervation musculaire ciblée (TMR), initialement développée pour améliorer le contrôle des prothèses myoélectriques, s’est imposée comme une approche prometteuse pour soulager la douleur après une amputation d’un^{membre 5}. La technique chirurgicale consiste à rediriger des nerfs motrices mixtes et sensorielles transsectées vers des branches motrices voisines. Cliniquement, la TMR a montré des réductions substantielles de la douleur du membre fantôme, de la douleur résiduelle du membre et des symptômes liés aux ^{névromes 6,7,8}. Les interfaces régénératives des nerfs périphériques (RPNI) sont une autre intervention chirurgicale utilisée pour les lésions nerveuses et la douleur liée à l’amputation. Les extrémités nerveuses amputées sont cousues puis enveloppées dans une greffe musculaire libre (dénervée, avasculaire^{) 9}. Les axones amputés neurotisent les jonctions neuromusculaires dénervées pour créer une contraction musculaire dans la greffe qui peut servir à créer un signal de contrôle de la myoprothèse. Contrairement à la TMR, le RPNI a été largement étudié dans un modèle de rongeurs. À l’instar de la TMR, il a été démontré que le RPNI empêche la formation de névromes et réduit la douleur associée à une lésion de la transection^{nerveuse 10,11}. Cliniquement, il a été démontré que le RPNI réduit à la fois la douleur fantômatique et résiduelle des membres chez les^{amputés 12}.

Malgré l’adoption clinique, les mécanismes biologiques sous-jacents aux effets analgésiques de la TMR et du RPNI restent peu compris. Les modèles précliniques sont essentiels pour élucider ces mécaniques. Des travaux antérieurs ont utilisé des modèles de transection nerveuse avec modification pour superficielliser le nerf afin de tester directement la douleur du^{névrome 10,11}. Ces modèles peuvent quantifier la douleur neuromate par stimulation directe et la douleur neuropathique en évaluant les comportements du réflexe spinal dans la distribution nerveuse intacte restant dans le pied. La lésion nerveuse épargnée, par exemple, maintient le nerf sural, et les nerfs tibial et périonier commun sont sectionnés. Un test du comportement douloureux est effectué sur le pied^{latéral 13}. Le modèle d’amputation du membre postérieur représente la blessure la plus grave possible au membre. Ainsi, il existe une perte neuronale généralisée ainsi que les exigences inflammatoires et de guérison importantes associées à une blessure de ce type. Lorsqu’il y a une lésion nerveuse, les neurones sains du DRG aident à maintenir les neurones blessés. Avec l’amputation, la population de neurones sains disponibles est fortement réduite, et pour chaque nerf blessé, la perte neuronale est plus importante que si un seul nerf avait été^{blessé 14, 15, 16}. Les rapports antérieurs de chirurgie de survie par amputation des membres postérieurs chez des rongeurs sont^{rares 17,18}. Cependant, il existe des avantages par rapport à une amputation du membre supérieur, tels que l’abondance de données historiques examinant la douleur et la régénération liées au nerf sciatique, ainsi que plusieurs tests comportementaux^{ambulatoires 19,20}.

Pour combler cette lacune, nous avons récemment développé un modèle d’amputation des membres postérieurs de rats incorporant une TMR immédiate (Figure 1). La technique de création de RPNI a déjà été publiée et peut être adaptée au modèle²¹ d’amputation du membre postérieur. Ce modèle reflète étroitement les procédures cliniques, nous permettant d’évaluer divers comportements de douleur, la formation des neuromes et la préservation des neurones (Figure 2)²². Nos travaux ont démontré des bénéfices analgésiques significatifs pour la TMR par rapport à l’amputation standard, la prévention des neuromes, et ont démontré des réponses sexuellement dimorphes en sensibilité au^{froid 22,23}.

Le protocole présenté ici offre une démonstration visuelle détaillée et standardisée de la technique chirurgicale, garantissant la reproductibilité et la cohérence des approches expérimentales. En illustrant clairement les étapes clés, incluant l’isolement nerveux, la transection précise et la coaptation nerveuse sans tension, ce protocole offre aux chercheurs un cadre solide pour étudier les mécanismes sous-jacents à la prévention de l’analgésie et des neuromes médiés par le TMR.

Protocole

Toutes les procédures animales doivent être approuvées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux institutionnels (IACUC) et se conformer au Guide des National Institutes of Health (NIH) pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.

1. Préparation préopératoire

REMARQUE : Des rats mâles et femelles Sprague-Dawley (Charles River Laboratories), âgés de 8 à 10 semaines et pesant entre 250 et 300 g, ont été utilisés.

1. Allumez le coussin chauffant et préparez un champ chirurgical stérile. Placez un coussinet stérile perpendiculaire au corps du rat pour une exposition optimale.
2. Disposez tous les outils et matériaux chirurgicaux : solution saline stérile (chlorure de sodium à 0,9 %), solution antiseptique povidone-iode, méloxicam, caterisation, microsuture 10-0, sutures tressées 4-0 absorbables, règle et adhésif cutané.
   REMARQUE : Tous les instruments chirurgicaux doivent être stérilisés par autoclavage ou stérilisation à billes chaudes.
3. Induire l’anesthésie en plaçant le rat dans une chambre d’induction contenant 4 % d’isoflurane, de l’oxygène à 10 L/min et de l’air à 60 %. Après 4 minutes ou une fois sans réaction, passez à un cône de nez et ajustez l’isoflurane à 1,5 % à 2,0 % selon la taille du rat.
4. Rasez le site chirurgical du bas du dos jusqu’à tout le membre postérieur. Effectuez une triple préparation avec une solution alternative povidone-iode antiseptique et des prélèvements d’alcool, en terminant par de l’alcool.
5. Administrez 1 mg/kg de méloxicam par voie sous-cutanée à l’aide d’une seringue tuberculine (généralement 0,2 mL pour un rat de 200 g).

2. Amputation sous le genou (Figure 1)

1. Utilisez une règle pour marquer la ligne de l’articulation du genou et faites deux marques supplémentaires à 2 cm et 3 cm distales au genou.
2. Faites une incision cutanée circonférentielle de 3 cm distale au genou à l’aide d’un scalpel.
3. Utilisez une dissection contondante et nette pour séparer la peau circonférentiellement de la musculature sous-jacente jusqu’à ce qu’elle se rétracte librement.
4. Répétez ce processus de minage avec les muscles sous-jacents, en disséquant soigneusement jusqu’à l’os tout en préservant les plans tissulaires. Marque le tibia/fioné à 1 cm proximal de l’incision circonférentielle à l’aide d’un cautéraire ou d’un marqueur stérile.
5. Utilisez de petits ciseaux osseux pour transpercer le tibia et le péroné à l’endroit indiqué. Utilisez la cautérité pour atteindre l’hémostasie. Examinez l’extrémité osseuse pour détecter des bords tranchants et émoussez ou coupez selon les besoins.
6. À l’aide d’une suture tressée absorbable 4-0, fermez ensemble les compartiments musculaires antérieur et postérieur au-dessus de l’os pour créer un coussinet musculaire. Commencez par suturer le bord avant au-dessus du tibia, le point de pression principal. En général, 4 à 6 points de suture interrompus sont utilisés.
7. Fermez la peau latéralement avec des sutures tressées absorbables 4-0 interrompues, en évitant de les placer directement sur le moignon porteur. Appliquez de la colle cutanée le long de la ligne d’incision.

3. Chirurgie d’intervention TMR (Figure 1)

1. Réaliser une incision longitudinale fessière de 1,5 à 2 cm d’environ 5 mm après le fémur.
2. Utilisez une dissection contondante pour séparer les muscles fessier et ischio-jambiers, en exposant le nerf sciatique juste proximal de sa trifurcation en nerfs tibial, péronier commun (PC) et sural.
3. Identifier les branches motrices proximales : une grande branche passe sous le caudofémoral (CFM), donnant naissance à la branche CFM, semimembranose (SM) et biceps fémoral (BF).
4. Élever le CFM avec un coton-tige-coton et diviser. Neurolysez soigneusement les branches SM et BF avec une dissection contondante au microscope chirurgical à l’aide de pinces Dumont fines microchirurgicales.
   1. Utilisez des pinces pour attraper l’épineurium et, avec de fines ciseaux à ressort courbés, ouvrez l’épineurium et divisez-le longitudinalement, puis séparez les différentes branches les unes des autres.
   2. Préserver la branche CFM et diviser les autres près du tronc sciatique. Le moteur courbe se ramifie vers le bas pour faciliter la coaptation.
5. Neurolysez la trifurcation sciatique en ouvrant l’épineurium et en le divisant avec de fines ciseaux à ressort courbés. Écartez doucement les branches nerveuses avec de fines pinces. Saisir chacune des trois branches (CP, tibiale, surale) à 5 à 10 mm distales à la trifurcation à l’aide de pinces.
6. Placez la tension et transectez chaque nerf aussi distalement que possible. En saisissant l’extrémité distale coupée, effectuer une coupe nette à l’extrémité proximale en excisant au moins 5 à 10 mm.
7. Effectuez les coaptations avec une suture nylon 10-0 : la CP vers le SM avec une seule suture, la tibiale vers la grande branche BF avec une à deux sutures, et la surale sur la petite branche BF avec une seule suture. Utilisez au moins 3 nœuds par suture, assurez-vous d’un placement sans tension, évitez de se contracter suffisamment pour plier le nerf, et disposez les coaptations sans angulation brusque.

4. Groupe à amputation seule

1. Liguez la CP, les nerfs tibiaux et suraux à l’aide d’une suture en soie 5-0. Manipulez la soie avec des pinces de suture Dumont pour attacher. Assurez-vous que la ligature plisse le nerf et soit fixée avec 4 nœuds carrés.
2. Tirez doucement chaque nerf proximalement à l’aide du nœud et transectez 1–2 mm distal de la ligature. Retirez 10 mm du segment nerveux distal.
3. Procédez à l’amputation comme détaillé dans la section 2.

5. Soins postopératoires

1. Remet le rat dans une cage chauffée jusqu’à ce qu’il soit en marche. Administrez une seconde dose de méloxicam (0,2 mL) par voie sous-cutanée 24 heures plus tard.
2. Surveillez quotidiennement pendant 7 jours l’intégrité de la plaie, les signes d’infection, de douleur ou de détresse, et intervenez selon les directives de l’IACUC.

Résultats

Ce modèle d’amputation du membre postérieur induisait de manière fiable des comportements neuropathiques liés à la douleur tout en préservant la capacité de marche et d’exploration chez les rats. Comme montré à la Figure 2, la transection du nerf périphérique lors de l’amputation sans cible distale entraîne une croissance axonale désorganisée et la formation de névromes au site de ligatura, visualisée par l’immunocoloration des peptides liés au gène B-tubuli...

Discussion

Ce protocole détaille les étapes chirurgicales essentielles pour assurer la reproductibilité du modèle d’amputation du membre postérieur et démontre la préservation de la déambulation et de l’engagement comportemental lors des tests post-amputation. Des principes chirurgicaux clés, tels qu’une identification anatomique rigoureuse, une manipulation minimale des nerfs et une manipulation sans tension des nerfs sectionnés, sont mis en avant afin d’assurer la cohérence et la reproductibilité...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10-0 nylon microsuture (Arosurgical)	AROSurgical	T04A10N07-13	Suture de coaptation fine pour les nerfs. Micro suture 10-0.
4-0 polyglycolic acid suture	Ethicon	AQ1268	Suture de fermeture pour les muscles et la peau. Suture résorbable 4-0.
5-0 silk surgical suture	Generic	Generic	Suture de ligature nerveuse
Adult Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories	Generic	Animal expérimental
Alcohol prep pads	Dukal Corporation	Generic	Antiseptique cutané
Betadine 10%	Avrio Health LP	Generic	Antiseptique
Bone scissors	FST	16030	Instrument de coupe osseuse
Cautery device	FST	18010-00	Dispositif d'hémostase
Cotton tip applicator (ProAdvantage)	ProAdvantage	Ref 76100	Manipulation des tissus
Curved microdissector scissors	FST	15019-10	Ciseaux fins pour la neurolyse
Forceps (fine Dumont)	FST	11254-20	Instrument de manipulation des nerfs
Forceps (suture tying Dumont)	FST	11063-07	Instrument de manipulation des sutures
Gauze USP type VII (Cardinal Health)	Cardinal Health	Ref 2146	Maintient le champ stérile
Heating pad warmer (TC1000 temperature controller)	Generic	TC1000	Dispositif de contrôle de la température
Induction chamber (Braintree Scientific)	Braintree Scientific Inc.	Generic	Pour l'induction de l'anesthésie
Isoflurane (Isospire)	Phoenix	Generic	Agent anesthésique
Meloxicam (Ostilox)	VetONE	5 mg/mL	Agent analgésique
Ruler	Generic	Generic	Outil de mesure pour les repères anatomiques
Surgical blade 15	FST	10015-00	Outil d'incision cutanée
Tuberculin syringe	Generic	Generic	Administration de médicaments
Vaporizer (Surgivet model 100)	Surgivet	Model 100 S/N W2211123	Pour le maintien de l'anesthésie
Vetbond tissue adhesive	World Precision Instruments	Generic	Adhésif cutané