In Vitro Différenciation résidente des cellules T CD8 à mémoire utilisant le système de coculture organoïde-cellules T épithéliales

Résumé

Pour étudier la différenciation et la fonction des cellules T CD8 in vitro, les cellules T CD8 peuvent être isolées chez la souris pour être co-cultivées à long terme avec des organoïdes épithéliaux vaginaux murins infectés préformés. Ici, nous décrivons ce processus et évaluons l’acquisition des marqueurs des lymphocytes T de mémoire résident lors de la co-culture.

Résumé

Les tissus muqueuseux barrières jouent un rôle important dans la différenciation et le fonctionnement des lymphocytes T résidents. Parmi les populations cellulaires diverses de ces tissus, les cellules épithéliales sont des moteurs clés de la différenciation des lymphocytes T. Cependant, notre compréhension des signaux d’origine épithéliale qui façonnent la biologie des cellules T dans les environnements mucoleurs reste limitée, principalement en raison du manque d’outils spécifiques et de la complexité des systèmes modèles disponibles. Ici, nous décrivons un système murin de co-culture organoïde-cellules T organoïdes vaginales vaginales et modélise les interactions dynamiques entre l’épithélium infecté et les lymphocytes T CD8 spécifiques au virus. Ce protocole permet une analyse phénotypique et fonctionnelle des réponses des lymphocytes T au sein d’un microenvironnement épithélial tridimensionnel physiologiquement pertinent. Grâce à ce système, nous démontrons la différenciation des lymphocytes T effecteurs CD8 en cellules T mémoire résidentes dans les tissus (TRM). Ce système polyvalent de culture in vitro offre des opportunités réductionnistes d’étudier les détails moléculaires des signaux épithéliaux derrière la différenciation des cellules T CD8 qui régissent l’immunité protectrice et l’immunopathologie dans les organes barrières.

Introduction

Les lymphocytes T mémoire résidents du CD8 (TRM) représentent une population unique de cellules T CD8 mémoire qui sont conservées de façon permanente dans les tissus périphériques sans circuler régulièrement dans le sang et les tissus lymphoïdes. Ces cellules TRM sont stratégiquement positionnées dans les organes barrières, notamment la peau, les poumons, les intestins et le tractus reproducteur, où elles agissent comme sentinelles contre les agents pathogènes et les tumeurs^{naissantes 1,2}. Lors de la détection d’un pathogène, les cellules TRM CD8 libèrent rapidement des granulés cytotoxiques pour éliminer directement les cellules infectées tout en sécrétant simultanément des cytokines inflammatoires qui alertent les cellules tissulaires environnantes et recrutent des effecteurs immunitaires circulants pour contenir la dissemination^{du pathogène 3,4}. L’efficacité des TRM CD8 dans l’immunité antipathogène ainsi que dans l’immunothérapie contre le cancer a déjà été^{démontrée 5,6}. Ainsi, positionner une grande quantité de TRM CD8 fonctionnellement compétent dans les tissus muqueuseux barrières est un objectif crucial pour les vaccins et les stratégies immunothérapeutiques.

La formation et le maintien du TMR CD8 dans les organes périphériques dépendent de manière critique de la programmation locale spécifique aux tissus. Ces indices environnementaux locaux incluent des cytokines et agents métaboliques uniques d’origine tissulaire, ainsi que des interactions intercellulaires qui renforcent collectivement l’identité TRM spécifique au^{tissu 7,8,9}. Cette programmation tissulaire permet à TRM de s’adapter aux besoins spécifiques des tissus dans l’exécution de leurs fonctions d’immunosurveillance. Cependant, notre compréhension de la nature de ces interactions est incomplète, en raison du manque de systèmes modèles robustes capables de capturer fidèlement ces processus. Les petits modèles animaux, bien qu’ils soient très instructifs, souffrent souvent d’un réseau d’interactions très interconnecté et complexe qui entrave des études rapides et à haut débit.

Ici, nous décrivons une alternative in vitro au modèle murin qui permettra d’étudier les détails moléculaires des indices dérivés des cellules épithéliales derrière la différenciation du TRM CD8. En co-cultivant des organoïdes épithéliaux vaginaux préformés (VEOs) avec des cellules T CD8 activées, nous avons généré la TRM CD8 in vitro. Une description détaillée du processus d’activation et de co-culture des cellules T CD8 permettra une adoption plus large de ce processus dans les tissus, conduisant à une meilleure compréhension des interactions cellulaires qui façonnent la mémoire des cellules T CD8 dans les tissus de première ligne.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été examinées et approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Brown (Protocole numéro 22-10-0001).

1. Installation et préparation de base d’une plaque d’activation

1. Un jour avant le début de l’expérience, préparez une plaque de culture tissulaire non traitée pour l’ensemencement avec des cellules T CD8 naïves. Préparez une solution d’anticorps activateurs dans le dPBS stérile à une concentration finale de 1 μg/mL pour l’anti-CD3ε (2C11) et 0,167 μg/mL pour la B7-1 Fc. Pour une plaque à 24 puits, dispensez 600 μL de cette solution par puits. Incubez toute la nuit à 4 °C jusqu’à ce que ce soit prêt à l’emploi.
2. Préparez le tampon d’enrichissement des lymphocytes dans un dPBS stérile en ajoutant 2 % de FBS dépouillé au charbon et 1 mM d’EDTA au dPBS stérile. Conservez à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.
3. Préparez un tampon de lyse d’ammonium-chlorure-potassium (ACK RBC) dans ddH_2Oen ajoutant 10 mM de bicarbonate de potassium, 155 mM de chlorure d’ammonium et 0,1 mM d’EDTA. Filtrez, stérilisez et gardez à température ambiante.
4. Préparez la quantité appropriée de milieu de récolte dans le RPMI en ajoutant 5 % de FBS dépouillé au charbon de bois. Conservez à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi. Pour chaque souris à prélever, 50 mL de milieux de récolte sont recommandés.
   REMARQUE : La pénicilline/streptomycine et l’amphotéricine B sont optionnelles, mais une concentration finale de 100 unités/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine et 0,2 μg/mL d’amphotéricine B peut aider à prévenir la contamination bactérienne et fongique de la culture de lymphocytes T lors de l’isolement tissulaire si cela pose problème.
5. Préparez le milieu des lymphocytes T dans le RPMI en ajoutant 10 % de FBS dépouillé de charbon, 2 mM de L-glutamine, 100 unités/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 1x acides aminés non essentiels et 1 mM de pyruvate de sodium. Pour une plaque à 24 puits, utilisez 2 mL de milieu à cellules T par puits et 50 mL de milieu à cellules T pour une plaque complète. Conservez à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.
6. Préparez les outils de dissection (ciseaux micro-disséqueurs de 0,4 mm et pinces micro-disséquables fines, courbes de 0,8 mm) en autoclavant dans une pochette de stérilisation ou en les faisant tremper dans de l’éthanol à 70 %.

2. Prélèvement et dissociation des organes lymphoïdes secondaires de la souris adulte

1. Refroidissez rapidement une centrifugeuse à 4 °C avec des adaptateurs appropriés pour contenir des tubes coniques de 15 mL.
2. Préparez de la glace pour transporter les tissus et les lymphocytes pendant les périodes de récolte et d’incubation.
3. Préparez un tube conique stérile de 15 mL contenant au moins 5 mL de milieux de récolte par souris à disséquer.
4. Anesthésiez et euthanasiez une souris transgénique adulte à cellules T CD8 (~8 semaines) selon le protocole institutionnel dans une hotte à flux laminaire.
5. Fixez les membres de la souris sur une surface propre en mousse de polystyrène à l’aide d’aiguilles de n’importe quelle taille, et vaporisez le torse avec 70 % d’éthanol pour éviter que la fourrure n’obstrue l’incision et ne s’attache aux outils.
6. À l’aide de ciseaux micro-disséquables propres et de pinces, réalisez une incision abdominale verticale et séparez la peau de la fine couche de tissu conjonctif en dessous. Épinglez la peau sur la surface de mousse de polystyrène à l’aide d’aiguilles de n’importe quelle taille, puis coupez les tissus conjonctifs restants pour exposer les organes du torse.
7. Localisez soigneusement et excisez la rate, en retirant l’excès de graisse à l’aide des pinces courbées, puis transférez-la dans le tube conique de 15 mL contenant le milieu de récolte. Laissez la rate sur la glace et isole autant de ganglions lymphatiques que possible (par exemple, iliaque et inguinal) pour les combiner avec la rate dans le même tube conique sur la glace.
   REMARQUE : Les ganglions lymphatiques iliaciens sont situés de part et d’autre de la veine cauvale caudale dans la région abdominale inférieure sous le tube digestif, et les ganglions lymphatiques inguinaux sont situés près de la branche de la veine épigastrique superficielle de chaque côté de la peau abdominale inférieure du torse. Isoler davantage de ganglions lymphatiques pour améliorer le rendement des lymphocytes T CD8 après enrichissement ; cependant, isoler la rate seule suffit généralement à fournir plusieurs millions de cellules T CD8.
8. Transférez la rate et les ganglions lymphatiques dans une boîte de 60 mm notée et, à l’aide de l’extrémité plate d’un piston à seringue de 3 mL, dissociez mécaniquement la rate et les ganglions lymphatiques en broyant le tissu jusqu’à ce qu’il ne reste plus de gros fragments.
9. Collectez la suspension en la faisant passer à travers une filtre stérile de 70 μm dans un tube conique stérile de 15 mL frais. Lavez la plaque de 60 mm avec 5 mL de média de récolte pour assurer un transfert complet des cellules désagrégées et filtrez dans le même tube conique de 15 mL.
10. Centrifugez la suspension à 584 × g pendant 5 minutes à 4 °C. Jetez le surnageant et soutenez le tube en faisant passer le bas rapidement et avec force sur la grille d’un porte-tube centrifugeuse pour desserrer la pastille.
11. Lyse les érythrocytes en resuspendant le pellet desserré dans 2 mL de tampon de lyse ACK pour les globules rouges. Vortex et incube à température ambiante pendant 2 minutes.
12. Après 2 minutes, neutralisez le tampon de lyse en ajoutant 2 mL de média de récolte. Aspirez la suspension à l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL et filtrez à travers un filtre stérile de 70 μm pour revenir dans le même tube conique de 15 mL.
    REMARQUE : Cette filtration est importante pour garantir l’élimination de tous les ammeubles.
13. Centrifugez la suspension à 584 × g pendant 5 minutes à 4 °C. Jetez le surnageant et résuspendez la pellete dans 950 μL de tampon d’enrichissement des lymphocytes.

3. Enrichissement et activation des cellules T CD8

1. Enrichir les lymphocytes CD8 naïfs à partir de lymphocytes à l’aide d’un kit d’isolation commercialement disponible. Suivez le protocole du fabricant.
2. Une fois les cellules T CD8 enrichies, transférez la suspension enrichie dans un nouveau tube conique stérile de 15 mL et remplissez le volume jusqu’à 10 mL avec un milieu de récolte.
3. Comptez avec un hémocytomètre.
   REMARQUE : Sur une souris adulte, il est possible d’isoler au moins 5 à 10 millions de cellules T CD8 naïves à >95 % de pureté.
4. Placez au moins 500 000 cellules dans 2 mL de milieu T par puits d’une plaque à 24 puits. Mélangez soigneusement les cellules T avant le placage pour assurer une suspension homogène à cellule unique. Compléter le milieu des lymphocytes T avec une concentration finale de 100 unités/mL d’IL-2, 2,5 ng/mL d’IL-12 et 55 μM de bêta-mercaptoéthanol.
5. Retirez la plaque de culture tissulaire précédemment recouverte d’anticorps du 4 °C et aspirez soigneusement la solution de revêtement sans toucher le fond des puits.
6. Placez immédiatement les lymphocytes T. Incubez à 37 °C avec 5 % de_CO2 pendant 2 jours.

4. Suppression des signaux d’activation et maintien au repos des cellules T CD8 activées

1. Observez les puits activés au microscope optique. Après 2 jours d’activation, cherchez de petits groupes de lymphocytes T dans les puits. Des amas plus importants indiquent une activation accrue. S’il n’y a pas ou peu de grappes, incubez la plaque à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant un jour supplémentaire avant de procéder au repos.
2. Préparez de la glace pour stocker la suspension des lymphocytes T pendant les périodes d’incubation et lorsqu’elle n’est pas utilisée.
3. Resuspendez les cellules T à l’aide d’une pipette P1000 en pipettant plusieurs fois vers le haut et vers le bas dans chaque coin du puits. Lorsque les lymphocytes T se sont soulevés, transférez le contenu du puits dans un tube conique stérile de 50 mL et comptez-le.
   REMARQUE : Le lavage de chaque puits avec 1 mL de dPBS est optionnel, mais le lavage en pool avec la suspension à cellules T peut augmenter le rendement des cellules T.
4. Replacez les lymphocytes T à la même concentration que à l’étape 3.4, soit 250 000 cellules/mL à 2 mL par puits. Préparez la quantité appropriée de milieu à cellules T complétée avec 100 unités/mL d’IL-2 et 55 μM de bêta-mercaptoéthanol.
5. Centrifugez la suspension à 584 × g pendant 5 minutes à 4 °C, écartez le surnageant, puis remettez le pellet dans le volume approprié de milieu à cellules T préparé à l’étape précédente pour le nombre de puits à placer. Mélangez soigneusement pour assurer une suspension homogène monocellulaire.
6. Plaque de 2 mL de suspension de cellules T (500 000 cellules/puits) dans une nouvelle plaque de culture tissulaire non traitée sans revêtement d’anticorps. Incubez à 37 °C avec 5 % de_CO2 pendant 2 jours.

5. Infection des organoïdes épithéliaux vaginaux murins préformés par un virus

REMARQUE : Nous avons utilisé à la fois le virus de l’Herpès simplex-2 (HSV-2) et le virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV) pour opérer une infection virale des organoïdes. Les deux sont considérés comme des agents de niveau de biosécurité 2 (BSL-2). Effectuez toutes les procédures impliquant des agents infectieux dans un cabinet certifié BSL-2 pour la biosécurité. Nettoyez les zones de travail contenant 70 % d’éthanol avant et après utilisation, et jetez tous les matériaux conformément aux directives institutionnelles de biosécurité. Pour ce protocole, nous avons établi des VEO à partir de cellules épithéliales vaginales prélevées dans l’épithélium vaginal de souris femelles C57BL/6 comme décrit avant¹⁰.

1. Les VEO plaquent à une densité de 10 000 cellules dans 20 μL d’extrait de membrane basale (BME) par puits d’une plaque à 24 puits 7 à 10 jours avant l’infection.
2. Un jour avant la co-culture, mettez de côté un puits de VEO pour trypsinisation et comptage afin d’obtenir une multiplicité précise de l’infection (MOI). Préchauffez à 0,25 % de Trypsine-EDTA dans un bain-marie à 37 °C pendant 5 minutes.
   REMARQUE : 0,25 % de Trypsine-EDTA ne sera pas utilisé pendant l’infection ; il n’est nécessaire que pour dissocier les VEO lors des calculs du MOI. Revêtir des objets plastiques (c’est-à-dire pointes de pipette, tubes coniques) avec 2,5 % de BSA dans le dPBS est optionnel à cette étape mais peut aider à réduire la perte d’organoïdes et de cellules pour un comptage plus précis.
3. Aspirez les milieux de culture cellulaire du puits désigné et lavez avec du dPBS.
4. Injectez 600 μL de Trypsine-EDTA préchauffée à 0,25 % dans le puits et resuspendez complètement avec une pipette P1000 recouverte de BSA pour perturber mécaniquement la BME. Transférez le contenu du puits dans un tube conique stérile de 15 mL recouvert de BSA.
5. Incubez dans un bain-marie à 37 °C pendant 5 minutes. Après 5 minutes, ajoutez 10 mL à 10 % de FBS en RPMI pour calmer la trypsinisation.
6. Centrifugez la suspension à 500 x g pendant 5 minutes à 4 °C. Éliminez le surnageant et resuspendez à l’aide d’une pointe de pipette recouverte de BSA dans 100-300 μL de milieu de culture T-organoïde ou de DMEM/F12 nature.
   REMARQUE : Le volume dépend de la taille de la pellete. Si la pellete est à peine visible, resuspendez-la à un volume plus faible.
7. Comptez avec un hémocytomètre. Calculer la quantité appropriée de virus nécessaire pour atteindre 0,1 MOI en utilisant le titre viral connu et la densité cellulaire par puits de VEO selon l’équation suivante :
   
8. Aspirez les milieux de culture cellulaire des puits VEO à infecter et lavez avec 500 μL de dPBS préchauffé (37 °C). Incubez les puits avec du dPBS pendant 5 minutes à 37 °C.
9. Après 5 minutes, retirez le dPBS et ajoutez 500 μL de milieux organoïdes par puits contenant suffisamment de particules virales pour obtenir un MOI de 0,1. Incubez à 37 °C avec 5 % de_CO2 pendant 1 heure, en faisant légèrement tourner manuellement la plaque de culture de tissus toutes les 20 à 30 minutes.
10. Après l’incubation d’une heure, aspirez le milieu organoïde viral et lavez avec 500 μL de dPBS préchauffé (37 °C). Aspirez le dPBS et remplacez-le par un milieux organoïdes frais.

6. Co-culture des lymphocytes T CD8 avec des organoïdes épithéliaux vaginaux murins préformés infectés par le virus

1. Avant la co-culture (idéalement 4 à 24 heures à l’avance), transférez le BME de -80 °C à 4 °C pour la décongélation. Anticiper la quantité appropriée de BME à dégeler selon le plan expérimental de co-culture : prévoir de plaquer 8 μL de BME par puits d’une plaque de 96 puits et 20 μL de BME par puits d’une plaque de 24 puits.
   REMARQUE : L’EMB est visqueuse, et une période de décongélation plus longue à 4 °C réduira la viscosité et améliorera la maniabilité.
2. Préparez 2,5 % de BSA dans du dPBS et stérilisez au filtre. Utilisez cette solution BSA pour recouvrir chaque surface plastique qui entre en contact avec les VEO (c’est-à-dire les pointes de pipette, les tubes coniques).
   REMARQUE : Ce revêtement empêche les VEO d’adhérer à la surface plastique et de se perdre lors de la manipulation.
3. Vérifiez la taille et l’état général des VEO au microscope optique. Confirmez que les VEO sont 7 à 10 jours après la culture et qu’en moyenne ont un diamètre de ~100 microns. Les VEO en bonne santé présentent peu ou pas de cellules individuelles et présentent une morphologie uniforme et ronde.
   REMARQUE : Replacer les VEOs 1:1 en co-culture s’ils sont cultivés dans une plaque à 24 puits et les replacer dans une plaque à 24 puits (c’est-à-dire qu’un puits de VEO re-ensemencera un puits de co-culture T-organoïde). Si vous replacez une plaque à 96 puits à partir d’une plaque à 24 puits, replacez les VEO 1:2 (c’est-à-dire qu’un puits de VEO re-ensemencera deux puits de co-culture T-organicoïdes).
4. Placez le nombre nécessaire de plaques de culture tissulaire stériles à 96 ou 24 puits à utiliser pour la co-culture dans l’incubateur à 37 °C.
   REMARQUE : Une plaque chauffée accélérera l’adhésion et la solidification de la BME.
5. Préparez un milieu de culture organoïde T-cellule dans DMEM/F12 en ajoutant un supplément de B-27 à 2 %, 2 mM de L-glutamine, 100 unités/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 1x acides aminés non essentiels, 1 mM de pyruvate de sodium, et 0,2 μg/mL d’amphotéricine B. Conservez à 4 °C jusqu’à l’utilisation.
6. Aspirez les milieux de culture cellulaire provenant des puits VEO et lavez chaque puits avec 500 μL de dPBS stérile à froid (2-8 °C).
7. Aspirez le dPBS et ajoutez 200 à 500 μL de solution de prélèvement d’organoïdes froide (2-8 °C) (au moins 10 fois le volume de gouttelettes organoïdes de l’EMB). Faites une pipette de haut en bas avec une pipette P200 recouverte de BSA pour perturber mécaniquement le BME.
8. Incubez la plaque avec un léger secouement (~100 tr/min) sur un shaker orbital à 4 °C pendant 20 minutes. Si un shaker orbital froid n’est pas disponible, faites couver l’assiette sur de la glace en secouant manuellement toutes les 5 minutes. Si l’EMB n’a pas dépolymérisé après 20 minutes, allonger le temps d’incubation si nécessaire.
9. Transférez le contenu des puits à l’aide d’une pointe de pipette recouverte de BSA dans un tube conique stérile de 15 mL ou 50 mL recouvert de BSA sur glace. Centrifugez la suspension à 500 × g pendant 5 minutes à 4 °C.
10. Éliminez le surnageant et lavez les VEO avec 5 à 10 mL de dPBS froid (2-8 °C) (au moins 10 fois le volume des gouttelettes organoïdes combinées de l’EMB). Centrifugez la suspension à 500 × g pendant 5 minutes à 4 °C.
11. Jetez le dPBS et resuspendez le pellet dans 1 mL de milieu de culture T-cellule à l’aide d’une pointe de pipette P1000 recouverte de BSA. Laissez la suspension VEO sur glace jusqu’à ce que les lymphocytes T soient prêts à être co-cultivés.
12. Commencez à collecter les lymphocytes T pour la co-culture. Vérifiez la taille et l’état général des lymphocytes T au repos au microscope optique. Sans signaux activateurs, les lymphocytes T ralentiront leur prolifération mais auraient tout de même dû former quelques grappes. Confirmez qu’il n’y a pas de débris cellulaires ni de fragments, et que les lymphocytes T présentent une morphologie élargie. Resuspendez les cellules T à l’aide d’une pipette P1000 en pipettant plusieurs fois vers le haut et vers le bas dans chaque coin du puits et en comptant le nombre total de cellules T CD8 vivantes.
    REMARQUE : Par puits d’une plaque à 96 puits, semez 100 000 lymphocytes T pour chaque coculture dans 8 μL de BME. Par puits d’une plaque à 24 puits, semez 200 000 cellules T pour chaque coculture dans 20 μL de BME.
13. Centrifugez la suspension à 584 × g pendant 5 minutes à 4 °C. Écartez le surnageant et resuspendez le pellet dans 10 mL de milieu de culture organoïde T. Combinez les lymphocytes T avec les VEO en transférant un nombre approprié de cellules T pour que les puits soient placés dans le tube conique contenant les VEOs.
14. Centrifugez à 584 × g pendant 5 minutes à 4 °C. Écartez le surnageant et resuspendez les VEO et les cellules T dans la quantité appropriée de BME. Mélangez soigneusement à l’aide d’une pointe de pipette revêtue de BSA, puis placez sur une plaque de culture tissulaire préchauffée, 20 μL par puits d’une plaque à 24 puits ou 8 μL par puits d’une plaque à 96 puits.
    REMARQUE : Gardez le BME sur glace ou dans un bloc de refroidissement à 4 °C pendant le placage. Placer les pointes de pipette dans le réfrigérateur à 4 °C pendant 30 minutes avant le dressage peut aider à prévenir la solidification prématurée de la BME.
15. Placez la plaque à l’envers dans l’incubateur à 37 °C et attendez 30 minutes pour l’adhérence complète et la solidification de l’EMB.
16. Pendant cette période d’incubation, préparez le milieu de culture organoïde T complet en ajoutant 100 ng/mL d’EGF murin, 55 μM de bêta-mercaptoéthanol et 10 unités/mL d’IL-2 murin au milieu de culture préfabriqué des cellules T-organoïdes.
17. Après la période d’incubation, ajoutez soigneusement 500 μL de milieu de culture organoïde T complet par puits d’une plaque de 24 puits ou 250 μL de milieu de culture complet des cellules T-organoïdes par puits d’une plaque de 96 puits. Distribuez un média contre les parois du puits pour éviter de perturber la gouttelette de l’EMB. Changez le média tous les deux jours jusqu’à ce que le récoltage soit récolté pour analyse.

7. Collecte de cellules T CD8 co-cultivées pour l’analyse de cytométrie en flux

1. Une fois que les cocultures ont atteint au moins le jour 7 de la culture, récolter pour analyse. Si les lymphocytes T n’expriment pas de marqueurs de type TRM en co-culture au jour 7, il faut optimiser la date de récolte entre le jour 7 et le 14, selon l’acquisition phénotypique et la viabilité des cellules VEO et T.
2. Préparez un tampon de tri cellulaire activé fluorescent (FACS) pour la coloration et l’analyse par cytométrie en flux en ajoutant 0,2 % d’albumine sérique bovine en poids et 0,1 % en va-V d’azide de sodium à dPBS.
   REMARQUE : L’azide de sodium est un produit chimique extrêmement toxique. Suivez les recommandations institutionnelles pour la gestion et l’élimination de tous les déchets conformément aux réglementations institutionnelles sur la biosécurité.
3. Préparez un cocktail d’anticorps fluorescents dans un tampon FACS pour la coloration de surface, selon les marqueurs souhaités pour l’analyse. Pour chaque puits, il faut inclure au moins 50 μL de cocktail d’anticorps.
4. Préparez un colorant fluorescent de viabilité dans du dPBS. Pour chaque puits, il faut prendre en compte au moins 50 μL de colorant de viabilité.
5. Retirez soigneusement le milieu de chaque puits et resuspendez soigneusement dans un tampon FACS froid (2-8 °C), en pipotant 10 à 20 fois pour perturber mécaniquement la machine biologique. Transférez le contenu de chaque puits sur une plaque arrondie à fond arrondi de 96 puits identifiée.
6. Centrifugeuse à 859 × g pendant 2 minutes à 4 °C. Baissez la rampe de décélération pour toutes les étapes de centrifugation suivantes afin d’éviter la perte d’échantillon due au remixage des granules.
7. Retirez le surnageant en inversant la plaque et en expulsant le liquide d’un seul mouvement ferme vers le bas. Resuspendez dans 50 μL de cocktail d’anticorps. Faites une pipette de haut en bas au moins 5 fois à l’aide d’une pipette multicanal pour assurer une resuspension complète de la pelote cellulaire.
8. Incubez pendant 30 minutes à 4 °C ou à température ambiante selon les besoins, à l’abri de la lumière. À la fin de la période d’incubation, ajoutez 150 μL de dPBS à chaque puits à l’aide d’une pipette multicanal et d’une centrifugeuse à 859 × g pendant 2 minutes à 4 °C.
9. Décantez le surnageant en retournant la plaque à l’envers et en la basculant une fois en continu. Reposez dans 50 μL de colorant de viabilité. Faites une pipette de haut en bas au moins 5 fois à l’aide d’une pipette multicanal pour assurer une resuspension complète de la pelote cellulaire.
10. Incubez pendant 15 minutes à température ambiante, protégé de la lumière. À la fin de la période d’incubation, ajoutez 150 μL de tampon FACS à chaque puits à l’aide d’une pipette multicanal et d’une centrifugeuse à 859 × g pendant 2 minutes à 4 °C.
11. Découler le surnageant comme précédemment, puis resuspendre 150 μL de tampon FACS si les échantillons doivent être appliqués immédiatement sur un cytomètre à débit, ou fixer 150 μL de paraformoldéhyde à 0,5 % et laisser à 4 °C. Faites une pipette de haut en bas au moins 5 fois à l’aide d’une pipette multicanal pour assurer une resuspension complète de la pelote cellulaire. Filtrez les échantillons fixes pour éviter que l’instrument ne se bouche et utilisez un cytomètre à débit dans les 12 à 36 heures pour éviter la perte de fluorescence.
    REMARQUE : Le paraformoldéhyde est considéré comme un produit chimique dangereux. Respectez les réglementations institutionnelles en matière de biosécurité en matière de manipulation et d’élimination.

Résultats

Visualisation microscopique de la co-culture d’organoïdes infectée par les cellules T CD8
Les VEO de souris préformées ont été infectées par le LCMV et co-cultivées avec des lymphocytes T CD8 spécifiques au LCMV. Nous avons également réalisé ces co-cultures avec le modèle d’infection par HSV-2 afin d’établir la polyvalence du protocole, mais nous montrons des données microscopiques pour le modèle LCMV et avons inclus ci-dessous les données de différenciation des cellu...

Discussion

Les TRM CD8 reposent sur des indices environnementaux locaux pour la différenciation et l’entretien. Ces indices instaurent une programmation tissulaire spécifique qui permet aux TRM CD8 de s’adapter à leur environnement et d’accomplir leurs fonctions d’immunosurveillance selon les besoins. Malheureusement, les MRT n’ont pas survécu in vitro une fois extraits du tissu, ce qui a limité leur analyse^{détaillée 12,13}. Dans ce...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Solution aqueuse à 16 % de paraformaldéhyde	Sciences de la microscopie électronique	15710-S
Plaques de culture de tissuce multiple à puits non traitées en polystyrène à 24 puits	VWR International	10861-558
2-Mercaptoéthanol	Gibco	21985023
Seringues stériles de 3 mL	Fisher Scientific	14-955-457
5 mL,   ; Snap Cap,   ; Tubes à essai stériles à fond rond en polystyrène	Faucon	352058
Plaques de Petri de 60 mm	Fisher Scientific	FB0875713A  ;
70 & mu ; Filtres cellulaires stériles	Fisher Scientific	22-363-548
Microplaques à fond rond en polystyrène non traité à 96 puits	Greiner Bio-One	650101
Plaques de culture tissulaire multiple non traitées en polystyrène à 96 puits	VWR International	10861-562
Albumine bovine/fraction V	Thermo-Sciences Chimiques	J6465518
Chlorure d’ammonium	Fisher Scientific	A661-500
Amphotéricine B  ;	Sigma-Aldrich	A9528-100MG
Supplément B-27	Gibco	17504044
Lecteur multimode d’imagerie cellulaire ioTek Cytation 5
DMEM/F12 1:1 Moyen	Cytiva	SH30271. FS
Solution de sel tamponné phosphate de Dulbecco 1x	Corning	21031CV
Acide éthylédiadiamine tétraacétique (solution 0,5 M/pH 8,0)	Fisher Scientific	BP2482-500
Ciseaux micro-disséqueurs ultra fins	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5882
Sérum bovin fœtal - Traité au charbon de bois/Dextran	R& Systèmes D	S11650
Logiciel Flowjo v10	Becton, Dickinson and Company	FlowJo (RRID :SCR_008520)
Pince Graefe	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5135
HEPES Solution	Cytiva	SH30237.01
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	A2916801
Aimant 5 mL	Biolégende	480019
Mouse CD8 Naï ; Kit d’isolation des cellules T ve	Biolégende	480044
Protéine recombinante EGF de souris	Gibco	315091MG
Solution d’acides aminés non essentiels (100 fois)	Gibco	11140050
Solution de pénicilline-streptycine	Cytiva	SV30010
Potassium Bicarbonate	MP Biomédicals	0215255780
CD3 et epsilon purifiés anti-souris ; Anticorps	Biolégende	100360
Souris Recombinante B7.1 (CD80) - Fc Chimera (sans porte-porteuse)	Biolégende	555406
Souris recombinante IL-12 (p70) (sans porteuse)	Biolégende	577004
Souris recombinante IL-2 (sans porte-avions)	Biolégende	575406
Extrait de membrane de base à facteur de croissance réduit	R& Systèmes D	BME001-10
RPMI 1640 Médias	Cytiva	SH30027.LS
Azidée de sodium	Fisher Scientific	S227I-25
Pyruvate de sodium (100 mM)	Gibco	11360070
Trypsine 0,25 % de protéase avec trypsine porcine	Cytiva	SH30042.02
Colorant de viabilité (Rouge 780)	Cytek Biosciences	13-0865-T100