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Article de méthode

L'axe Mettl3/Nrf2 supprime la progression de la maladie de Parkinson en inhibant la pyroptose induite par NLRP3 dans les neurones sérotoninergiques

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DOI :

10.3791/69124

⸱

7 novembre 2025

 ,  , 
1Department of Neurosurgery, Feicheng People's Hospital, 2Department of Neurology, Yantai Yantaishan Hospital

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour étudier comment Mettl3 régule Nrf2 via la modification de m6A, supprimant ainsi la pyroptose microgliale et protégeant les neurones sérotoninergique dans des modèles de maladie de Parkinson, avec des applications dans la recherche sur la neuroinflammation épitranscriptomique.

Résumé

Les mécanismes précis sous-jacents à la pathogenèse de la maladie de Parkinson (MP) restent incomplètement compris, en particulier en ce qui concerne le rôle de l’inflammation microgliale et de la survie des neurones sérotoninergiques. Ce protocole définit un cadre complet pour élucider comment la méthyltransférase de type 3 (Mettl3) module le facteur 2 lié au facteur érythroïde 2 nucléaire (Nrf2) par la modification de la N6-méthyladénosine (m6A), atténuant ainsi la pyroptose microgliale et préservant les neurones sérotoninergique dans les modèles de MP in vitro et in vivo . L’objectif principal est de fournir aux chercheurs des méthodologies reproductibles pour disséquer la régulation épitranscriptomique des voies neuroinflammatoires, en commençant par l’activation microgliale induite par les lipopolysaccharides (LPS) dans les cellules BV2 pour simuler les cascades inflammatoires, suivie de la PCR quantitative par immunoprécipitation d’ARN méthylé (MeRIP-qPCR) pour l’analyse m6A. In vivo, nous détaillons l’établissement d’un modèle murin de MP induit par le MPTP, complété par l’administration stéréotaxique de vecteurs du virus adéno-associé de sérotype 9 (AAV9) pour la modulation ciblée de Nrf2 dans le striatum. Les évaluations comportementales englobent le placement des membres antérieurs, l’accélération du rotarod et les tests en plein champ pour quantifier les déficits moteurs, tandis que les tests moléculaires comprennent le Western blot pour les marqueurs de la pyroptose (par exemple, NLRP3, cleaved-caspase-1), le test immuno-enzymatique (ELISA) pour les cytokines et la coloration au dihydroéthidium (DHE) pour la détection des espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les neurones sérotoninergiques. Des techniques de microscopie avancées, telles que l’immunohistochimie pour Iba1 et TPH2, permettent de visualiser la dynamique microgliale et l’intégrité sérotoninergique. Les résultats confirment que la carence en Mettl3 exacerbe la régulation négative de Nrf2, l’hyperactivation de l’inflammasome NLRP3, la mort cellulaire pyroptotique et la dégénérescence des neurones sérotoninergique qui en résulte. Cette méthode fournit non seulement un échafaudage expérimental robuste pour sonder la neuroprotection médiée par m6A, mais met également en évidence des pistes thérapeutiques potentielles pour atténuer la progression de la MP par une modulation ciblée de l’axe Mettl3/Nrf2 dans des contextes neurodégénératifs.

Introduction

La maladie de Parkinson (MP) se classe au deuxième rang des maladies neurodégénératives les plus répandues chez les personnes âgées, touchant environ 2 à 3 % des personnes âgées de 65 ans et plus, ce qui représente un fardeau important pour les familles et la société1. Bien que les mécanismes précis de la MP restent partiellement compris, de plus en plus de preuves indiquent un lien entre le développement de la MP et les défis de la transmission neuronale, ainsi que la neuroinflammation induite par les cellules microgliales, qui est un trait commun observé dans les cerveaux vieillissants et diverses maladies neurodégénératives, y compris 2,3,4,5 . Les microglies servent de cellules immunitaires innées dans le système nerveux central (SNC) et sont essentielles au maintien de l’homéostasie cérébrale6. Cependant, une suractivation persistante de ces microglies peut déclencher des réponses neuro-inflammatoires chroniques, contribuant finalement à la progression de la maladie neurodégénérative.

Les processus inflammatoires centraux et périphériques influencent de manière significative la pathologie de la 7,8. L’activation des cellules microgliales provoque des réponses inflammatoires qui ont un impact sur la survie neuronale9, des preuves émergentes mettant en évidence son amorçage par l’ubiquitine ligases10. Parmi les diverses voies inflammatoires, l’activation de l’inflammasome par NOD, LRR et protéine 3 contenant le domaine pyrine (NLRP3) est le principal contributeur à la régulation inflammatoire microgliale11. L’activation conduit à l’expression de NLRP3 et à l’assemblage ultérieur du complexe inflammasome composé de la protéine adaptatrice du domaine d’activation et de recrutement des caspases (CARD) et de la pro-caspase-1, aboutissant au clivage de la protéine et à la libération de cytokines12. Une activation élevée de NLRP3 a été observée chez des patients atteints de la MP et divers modèles animaux de la maladie, entraînant la mort neuronale. Notamment, l’inhibition de NLRP3 a démontré des effets protecteurs contre la pathologie de la MP dans des modèles murins, soulignant le rôle crucial de l’inflammasome NLRP3 dans l’apparition de la MP13,14.

La signalisation de la sérotonine (5-HT) est un mécanisme important de régulation neuronale, influençant de nombreux comportements et fonctions physiologiques par le biais d’interactions avec au moins 14 sous-types de récepteurs postsynaptiques15,16, y compris les rôles dans la pathologie du SNC comme détaillé dans des aperçus complets17. L’influence neuromodulatrice étendue du système 5-HT est régie par environ 26 000 neurones dans le cerveau des rongeurs18. Alors qu’une littérature abondante associe principalement la MP à la perte de neurones dopaminergiques, la relation entre les neurones 5-HT et la MP est moins examinée de manière approfondie.

La modification de la N6-méthyladénosine (m6A), la modification de l’ARNm la plus répandue dans les cellules eucaryotes, est essentielle à la régulation de l’épissage, de la stabilité et de l’exportation de l’ARNm, influençant ainsi diverses activités cellulaires19. Les niveaux de m6A sont modulés par les méthyltransférases et les déméthylases. Des modifications élevées de m6A dans le cerveau ont été liées au développement neurologique, sa dérégulation étant étroitement liée aux maladies neurodégénératives20,21, y compris l’expression altérée de METTL3 dans les modèles d’Alzheimer22. Par exemple, l’accumulation de méthyltransférase 3 (METTL3) dans la fraction insoluble des tissus cérébraux post-mortem de patients atteints de la maladie d’Alzheimer a été positivement corrélée avec les niveaux de protéine Tau23 insoluble. De plus, une diminution significative des niveaux de m6A dans le striatum peut entraîner une baisse substantielle des niveaux de neurotransmetteurs dopaminergiques24. Notamment, douze polymorphismes mononucléotidiques liés à m6A ont montré des associations significatives avec la susceptibilité à la MP25. Ce protocole établit des méthodologies complètes pour étudier comment les modifications m6A médiées par METTL3 régulent la pyroptose microgliale à travers l’axe Nrf2/NLRP3, affectant finalement la survie des neurones sérotoninergique dans les modèles de MP. Le modèle aigu MPTP in vivo et le modèle LPS in vitro ont été sélectionnés pour leur induction robuste des réponses neuroinflammatoires, bien que les paradigmes chroniques puissent compléter les études futures, comme indiqué ci-dessous.

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Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été menées sous l’approbation du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Hôpital populaire de Feicheng (numéro d’approbation IACUC-2024-118) et réalisées en stricte conformité avec les directives institutionnelles et les principes éthiques établis pour la recherche sur les animaux de laboratoire. Les protocoles d’étude ont permis d’assurer des soins et un traitement sans cruauté de tous les animaux, en mettant l’accent sur la minimisation de la souffrance et de la détresse, tout en respectant à la fois les normes institutionnelles et les directives ARRIVE pour des pratiques de recherche animale responsables.

1. Culture cellulaire et modèle d’activation microgliale

  1. Préparation et maintenance des cellules BV2
    1. Décongelez rapidement les stocks de cellules microgliales BV2 congelées dans un bain d’eau à 37 °C pendant 2 min, en assurant un léger tourbillon pour éviter les chocs thermiques.
    2. Centrifuger la suspension cellulaire décongelée à 300 × g pendant 5 min à température ambiante (RT) pour éliminer le cryoprotecteur.
    3. Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 10 mL de milieu DMEM complet à haute teneur en glucose complété par 10 % de FBS, 1 % de pénicilline-streptomycine et 2 mM de L-glutamine.
    4. Effectuer une évaluation de la viabilité cellulaire à l’aide de la méthode d’exclusion du bleu de trypan (mélanger 10 μL de suspension cellulaire avec 10 μL de bleu de trypan à 0,4 %, compter à l’aide d’un hémocytomètre), en assurant une viabilité de >95 % avant de continuer.
    5. Plaquez les cellules dans des flacons de culture T75 à une densité de 1 × 10 à6 cellules par ballon et maintenez-les dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 37 °C avec 5 % de CO2.
    6. Cellules de passage toutes les 48 h lorsque la confluence est de 80 à 85 % à l’aide des procédures de trypsinisation standard.
      REMARQUE : Maintenir des nombres de passages cohérents (passages 3-8) pour assurer des réponses inflammatoires reproductibles. Toutes les expériences de culture cellulaire ont été répétées indépendamment au moins trois fois, avec trois répétitions techniques par condition pour minimiser la variabilité.
  2. Activation microgliale induite par le LPS
    1. Ensemencer les cellules BV2 en plaques de 6 puits à 2 × 10,5 cellules par puits dans 2 mL de milieu complet 24 h avant le traitement.
    2. Préparer une solution mère de LPS à 1 mg/mL dans du PBS stérile, filtrer la stérilisation à l’aide d’un filtre de 0,22 μm et la conserver dans des aliquotes à usage unique à -20 °C.
    3. Valider l’activité du LPS à l’aide du dosage du lysat d’amébocyte de Limulus (LAL) pour confirmer la concentration d’endotoxines avant chaque expérience26.
    4. Diluer le stock de LPS à une concentration de travail de 1 μg/mL dans du DMEM sans sérum immédiatement avant l’utilisation.
    5. Retirer le milieu de culture des puits et laver les cellules deux fois avec du PBS stérile.
    6. Ajouter 2 mL de milieu contenant du LPS (concentration finale de 1 μg/mL) dans les puits de traitement et du DMEM sans sérum dans les puits témoins.
    7. Incuber les cellules pendant 24 h à 37 °C avec 5 % de CO2 pour l’activation inflammatoire.
    8. Inclure des puits de contrôle positifs traités avec 100 ng/mL de facteur de nécrose tumorale (TNF)-α et des puits de contrôle négatifs avec véhicule seul (PBS) pour valider la réponse inflammatoire.
      REMARQUE : Préparez une solution fraîche de LPS pour chaque expérience afin de maintenir une bioactivité constante. Si la réponse inflammatoire est faible (p. ex., augmentation de < 2 fois la cytokine), vérifiez la stabilité du réactif ou prolongez l’incubation jusqu’à 48 h.
  3. Surexpression et renversement de Mettl3
    1. Concevoir et synthétiser des séquences de petits ARN interférents (siRNA) ciblant Mettl3 et des séquences de contrôle brouillées à l’aide de protocoles standard de synthèse d’oligonucléotides. Sélectionner des séquences cibles de la région codante de l’ARNm de Mettl3 (accession GenBank : NM_019721) avec une longueur de nucléotide de 19 à 21, garantissant un contenu en GC de 40 à 60 %27.
    2. Validez les séquences de siRNA à l’aide de l’analyse BLAST pour confirmer la spécificité et éviter les effets hors cible (assurez-vous d’une homologie de <70 % avec les gènes non cibles).
    3. Préparez des vecteurs de surexpression contenant de l’ADNc Mettl3 complet cloné dans le vecteur pcDNA3.1 à l’aide des sites de restriction EcoRI et XhoI.
    4. Transfectez des cellules à 70-80 % de confluence à l’aide d’un réactif de transfection lipidique cationique :
      1. Mélangez 2 μL de réactif de transfection lipidique cationique avec 50 pmol d’ARNi ou 2 μg d’ADN plasmidique dans 100 μL de milieu Opti-MEM.
      2. Incuber le mélange pendant 15 min à RT.
      3. Ajouter le complexe de transfection goutte à goutte aux cellules et incuber pendant 4 à 6 h avant de passer au milieu complet frais.
    5. Incuber les cellules transfectées pendant 48 h avant le traitement par LPS pour permettre des changements adéquats d’expression des protéines.
    6. Confirmez l’efficacité de la transfection à l’aide de la co-transfection d’un rapporteur fluorescent (100 ng de pEGFP-C1 par puits), en ciblant une efficacité de >70 % par microscopie à fluorescence avant de continuer.

2. Développement de modèles animaux et conception expérimentale

  1. Préparation et randomisation des animaux
    1. Obtenez des souris C57BL/6J du Vital River Laboratory, en assurant des ratios mâles/femelles égaux, âgées de 8 semaines, pesant de 19 à 26 g.
    2. Hébergez les animaux dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes (FPS) avec un cycle lumière-obscurité de 12:12 h, une température contrôlée (22 ± 2 °C) et un taux d’humidité (50-60 %).
    3. Prévoyez une période d’acclimatation de 7 jours avec accès ad libitum à la nourriture standard et à l’eau.
    4. Effectuez des évaluations comportementales de base pendant l’acclimatation : Effectuez des évaluations comportementales complètes, y compris un test de placement des membres antérieurs (10 essais par côté), une évaluation de l’accélération du rotarode (4-40 tr/min sur 5 min) et une analyse de l’activité locomotrice en champ libre (séances de 10 minutes dans un appareil de 50 cm × 50 cm × 50 cm)28,29,30.
    5. Répartissez au hasard les animaux dans des groupes expérimentaux (n = 6 par groupe) à l’aide de la randomisation informatisée afin de minimiser les biais : simulacre, Modèle, Modèle+Nrf2-KD, Modèle+oe-Nrf2.
    6. Mettre en œuvre un modèle expérimental en aveugle où les chercheurs effectuant des évaluations comportementales ne sont pas au courant des affectations de groupe.
  2. Modèle de maladie de Parkinson induite par la 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP)
    1. Préparer une solution de MPTP à 30 mg/kg dans une solution saline stérile immédiatement avant l’injection en dissolvant 15 mg de chlorhydrate de MPTP dans 5 mL de solution saline stérile et en ajustant le volume en fonction du poids de l’animal.
      ATTENTION : Le MPTP est hautement neurotoxique. Manipulez-le dans une hotte chimique avec un équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants doubles et une blouse de laboratoire.
    2. Administrer le MPTP par injection intrapéritonéale à raison de 30 mg/kg de poids corporel (volume d’injection de 10 mL/kg) pendant trois jours consécutifs à la même heure chaque jour (09:00 ± 30 min).
    3. Injecter aux animaux du groupe fictif des volumes équivalents de solution saline stérile en suivant un schéma d’injection identique.
    4. Surveiller quotidiennement les animaux pour détecter des signes de détresse, de perte de poids (>15 % considérés comme critère d’évaluation) ou des effets indésirables pendant la période d’administration du MPTP à l’aide de feuilles de pointage normalisées.
    5. Maintenir les animaux pendant 8 jours après l’injection finale pour permettre le développement de la neurodégénérescence.
      REMARQUE : Les animaux peuvent être logés normalement pendant cette période avec une surveillance continue.
  3. Injection virale stéréotaxique
    1. Préparer des vecteurs viraux AAV9 par triple transfection de cellules HEK293T à l’aide de polyéthylénimine (PEI ; rapport ADN/PEI 1:3), récolter 72 h après la transfection, purifier à l’aide d’une ultracentrifugation à gradient d’iodixanol (177 000 × g pendant 2 h) et concentrer à l’aide de dispositifs de filtration centrifuge pour obtenir 1 × 1012 copies du génome/ml.
    2. Validez le titre viral par réaction en chaîne par polymérase quantitative (PCR) à l’aide d’amorces ciblant les régions ITR, en veillant à ce que les titres atteignent 1 × 10¹² copies du génome/ml avec l’analyse de courbe standard.
    3. Validez le titre viral à l’aide de la PCR quantitative basée sur SYBR Green avec des amorces spécifiques à l’ITR, en effectuant des dilutions en série d’étalons connus et en calculant des copies du génome à l’aide de l’analyse de la courbe standard. Confirmer l’absence de contamination virale compétente pour la réplication à l’aide de l’ELISA p24.
    4. Anesthésier les souris avec de l’isoflurane (induction de 3 %, entretien de 1,5 à 2 %) à un débit d’oxygène de 0,8 à 1,0 L/min à travers un cône nasal, en surveillant la fréquence respiratoire (60 à 100 respirations/min) et le réflexe de pincement des orteils tout au long de la procédure. Fixez la souris dans le cadre stéréotaxique et appliquez une pommade ophtalmique pour prévenir le dessèchement de la cornée.
    5. Fixez la souris dans le cadre stéréotaxique et appliquez une pommade ophtalmique pour prévenir le dessèchement de la cornée.
    6. Faites une incision médiane de 1,5 cm sur la ligne médiane du cuir chevelu à l’aide d’une lame de scalpel stérile et identifiez le point de repère du bregma à l’aide de coordonnées stéréotaxiques avec une précision de 0,1 mm.
    7. Calculer les coordonnées d’injection pour le striatum : antéro-postérieur -0,5 mm, médialo-latéral ±2,0 mm, dorsal-ventral -3,0 mm du bregma.
    8. Effectuer des injections pilotes avec un traceur fluorescent (par exemple, protéine fluorescente verte [GFP]) pour valider la précision du ciblage, confirmant la co-localisation de >80 % avec des marqueurs microgliaux (Iba1) via l’immunohistochimie avant les injections expérimentales.
    9. Abaissez l’aiguille d’injection (33-G) pour cibler la profondeur à un débit de 1 mm/min et injectez 2 μL de suspension virale à 0,2 μL/min à l’aide d’une micro-pousse-seringue munie d’un contrôleur automatisé. Abaissez l’aiguille d’injection à la profondeur cible et injectez 2 μL de suspension virale à un débit de 0,2 μL/min à l’aide d’une micro-pousse-seringue.
    10. Maintenir la position de l’aiguille pendant 5 minutes après l’injection pour éviter le reflux.
    11. Retirez lentement l’aiguille à un taux de 0,5 mm/min, fermez l’incision avec des sutures en soie 4-0 en utilisant un motif interrompu et permettez la récupération de l’anesthésie sur un coussin de récupération chauffé.
    12. Administrer une analgésie postopératoire (carprofène 5 mg/kg par voie sous-cutanée une fois par jour pendant 3 jours) et surveiller la récupération pendant 24 h à l’aide de fiches d’observation détaillées.

3. Techniques de biologie moléculaire et validation

  1. Extraction de l’ARN et contrôle de la qualité
    1. Prélever des cellules ou des échantillons de tissu cérébral striatal immédiatement après les paramètres expérimentaux en euthanasiant les animaux sans cruauté par inhalation de CO2 suivie d’une luxation du col de l’utérus ; disséquer le tissu sur de la glace, l’émincer finement et le dissocier enzymatiquement avec de la trypsine à 0,25 % pendant 10 min à 37 °C si vous prélevez des cellules.
    2. Extraire l’ARN total à l’aide du réactif TRIzol (1 mL par 1, 10,6 cellules ou 100 mg de tissu) avec homogénéisation mécanique (20 à 25 coups dans un homogénéisateur de dénonciation) et séparation de phase du chloroforme (0,2 mL de chloroforme pour 1 mL de TRIzol).
    3. Évaluer la qualité de l’ARN à l’aide de la spectrophotométrie (rapport A260/A280 1,8-2,0) et de l’électrophorèse sur gel (1 % d’agarose) pour confirmer les bandes ribosomales 28S et 18S.
    4. Quantifier la concentration d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre.
    5. Conserver les échantillons d’ARN à -80 °C dans de l’eau exempte de nucléases à -80 °C avec l’ajout d’un inhibiteur de RNase (40 unités/μL) jusqu’à l’analyse.
  2. Fractionnement nucléaire-cytoplasmique
    1. Récoltez les cellules (2 × 106 minimum) et lavez-les deux fois avec du PBS glacé (5 mL par lavage, 5 min de centrifugation à 300 × g).
    2. Utilisez un kit de fractionnement de cellules commercial avec le protocole suivant.
      1. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 200 μL de tampon d’extraction cytoplasmique avec inhibiteurs de protéase.
      2. Incuber sur glace pendant 10 min avec vortex toutes les 3 min.
      3. Centrifuger à 16 000 × g pendant 5 min à 4 °C et prélever le surnageant (fraction cytoplasmique).
      4. Lavez la pastille deux fois avec un tampon d’extraction cytoplasmique.
      5. Remettre la pastille en suspension dans 100 μL de tampon d’extraction nucléaire.
      6. Incuber sur glace pendant 40 min avec vortex toutes les 10 min.
      7. Centrifuger à 16 000 × g pendant 10 min à 4 °C et prélever le surnageant (fraction nucléaire)
    3. Valider l’efficacité du fractionnement en analysant la distribution des marqueurs nucléaires (U6) et cytoplasmiques (GAPDH) à l’aide du Western blot.
    4. Extraire l’ARN des fractions nucléaires et cytoplasmiques séparément.
    5. Analysez les niveaux d’ARNm Nrf2 dans chaque fraction à l’aide de la RT-qPCR avec des gènes de référence spécifiques à la fraction.
  3. PCR quantitative en temps réel (RT-qPCR)
    1. Synthétisez l’ADNc à partir de 1 μg d’ARN total à l’aide d’un kit de réactifs de transcription inverse avec des amorces aléatoires.
    2. Effectuez une qPCR à l’aide du kit Premix Ex Taq II avec des amorces spécifiques au gène sur un système de PCR en temps réel.
    3. Validez la spécificité de l’amorce à l’aide de l’analyse de la courbe de fusion et confirmez un seul amplicon par électrophorèse sur gel.
    4. Utilisez les conditions de cycle thermique suivantes : dénaturation initiale à 95 °C pendant 10 min, suivie de 40 cycles de 95 °C pendant 15 s, 60 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s.
    5. Calculez les niveaux d’expression relatifs de l’ARNm à l’aide de la méthode 2-ΔΔCt avec la β-actine comme référence interne.
    6. Incluez des contrôles sans matrice et validez la stabilité du gène de référence dans des conditions expérimentales à l’aide de l’analyse geNorm (valeur de stabilité M < 0,5).
      REMARQUE : Scores de reproductibilité : coefficient de variation (CV) intra-essai <10 % sur trois cycles indépendants.
  4. MeRIP-qPCR pour l’analyse de modification m6A
    1. Extraire l’ARN total (minimum 20 μg) et le fragmenter en 100-200 nucléotides à l’aide d’un réactif de fragmentation de l’ARN (10 mM ZnCl2, 10 mM Tris-HCl, pH 7,0) à 70 °C pendant 5 min.
    2. Effectuer l’immunoprécipitation à l’aide d’un anticorps spécifique de m6A (2 μg pour 20 μg d’ARN) pendant une nuit à 4 °C avec rotation (10 tr/min) dans un tampon d’immunoprécipitation (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 750 mM NaCl, 0,5 % NP-40).
    3. Validez la spécificité de l’anticorps à l’aide de contrôles d’ARN modifiés et non modifiés connus de m6A.
    4. Laver cinq fois les complexes immunoprécipités avec un tampon de lavage.
    5. L’éluation de l’ARN lié et la transcription inverse à l’aide d’amorces aléatoires.
    6. Transcrit inversement l’ARN élué à l’aide d’amorces aléatoires et effectue une analyse qPCR à l’aide d’amorces spécifiques à Nrf2 couvrant les sites potentiels m6A.
    7. Effectuez une analyse qPCR à l’aide d’amorces spécifiques à Nrf2 et calculez l’enrichissement par rapport à l’ARN d’entrée.
      REMARQUE : Si la détection est incohérente, optimisez le temps de fragmentation (4 à 6 min) pour améliorer la reproductibilité ; benchmark quantitatif : rapport signal/bruit >15:1 par rapport aux contrôles IgG.

4. Analyse et validation des protéines

  1. Extraction et quantification des protéines
    1. Lyser des cellules (1 × 106 cellules ) ou homogénéiser des échantillons de tissus (100 mg de tissu striatal) dans 200 μL de tampon d’essai de radio-immunoprécipitation (RIPA) contenant des inhibiteurs de protéase (1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), 1 μg/mL de leupeptine, 1 μg/mL de pepstatine A) et des inhibiteurs de la phosphatase (1 mM d’orthovanadate de sodium, 5 mM de fluorure de sodium).
    2. Incuber les lysats sur glace pendant 30 min avec vortex périodique (toutes les 10 min pendant 10 s).
    3. Centrifuger à 12 000 × g pendant 15 min à 4 °C pour éliminer les débris cellulaires et recueillir le surnageant.
    4. Quantifier la concentration en protéines à l’aide d’un dosage de l’acide bicinchoninique (BCA) avec des étalons d’albumine sérique bovine (0, 25, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000 μg/mL) en trois exemplaires.
    5. Validez l’intégrité des protéines en analysant les niveaux de protéines d’entretien (GAPDH, MW prévu : 36 kDa) dans tous les échantillons à l’aide du Western blot.
  2. Analyse par transfert Western
    1. Préparez des échantillons de protéines avec une charge égale (30-50 μg) dans un tampon de charge par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate-polyacrylamide de sodium (SDS-PAGE) (concentrations finales : 62,5 mM de Tris-HCl, pH 6,8, 2 % de SDS, 10 % de glycérol, 5 % de β-mercaptoéthanol, 0,003 % de bleu de bromophénol) et dénaturez à 95 °C pendant 5 min.
    2. Séparer les protéines par SDS-PAGE à l’aide de gels de polyacrylamide à 10 %, fonctionnant à 80 V pendant 30 min puis à 120 V pendant 90 min dans un tampon Tris-glycine-SDS.
    3. Transvaser les protéines sur des membranes de fluorure de polyvinylidène (PVDF) à l’aide d’un système de transfert semi-sec (400 mA pendant 90 min) dans un tampon de transfert (25 mM de Tris, 192 mM de glycine, 20 % de méthanol).
    4. Confirmer l’efficacité du transfert à l’aide d’une coloration réversible des protéines (Ponceau S : 0,1 % dans de l’acide acétique à 5 % pendant 5 min) avant de procéder à l’incubation de l’anticorps.
    5. Bloquer les membranes avec 5 % de lait écrémé dans le TBST (TBS + 0,1 % Tween-20) pendant 1 h à RT avec agitation douce.
    6. Incuber avec des anticorps primaires dilués à 1:1000 dans un tampon de blocage pendant une nuit à 4 °C avec une agitation douce.
    7. Laver les membranes trois fois avec du TBST (10 min chacune) et incuber avec des anticorps secondaires conjugués à la HRP (dilution 1:5000) pendant 1 h à RT.
    8. Détectez les bandes de protéines à l’aide de la chimiluminescence améliorée et quantifiez-les à l’aide de la densitométrie.
    9. Normaliser l’expression de la protéine cible jusqu’au contrôle de charge (GAPDH) et valider la spécificité de l’anticorps à l’aide de contrôles appropriés (blocage peptidique pour les anticorps primaires, contrôles secondaires uniquement).

5. Évaluation comportementale et analyse fonctionnelle

  1. Test de placement des membres antérieurs
    1. Laissez la souris s’acclimater à l’environnement de test (pièce calme, 22 °C, éclairage tamisé) pendant 30 minutes avant l’évaluation.
    2. Saisissez doucement la souris par la peau dorsale, en suspendant les quatre membres à environ 0,5 cm au-dessus du bord de la table tout en vous assurant que la souris ne peut pas voir la surface de la table.
    3. Brossez les vibrisses de chaque côté contre le bord de la table pour déclencher le réflexe de placement et enregistrer le placement réussi des membres antérieurs en 2 s.
    4. Effectuez 10 essais par côté avec des intervalles de 30 secondes entre les essais, en alternant les côtés gauche et droit.
    5. Effectuez des tests dans des conditions d’éclairage constantes (50-100 lux) et à l’heure de la journée (13h00-17h00) pour minimiser les influences circadiennes.
    6. Calculez le taux de réussite en pourcentage de placements réussis : (placements réussis/nombre total d’essais) × 100.
  2. Accélération du test de rotation
    1. Réglez l’appareil rotatif à une vitesse initiale de 4 tr/min avec une accélération linéaire à 40 tr/min sur une durée de 5 minutes.
    2. Entraînez les souris sur le rotarode pendant 3 jours consécutifs (3 essais par jour, intervalles de 15 minutes) avant de tester pour minimiser les effets d’apprentissage.
    3. Standardisez les conditions de test, y compris RT (22 ± 2 °C), l’éclairage (100 lux) et les niveaux de bruit de fond (<50 dB).
    4. Placez la souris sur la tige rotative vers l’avant et démarrez immédiatement le protocole d’accélération.
    5. Enregistrez la latence jusqu’à la chute (temps entre le début et la chute de la souris ou la fin de l’essai de 5 minutes) pour chaque essai, en testant 5 fois par animal avec des intervalles de repos de 15 minutes.
    6. Calculez la latence moyenne des trois essais les plus longs afin de minimiser la variabilité due aux facteurs de motivation.
  3. Test en champ ouvert
    1. Utiliser un appareil en plein champ (50 cm × 50 cm × boîte acrylique transparente de 50 cm) avec un système de suivi vidéo positionné à 1 m au-dessus de l’arène.
    2. Nettoyez l’appareil avec de l’éthanol à 70 % entre les animaux (pulvérisation et essuyage, séchage à l’air libre pendant 5 minutes) pour éliminer les signaux d’odeur.
    3. Placez la souris au centre de l’appareil et enregistrez l’activité pendant 10 min sous un éclairage constant (200 lux) avec capture vidéo à 30 ips.
    4. Analysez plusieurs paramètres à l’aide d’un logiciel de suivi automatisé :
      Distance totale parcourue (cm)
      Temps de fuseau central (défini comme 10 cm des murs, indiqué en s)
      Vitesse de déplacement (cm/s)
      Temps passé dans les zones périphériques vs centrales
  4. Définissez la zone centrale à 10 cm des murs et quantifiez le temps passé et la distance parcourue dans les zones centrales par rapport aux zones périphériques.

6. Microscopie et imagerie avancées

  1. Coloration DHE pour la détection des ROS
    1. Préparer une solution fraîche de dihydroéthidium (DHE) à 10 μM dans du PBS immédiatement avant utilisation (à l’abri de la lumière).
    2. Effectuer une coloration par co-immunofluorescence combinant la DHE avec l’anticorps tryptophane hydroxylase 2 (TPH2) (dilution 1:500) pour identifier spécifiquement les neurones sérotoninergiques.
      REMARQUE : Cette approche de double marquage permet de distinguer la production de ROS dans les corps cellulaires neuronaux positifs à TPH2 du stress oxydatif dans les cellules gliales environnantes, sur la base du principe que la DHE, lors de l’oxydation par superoxyde, forme des produits fluorescents imperméatiques à membrane qui restent localisés dans la cellule d’origine.
    3. Incuber des sections de tissu (20 μm d’épaisseur) avec une solution de DHE pendant 30 min à 37 °C dans des conditions sombres dans une chambre humidifiée.
    4. Inclure des témoins négatifs (pas de DHE) et des témoins positifs (traitement 100 μM H2O2 pendant 30 min) pour valider la spécificité de détection des ROS.
    5. Lavez les sections trois fois avec du PBS et fixez-les avec un support de montage anti-décoloration.
    6. Image à l’aide de la microscopie à fluorescence (DHE : excitation de 518 nm/émission de 605 nm, TPH2 : excitation de 488 nm/émission de 525 nm) avec des paramètres d’exposition cohérents (200 ms) sur tous les échantillons ; Les systèmes d’imagerie ont été étalonnés chaque semaine à l’aide de billes de fluorescence standard (rapport signal/bruit > 20:1).
    7. Quantifiez l’intensité de fluorescence dans les cellules TPH2-positives uniquement à l’aide du logiciel ImageJ avec des protocoles d’analyse standardisés (seuil : 50-255, taille des particules : 10-∞ pixels2). Établissez des limites de retour sur investissement basées sur l’immunoréactivité de TPH2 pour assurer la mesure du stress oxydatif spécifiquement dans les neurones sérotoninergiques tout en excluant le signal des microglies, des astrocytes ou d’autres types de cellules adjacents. Pour chaque animal, analysez un minimum de 50 neurones TPH2 positifs sur plusieurs sections de tissus.
  2. Immunohistochimie
    1. Fixer des coupes de tissu dans du paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS pendant 24 h à 4 °C avec une agitation douce.
    2. Déshydrater à travers une série d’éthanol gradué (70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 % × 2, 1 h chacune) et incorporer dans la paraffine à l’aide d’un processeur automatisé.
    3. Coupez des sections de 5 μm à l’aide d’un microtome et montez-les sur des lames de verre chargées, en assurant 3 à 4 sections par lame.
    4. Déparaffiniser les sections à l’aide de xylène (2 × 10 min) et les réhydrater à l’aide d’éthanol gradué en eau.
    5. Effectuer le prélèvement de l’antigène à l’aide d’un tampon de citrate (10 mM de citrate de sodium, pH 6,0) au micro-ondes (750 W pendant 10 min avec des intervalles de refroidissement de 2 minutes).
    6. Validez la spécificité de l’anticorps à l’aide de témoins négatifs appropriés (aucun anticorps primaire) et de tissus témoins positifs (sections de cerveau connues pour exprimer des protéines cibles).
    7. Bloquer l’activité de la peroxydase endogène avec 3 % de peroxyde d’hydrogène dans du méthanol pendant 10 min à RT.
    8. Appliquez les anticorps primaires pendant une nuit à 4 °C dans une chambre humidifiée.
    9. Détecter à l’aide d’anticorps secondaires conjugués à la HRP (dilution 1:500, 1 h à RT) et du chromogène DAB (incuber jusqu’à ce que la couleur brune se développe, généralement 2 à 5 min).
    10. Contre-colorer avec de l’hématoxyline (30 s), déshydrater, effacer et monter avec un support de montage permanent.
    11. Quantifier les cellules positives à l’aide de méthodes stéréologiques avec échantillonnage aléatoire systématique (toutes les 5 sections, 3 images de comptage par section, grossissement de 40×).

7. Analyse statistique et validation des données

  1. Conception et analyse statistiques
    1. Effectuez une analyse de puissance pour déterminer des tailles d’échantillon adéquates pour détecter des différences biologiquement significatives (taille de l’effet ≥ 0,8, puissance ≥ 0,80, α = 0,05) à l’aide du logiciel G*Power 3.1.9.7.
    2. Validez la normalité des données à l’aide du test de Shapiro-Wilk et évaluez l’homogénéité de la variance à l’aide du test de Levene avant l’analyse paramétrique.
    3. Analyser les données à l’aide d’un logiciel statistique avec des tests statistiques appropriés basés sur la conception expérimentale et la distribution des données.
    4. Appliquer l’analyse de variance à un facteur (ANOVA) pour les comparaisons à facteur unique et l’ANOVA à deux facteurs pour les plans factoriels (p. ex., interactions entre le traitement × le temps).
    5. Utilisez le test post hoc de Tukey pour des comparaisons multiples lorsque l’ANOVA montre une signification (p < 0,05), en appliquant la correction de Bonferroni le cas échéant.
    6. Fixez le seuil de signification statistique à p < 0,05 pour toutes les analyses avec une notation supplémentaire pour p < 0,01 et p < 0,001.
    7. Rapportez les tailles d’effet (d de Cohen ou η2) et les intervalles de confiance à 95 % avec les valeurs p pour fournir une interprétation statistique complète.
    8. Présenter les données sous forme ± moyenne MEB à partir d’un minimum de trois expériences indépendantes, avec des points de données individuels indiqués lorsque n ≤ 10.
      REMARQUE : Toutes les expériences de culture cellulaire doivent être répétées indépendamment au moins trois fois, chaque expérience comprenant des témoins appropriés et de multiples répétitions techniques, et la variabilité observée (p. ex., CV <15 % pour les données comportementales) a été minimisée grâce à l’insu et au chronométrage normalisé.

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Résultats

Le protocole démontre avec succès que l’expression de Mettl3 diminue dans les cellules microgliales traitées au LPS (Figure 1), comme en témoignent les réductions des niveaux d’ARNm et de protéines par rapport aux groupes témoins (Figure 1B,C). L’analyse ELISA confirme l’activation inflammatoire réussie médiée par le LPS grâce à des niveaux élevés d’IL-6 et de TNF-α dans les surnageants de culture (Figure 1A...

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Discussion

Plusieurs étapes critiques nécessitent une attention particulière pour garantir des résultats reproductibles. Le moment de l’activation du LPS est crucial - les réponses inflammatoires atteignent leur apogée 24 heures après le traitement, et nous recommandons fortement de préparer une solution fraîche de LPS pour chaque expérience, car les solutions stockées peuvent perdre de la bioactivité19,20. Pour l’analyse MeRIP-qPCR, la qua...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent ou conflit d’intérêts lié à ce travail. Aucun auteur n’a de relation financière avec des entreprises dont les produits sont mentionnés dans cet article.

Remerciements

Les auteurs remercient le personnel technique de l’hôpital populaire de Feicheng et de l’hôpital Yantai Yantaishan pour leur aide dans les procédures expérimentales et les soins aux animaux.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Vecteurs viraux AAV9Installation de cœur vectorielCoutumeContenant des constructions Nrf2
Rotarod accélérateurUgo Basile47600Pour les tests comportementaux
Anticorps anti-GAPDHTechnologie de signalisation cellulaire5174Anticorps primaire, 1:5000
Anticorps anti-GSDMDAbcamab219800Anticorps primaire, 1:1000
Anticorps anti-Iba1Wako019-19741Anticorps primaire, 1:500
Anticorps anti-NLRP3AdipoGenAG-20B-0014Anticorps primaire, 1:1000
Anticorps anti-Nrf2Abcamab62352Anticorps primaire, 1:1000
Anticorps anti-SLC6A4Novus BiologicalsNBP1-85726Anticorps primaire, 1:500
Anticorps anti-TPH2MilliporeMAB847Anticorps primaire, 1:500
Kit de test protéique BCAPercer23225Pour la quantification des protéines
Microcellules microgliales BV2Biologie de ShengenSG-BV2Lignée cellulaire microgliale de souris
Souris C57BL/6JLaboratoire Vital River213Bébé de 8 semaines, 19-26 g
Kit de fractionnement cellulaireTechnologie de signalisation cellulaire9038Séparation nucléaire-cytoplasmique
DMEM complet à haute glycémieGibco11965092Milieu de culture cellulaire
Chromogène DABLaboratoires VectorSK-4100Pour l’immunohistochimie
Perceuse dentaireOutils scientifiques finement18000-17Pour le forage par trou de meule
DHE (Dihydroethidium)Sondes moléculairesD11347Détection ROS
Kit ELISA (IL-1&bêta ;)R& Systèmes DMLB00CMouse IL-1 et bêta ; détection
Kit ELISA (IL-18)R& Systèmes D7625Détection de l’IL-18 de la souris
Kit ELISA (IL-6)R& Systèmes DM6000BDétection de l’IL-6 par souris
Kit ELISA (TNF-&alpha ;)R& Systèmes DMTA00BSouris TNF-& alpha ; détection
Sérum fœtal bovinGibco16000044Supplément de culture cellulaire
Anticorps secondaire conjugué HRPJackson ImmunoResearch111-035-003Anti-lapin, 1:10000
IsofluraneSciences de la vie RWDR510-22Agent anesthésique
Kit d’analyse LALLonza50-647UValidation de l’activité LPS
Réactif de transfectation de lipofectamineInvitrogen11668019Pour la transfection cellulaire
LPS (Lipopolysaccharide)Sigma-AldrichL2630D’E. coli, 1 mg/mL de stock
Anticorps m6ASystèmes synaptiques202003Pour MeRIP, 1:200
Pompe à microseringueAppareil de Harvard70-3007Pour l’injection stéréotaxique
MPTPSigma-AldrichM0896Neurotoxine, 30 mg/kg
Appareil de champ ouvertLABYRINTHE ANYCoutume50 cm et aigu ; 50 cm et aigu ; 50 cm
ParaformaldéhydeSigma-AldrichP61484 % dans PBS
Vecteur pcDNA3.1InvitrogenV79020Vecteur d’expression
Pénicilline-StreptomycineGibco15140122Solution antibiotique
Kit prémix Ex Taq IITakaraRR820APour la qPCR
PrimeScript RT KitTakaraRR037ATranscription inversée
Membrane PVDFMilliporeIPVH00010Pour la tache occidentale
Tampon RIPATechnologie de signalisation cellulaire9806Extraction des protéines
siRNA (Mettl3)RiboBioCoutumeValidation de la séquence cible
Cadre stéréotaxiqueSciences de la vie RWD68001Pour la chirurgie du cerveau
Réactif TrizolInvitrogen15596026Extraction d’ARN
Bleu de trypanSigma-AldrichT8154Coloration de viabilité cellulaire

Références

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