Collection multi-organes à partir de modèles murins pour les études sur le vieillissement

Résumé

Ce protocole propose une méthode standardisée pour la collecte d’organes chez les souris jeunes et âgées afin d’évaluer les changements anatomiques et histologiques liés à l’âge sur plusieurs tissus, soutenant à la fois la conception expérimentale éthique et rentable.

Résumé

Le vieillissement est un processus biologique systémique et multifactoriel qui affecte progressivement presque tous les organes et tissus, entraînant des altérations structurelles, cellulaires et moléculaires. Ce protocole présente une approche standardisée et reproductible pour évaluer les changements anatomiques et morphologiques liés à l’âge chez la souris, à travers une collecte complète d’organes pour des analyses histologiques et moléculaires ultérieures. En utilisant des souris jeunes (2-3 mois) et âgées (20-24 mois), nous détaillons les procédures étape par étape pour la dissection anatomique macroscopique et la prélèvement systématique des organes majeurs pour le coupe en aval, la coloration histologique et l’évaluation microscopique. Le protocole permet de prélever une large gamme d’organes et de tissus (y compris le cerveau, les yeux, l’œsophage, le thymus, le cœur, l’aorte, les poumons, les ganglions lymphatiques, le foie, le pancréas, l’estomac, l’intestin grêle, le côlon, la rate, le rein, la vessie, la peau, le muscle squelettique, l’os et le tissu adipeux) à partir d’un seul animal. En maximisant le rendement des données par sujet, ce flux de travail soutient une utilisation éthique des animaux par la réduction, améliore la reproductibilité entre les études et facilite des analyses intégratives du vieillissement de l’organisme.

Introduction

Le vieillissement est un processus systémique qui touche presque tous les organes, pourtant la plupart des études expérimentales se concentrent sur un seul tissu, limitant ainsi les connaissances sur la manière dont les changements liés à l’âge co-se produisent ou interagissent à travers le corps. Le vieillissement se manifeste par des altérations spécifiques et systémiques spécifiques aux tissus, notamment des dysfonctionnements immunitaires, des changements métaboliques, une perte de capacité régénératrice et une dégénérescence^{structurelle 1,2}. Bien que les recherches spécifiques aux organes aient apporté des informations précieuses, une perspective plus large est nécessaire pour comprendre comment le vieillissement cellulaire à travers les systèmes contribue au déclin de l’organisme global. L’analyse multi-organiques dans des modèles précliniques in vivo, comme chez la souris, est essentielle pour identifier les changements structurels, cellulaires et moléculaires coordonnés qui contribuent aux maladies associées à l’âge et à la perte de résilience^{physiologique 3,4}.

La souris de laboratoire reste un modèle préclinique essentiel et bien établi pour la recherche sur le vieillissement grâce à sa facilité génétique, sa courte espérance de vie, ses voies de vieillissement conservées et sa capacité à reproduire des caractéristiques clés du vieillissement humain, notamment le dysfonctionnement immunitaire, la fibrose tissulaire, le déclin métabolique et l’augmentation de la^{néoplasie 5,6,7}. Cependant, les protocoles de dissection multiorganes efficaces et standardisés ne sont pas largement utilisés. De tels protocoles sont nécessaires pour optimiser les comparaisons histologiques, réduire l’utilisation animale et intégrer des ensembles de données omiques entre les tissus du même^{sujet 8,9}.

Ici, nous présentons un protocole reproductible et efficace en termes de temps pour la perfusion, la dissection et la conservation multi-organes chez la souris. Ce protocole fournit un guide étape par étape pour la dissection anatomique et la collecte des principaux organes chez des souris jeunes (2-3 mois) et âgées (20-24 mois), y compris le cerveau, les yeux, le thymus, le cœur, les poumons, l’aorte, les ganglions lymphatiques inguinaux, le tractus gastro-intestinal (œsophage, estomac, intestin grêle, côlon), le foie, le pancréas, la rate, les reins, la vessie, le tissu adipeux, le muscle squelettique, l’os et la peau. Des instructions détaillées pour la préservation des tissus, compatibles avec les flux de travail histologiques, moléculaires et de cryosection, sont incluses. Cette approche standardisée permet aux chercheurs d’évaluer les caractéristiques spécifiques et systémiques du vieillissement au sein des mêmes sujets expérimentaux, soutenant une recherche intégrée et de haute qualité sur le^{vieillissement} 4,10,11,12.

Protocole

Les souris C57BL/6J étaient maintenues à l’Université de Californie à San Francisco. Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) et supervisées par le Centre de ressources pour animaux de laboratoire. Les souris étaient hébergées sous un cycle clair-obscur de 12 heures, avec moins de cinq souris adultes par cage. L’euthanasie a été réalisée conformément aux directives de l’American Veterinary Medical Association (AVMA) pour l’euthanasie des^{animaux 13}. Pour ce protocole, les jeunes souris étaient sacrifiées à 3 mois, et les souris âgées à 22 mois. Avant de procéder à la dissection et à la collecte des organes, imprimez et complétez la liste de contrôle de la préparation (Tableau 1) et la liste de contrôle de la collecte des tissus (Tableau 2). Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Luxation cervicale

REMARQUE : La luxation cervicale doit être réalisée par une personne formée afin de minimiser les traumatismes excessifs des structures cervicales.

1. Attachez la souris en saisissant fermement la base de la queue d’une main.
2. Placez le pouce et l’index de la main opposée à la base du crâne.
3. Appliquez une pression ferme et rapide pour déboîter les vertèbres cervicales. Palper le cou pour confirmer la séparation entre le crâne et les vertèbres adjacentes.
4. Confirmez l’euthanasie réussie (en suivant des protocoles approuvés par l’institution) en veillant à l’arrêt respiratoire et à l’absence de réponses aux stimuli toxiques avant de procéder.
5. Notez le poids corporel de la souris avant la perfusion et la collecte des tissus.

2. Thoracotomie et perfusion

REMARQUE : La perfusion est optionnelle. Effectuer toutes les procédures impliquant le paraformel (PFA) dans une hotte chimique certifiée tout en portant un équipement de protection individuelle (EPI) approprié, y compris une blouse de laboratoire, des gants en nitrile et des lunettes de sécurité. Éliminer les solutions PFA conformément aux directives institutionnelles de sécurité chimique. Collectez tous les déchets PFA et matériaux contaminés (par exemple, gants, mouchoirs, contenants) dans un contenant de déchets dangereux clairement étiqueté et éliminez-les via le bureau de la santé et sécurité environnementale de l’établissement, en suivant les protocoles conformes aux réglementations locales, étatiques et fédérales.

ATTENTION : Si vous utilisez du paraformaldéhyde (PFA) pour la fixation, effectuez toutes les étapes sous une hotte pour éviter toute exposition aux vapeurs de formaldéhyde.

1. Placez un couvercle en polystyrène recouvert d’un matériau absorbant pour recueillir le liquide de la perfusion dans un bac de collecte. Placez la souris sur cette surface de dissection en position couchée et fixez les membres avec des goupilles pour stabiliser le corps : les membres antérieurs positionnés latéralement pour ouvrir la cavité thoracique et les membres postérieurs étendus caudalement pour créer une légère tension sur la paroi abdominale.
   REMARQUE : Ce positionnement améliore la visibilité, minimise les obstructions et maximise l’espace de travail pour la collecte des orgues.
2. Appliquez 70 % d’éthanol sur la zone thoracique.
3. Utilisez des ciseaux acérés pour réaliser une incision transversale au niveau du diaphragme, suivie de deux coupures en V s’étendant pour exposer la cage thoracique (Figure 1A).
4. À l’aide de pinces émoussées, soulevez doucement la peau et coupez soigneusement les derniers éléments pour exposer complètement la zone thoracique.
5. Réalisez deux incisions en forme de V d’environ 2 cm de long de chaque côté de la cage thoracique pour ouvrir la cavité thoracique.
6. Tirez sur le sternum et épinglez-le sur l’épaule de la souris en même temps que la tête.
7. À l’aide de pinces émoussées, exposez soigneusement le cœur. Retirez toute bulle d’air piégée de la ligne de perfusion, puis insérez une aiguille ou une canule papillon à l’extrémité du ventricule gauche à une profondeur d’environ 3 à 4 mm. Effectuer une incision d’environ 5 mm de long dans l’oreillette droite pour permettre l’écoulement du perfusé (Figure 1B).
8. Commencez la perfusion avec une solution physiologique sans calcium et magnésium (par exemple, PBS, sérum physiologique ou HBSS) pour dégager le système circulatoire.
   REMARQUE : La perfusion peut être réalisée à l’aide d’une seringue de 20 mL, d’une pompe ou d’un système alimenté par gravité. En moyenne, 15 à 20 mL de solution de perfusion par souris sont nécessaires pour obtenir une élimination complète du sang dans la vasculature. Une bonne perfusion s’indique par un dégagement rapide (blanchiment) du foie et des poumons, ainsi que par une pâleur de la zone buccale et de la langue. Une perfusion complète entraînera un écoulement clair et sans sang du cœur.
9. Si désiré, initiez la perfusion PFA en passant la ligne de perfusion d’une solution physiologique sans calcium et magnésium (utilisée pour le pré-rinçage et l’extraction sanguine) à une seringue de 50 mL contenant 4 % de paraformoldéhyde (PFA), tout en maintenant l’aiguille en place. Veillez à ne pas introduire de bulles d’air dans la conduite. Continuez la perfusion avec 4 % de PFA jusqu’à ce que le degré de fixation désiré soit jugé par le raidissement progressif du corps. Environ 30 mL de fixateur suffisent pour une seule souris.

3. Collecte d’organes et de tissus

REMARQUE : La séquence de collecte des organes est cruciale lors de la comparaison entre souris jeunes et âgées. Les organes chez les animaux âgés ont tendance à être fragiles et susceptibles d’être autolysés ou de dommages mécaniques, ce qui rend essentiel une manipulation rapide et régulière des tissus. Standardiser l’ordre de collecte minimise la variabilité post-mortem, réduit la manipulation des artefacts et garantit une fixation uniforme de la qualité entre les^{animaux 14,15}. La cohérence est essentielle pour détecter des changements morphologiques subtils liés à l’âge, car un échantillonnage retardé ou incohérent peut introduire un biais. Si la perfusion PFA n’a pas été réalisée, les organes doivent être prélevés rapidement. Le pancréas, l’estomac, les poumons et le cerveau sont particulièrement sujets à une autolyse rapide et à une dégradation histologique s’ils ne sont pas traités immédiatement. Comme les souris âgées développent fréquemment des lésions néoplasiques, examinez attentivement la rate, le foie, les ganglions lymphatiques, les poumons et le thymus pour détecter une asymétrie, un agrandissement des lieux, des nodules ou des décolorations. Consignez ces résultats dans le cadre de la charge globale de la maladie (voir Tableau 2).

1. Commencez par l’animal en position couchée après une perfusion ou une luxation cervicale pour collecter les principaux organes des cavités thoracique et abdominale (Figure 1C).
2. Appliquez doucement de l’éthanol à 70 % à l’aide de gaze ou d’un vaporisateur après l’épinglage, ce qui minimise la contamination du poil et maintient l’hydratation des tissus dans les zones sensibles. Cette méthode s’est avérée efficace pour nos mains afin de réduire les débris de fourrure et d’améliorer la visibilité lors de la dissection tout en évitant les inconvénients de l’immersion totale.
3. À l’aide de ciseaux et de pinces émoussées, ouvrez soigneusement la cavité abdominale en pratiquant une incision médiane du diaphragme jusqu’au bassin, suivie de deux incisions latérales indiquées par les lignes rouges de la Figure 1A. Remontez la peau et la paroi abdominale pour exposer complètement les organes internes.
4. Estomac, intestin grêle et côlon : Détacher l’estomac à la jonction œsophagienne tout en laissant l’extrémité pylorique continue avec l’intestin grêle. Libérez doucement le tube digestif en sectionnant les ligaments de soutien, puis retirez le tractus, y compris l’intestin grêle et le côlon. Coupez distalement au niveau du rectum.
   1. Pour éliminer le contenu luminal, sectionner l’intestin grêle proximalement à la flexion duodénojjunale et distalement à la jonction iléocécale. Pour le côlon, séparez proximalement au niveau du cécum. Rincez l’intestin grêle et le côlon avec environ 20 mL de solution physiologique à l’aide d’une seringue équipée d’une aiguille d’alimentation, tout en fixant doucement le tissu avec des pinces à pointe fine pour éviter les dommages.
5. Œsophage : Isoler l’œsophage du col de l’utérus à la jonction gastrique.
6. Rate et pancréas : Isoler la rate et le pancréas des tissus environnants à l’aide d’une dissection fine, minimisant ainsi les dommages mécaniques. Détache soigneusement le pancréas de la rate. Disséquez et coupez immédiatement le pancréas en petits morceaux (≤5 mm) et immergez-les dans un fixateur dans les 5 minutes suivant l’euthanasie pour minimiser l’autolyse et préserver une morphologie tissulaire optimale. Inspectez la rate, notant la taille, la couleur, la forme et la présence d’anomalies visibles.
7. Foie : À l’aide de pinces fines à pointe, saisissez le tissu conjonctif central entre les lobes hépatiques et tirez doucement vers le haut pour créer de la tension. Avec des ciseaux de dissection, coupez soigneusement toutes les attaches entre le foie et les organes adjacents. Inspectez le foie pour la coloration, la consistance et la présence de nodules ou d’autres anomalies.
8. Graisse viscérale : Prélever des échantillons de dépôts viscéraux adipos.
   REMARQUE : Les jeunes animaux ont généralement peu de graisse viscérale, tandis que les animaux âgés présentent souvent une accumulation accrue de graisse, notamment autour des intestins, des reins et des régions gonadiques.
9. Reins et vessie : Retirez les deux reins ainsi que les uretères et vessie attachés. Détachez soigneusement les reins du tissu adipeux environnant et des structures conjonctives à l’aide de ciseaux fins ou de pinces émoussées. Suivez les uretères distalement jusqu’à la vessie, en coupant les dernières attaches pour isoler l’ensemble des voies urinaires. Inspectez les reins et la vessie pour détecter la taille, la couleur et les anomalies avant de procéder à un traitement supplémentaire.
10. Ganglions lymphatiques : Rétractez la peau du péritoine pour exposer la région inguinale. Identifiez les ganglions lymphatiques situés dans le coussin adipeux mammaire le long des vaisseaux lymphatiques. Isoler et retirer les ganglions avec des pinces à pointe fine, minimisant ainsi la perturbation de la graisse et du tissu conjonctif environnants.
11. Cœur : Retirez soigneusement le cœur en sectionnant les principaux vaisseaux.
12. Thymus : Éciser soigneusement le thymus pour préserver sa structure. Sachez que le thymus subit une involution avec l’âge, et chez les souris âgées, seul un tissu thymique minimal ou pas peut être présent.
13. Poumons : À l’aide de ciseaux tranchants et de pinces à pointe fine, retirez soigneusement les poumons ainsi que la trachée attachée en un seul morceau.
14. Aorte : insérer des pinces fermées entre l’aorte et la colonne vertébrale et déloger doucement l’aorte, la séparant le long de la face dorsale. Faites attention à ne pas déchirer le vaisseau. À l’aide de pinces à pointe fine, retirez soigneusement les tissus adipeux et conjonctifs environnants de l’aorte au microscope de dissection.
15. Muscle squelettique : Réséquer la peau au-dessus des membres postérieurs pour exposer le fémur et la musculature environnante. À l’aide de ciseaux fins, isolez soigneusement les muscles attachés au fémur en les détachant du tissu conjonctif environnant et en sectionnant les insertions des tendons afin de préserver l’intégrité des fibres.
16. Os (tibia) : À l’aide de ciseaux de dissection, réséquez la peau et les muscles qui le recoexistent pour exposer le tibia. À l’aide de ciseaux de dissection et de pinces émoussées, détachez soigneusement le tibia au niveau des articulations du genou et de la cheville. Retirez tout tissu mou restant sans endommager l’os.
17. Yeux : À l’aide de grands ciseaux de dissection, décapitez la souris. Retirez soigneusement les yeux à l’aide de pinces à pointe fine.
18. Cerveau : Réséquer le cuir chevelu pour exposer l’antérieur du crâne. À l’aide de ciseaux tranchants ou d’un scalpel, suivez les sutures crâniennes et soulevez les segments osseux pour exposer le cerveau (Figure 1D). Coupez les bulbes olfactifs et les attaches ventrales. Extraire doucement le cerveau de la cavité crânienne. Traiter le tissu immédiatement pour maintenir la morphologie.
19. Peau : Si l’épilation est nécessaire pour les applications en aval, enlevez les poils à l’aide d’une tondeuse électrique. Pincez une partie de la peau du dos avec des pinces émoussées, excisez avec des ciseaux, puis collectez le tissu pour un traitement ultérieur.
20. Après avoir retiré tous les organes d’intérêt, placez la carcasse entière de la souris dans un récipient de 450 mL pré-rempli de 4 % de PFA afin d’archiver les résultats inattendus ou de répondre aux questions des évaluateurs nécessitant un retour dans un tissu humide fixé.

4. Préservation et traitement des tissus

REMARQUE : Pour préserver l’intégrité des tissus, minimisez le temps entre la dissection et la préservation. Les retards peuvent compromettre la morphologie tissulaire et la qualité moléculaire ; d’autres détails sur le moment critique de la collecte et de la préservation des tissus sont présentés dans le tableau 2.

ATTENTION : Si vous utilisez du paraformaldéhyde (PFA) pour fixer, effectuez toutes les étapes à l’intérieur d’une hotte pour éviter toute exposition aux vapeurs de formaldéhyde.

1. Traiter les tissus immédiatement après la dissection, en sélectionnant le protocole approprié (étape 4.1, 4.2 ou 4.3) selon l’application en aval prévue.
   1. Fixation du paraformaldéhyde (PFA) : placer les tissus destinés à l’analyse histologique dans un PFA à 4 % à 4 °C pendant 12 à 24 heures. Après fixation, lavez soigneusement les tissus avec du sérum physiologique tamponné phosphate (PBS) pour éliminer les résidus fixateurs, puis transférez-les à 70 % d’éthanol pour stockage jusqu’à l’intégration et la coupe de la paraffine.
2. Incorporation du composé à température de coupe optimale (OCT) : Incorporez de nouveaux tissus dans le composé OCT. Placez les mouchoirs dans des moules d’incrustation remplis de composé OCT, en éliminant les bulles d’air, incubez pendant 5 minutes à température ambiante, puis congelez en phase vapeur d’azote liquide. Scellez avec du papier aluminium et conservez les blocs OCT à −80 °C jusqu’à la coupe.
3. Congélation instantanée en phase vapeur d’azote liquide : tissus à congélation instantanée destinés à l’analyse d’ARN, de protéines ou de métabolites en phase vapeur de l’azote liquide afin de minimiser la formation de cristaux de glace. Placez les tissus dans des cryotubes marqués et suspendez-les au-dessus de l’azote liquide pour une congélation rapide. Une fois complètement congelé, transférez les échantillons dans un stockage à −80 °C.

Résultats

Lors de la nécropsie, les souris âgées présentent fréquemment des lésions néoplasiques et nécessitent un examen minutieux pour documenter les résultats^{pathologiques} 13,14,16,17,18. La figure 2A montre un mâle C57BL/6 de 22 mois en position couchée après perfusion. Un blanchiment complet des poumons confirme une perfusion efficace, tandis que le foie ne présente qu’un blanchissement partiel. Un examen plus attentif du foie a révélé de multiples nodules malins (Figure 2B), accompagnés de vésicules séminales élargies (Figure 2A) et de splénomégalie (Figure 2C). Ces résultats sont fréquents chez les souris âgées et doivent être documentés dans le cadre de la charge totale de la maladie¹⁸.

La figure 3 montre des organes macroscopiquement normaux collectés après dissection et perfusion, permettant d’évaluer l’intégrité anatomique et l’efficacité de la perfusion. Le tube digestif a été rincé avec une solution physiologique pour éliminer le contenu digéré, ce qui a donné un aspect propre et translucide de l’estomac, du côlon et de l’intestin grêle (Figure 3A). D’autres structures, notamment l’œsophage, le pancréas, la rate, les dépôts viscéraux d’adipeux, les reins avec vessie, les ganglions lymphatiques, le cœur et le thymus, étaient clairement identifiables et pouvaient être isolés intacts pour des analyses en aval (Figure 3B, C, E-I).

La qualité de la perfusion a été évaluée en examinant le blanchiment dans des tissus fortement vascularisés. Comme le montrent les figures 3D et 3J, le foie et les poumons présentaient des différences nettes entre les affections non perfusées, bien perfusées et partiellement perfusées. Un blanchiment complet a confirmé une perfusion réussie, tandis qu’un blanchiment incomplet a indiqué une variabilité technique ou des anomalies sous-jacentes. D’autres tissus, dont l’aorte, le muscle squelettique, le tibia, le cerveau, l’œil et la peau, ont été isolés avec une morphologie préservée, adaptée à des applications histologiques, moléculaires ou d’imagerie ultérieures (Figure 3K-P). Cette procédure de dissection standardisée permet une récupération constante de tissus et d’organes intacts et bien préservés et permet une évaluation anatomique globale pour soutenir diverses analyses en aval. La dissection et la collecte d’organes nécessitaient environ 40 à 60 minutes par animal, selon l’expérience de l’opérateur et la présence de résultats pathologiques.

La figure 4 montre des changements exemplaires associés au vieillissement dans les organes collectés après l’inclusion de paraffine, le coupage et la coloration de l’hématoxyline et de l’éosine (H&E). Dans les sections cutanées de souris âgées, un amincissement épithélial et une perte de follicules pileux ont été observés par rapport aux témoins jeunes (Figure 4A). Les coupes rénales ont révélé une augmentation des capsules de Bowman ainsi que des modifications fibrotiques et nécrotiques, ainsi que des zones compatibles avec des lymphomes (Figure 4B). Dans les sections pancréatiques, une augmentation des corps apoptotiques¹⁹ et des régions lymphomateuses a été observée chez des animaux âgés, indiquant une intégrité tissulaire compromise avec l’âge (Figure 4C). Les sections de rate représentaient des dépôts d’amyloïdes et des régions lymphomiques chez des animaux âgés, reflétant d’autres caractéristiques de pathologies liées à l’âge (Figure 4D).

Ces résultats mettent en lumière des caractéristiques histopathologiques représentatives du vieillissement à travers plusieurs tissus, démontrant l’utilité de ce protocole pour détecter les signes structurels du déclin lié à l’âge.

Figure 1 : Aperçu schématique des procédures de dissection et d’exposition des organes de la souris. (A) Sites d’incision pour ouvrir les cavités thoracique et abdominale (lignes rouges), incluant une incision transversale au niveau du diaphragme, suivie de coupures en V de chaque côté de la cage thoracique pour ouvrir la cavité thoracique, et une incision médiane du diaphragme au bassin avec des coupures bilatérales pour exposer complètement la cavité abdominale. (B) Installation de perfusion montrant l’insertion d’une aiguille papillon dans le ventricule gauche et l’incision de l’oreillette droite pour permettre un drainage sanguin efficace. (C) Disposition anatomique des principaux organes thoraciques et abdominaux après exposition à la cavité. (D) Étapes de dissection de la tête, incluant l’ablation du cuir chevelu et l’ouverture du crâne le long des sutures crâniennes pour exposer le cerveau. Les lignes rouges indiquent les sites d’incision. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Identification des lésions néoplasiques chez des souris âgées. (A) Souris représentative de 22 mois mâle C57BL/6 en position couchée après perfusion avec 4 % de PFA. Un blanchiment complet des poumons (pointe de flèche rose) confirme une perfusion efficace, tandis que le foie (pointe verte) ne présente que un blanchiment partiel. Les pointes de flèches bleues indiquent des vésicules séminales agrandies. (B) Vue détaillée du foie révélant plusieurs nodules malins (pointes de flèches noires). (C) Rate élargie chez une souris âgée C57BL/6 (côté droit) par rapport à une rate normale d’un jeune animal (côté gauche). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Aperçu des principaux organes et de l’intégrité tissulaire de la souris après dissection et perfusion. (A) Estomac, intestin grêle et côlon avant et après le rinçage avec une solution physiologique pour éliminer le contenu digéré. (B) Œsophage. (C) Pancréas avec rate attachée. (D) Foie sans perfusion, avec blanchiment complet après perfusion effective, et avec blanchiment partiel indiquant une perfusion incomplète ou une pathologie sous-jacente. (E) Tissu adipeux viscéral. (F) Reins avec vessie attachée. (G) Ganglions lymphatiques inguinaux. (H) Cœur. (I) Thymus. (J) Poumons sans perfusion, avec blanchiment complet après perfusion effective, et blanchissement partiel. (K) Aorte. (L) Muscle squelettique isolé du membre postérieur. (M) Tibia avec structure osseuse préservée. (N) Cerveau. (O) Œil. (P) Peau. Barres d’échelle : 5 mm en A, C, D, E, F, J, L, N, P ; 1 mm dans tous les autres panneaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4 : Analyse histologique des principaux organes utilisant la coloration par hématoxyline et éosine (H&E). (A) Sections cutanées de souris de 3 mois (jeunes) et de 22 mois (âgées). Les sections d’animaux âgés montrent un amincissement épithélial et une perte de follicules pileux. (B) Des coupes rénales mettant en avant les capsules de Bowman. Les sections d’animaux âgés montrent un agrandissement des capsules, des changements fibrotiques et nécrotiques, ainsi que des lymphomes (pointes de flèches orange). (C) Sections pancréatiques chez des animaux jeunes et âgés, avec des animaux âgés présentant des corps apoptotiques accrus (pointes de flèches bleues) et des régions lymphomiques (pointes de flèches orange). (D) Sections de rate chez des souris de 3 mois (jeunes) et de 22 mois (âgées). Les sections d’animaux âgés présentent des dépôts d’amyloïdes (pointes de flèches vert lime) et des régions lymphométiques. Barre-échelle (A-C) 100 μm. Barre d’échelle (D) 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Liste de contrôle de la préparation. Une liste étape par étape des préparations essentielles pour la dissection et la préservation des tissus de souris, incluant l’étiquetage des tubes et des moisissures, la préparation des tampons et des fixatifs, la mise en place pour l’incrustation cryogénique, la stérilisation des outils de dissection, l’agencement des postes de travail et la planification de la documentation. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Liste de contrôle pour la collecte de tissus. Utilisez la table pour enregistrer les mouchoirs collectés. Ajoutez le temps de collecte et des notes sur l’état ou les anomalies. Priorisez les tissus essentiels à votre étude ; Collectez les organes les plus pertinents dans le délai recommandé pour éviter l’autolyse/dégradation tissulaire.*Notez toute anomalie (y compris décoloration des organes, nodules, croissance maligne, taille anormale des organes). **Envisagez de documenter la méthode de conservation (y compris la fixation PFA, l’intégration OCT ou le gel instantané). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

Ce protocole fournit une stratégie reproductible pour la collecte systématique de multiples systèmes d’organes chez les souris jeunes et âgées, permettant des analyses anatomiques, histologiques et moléculaires. Plusieurs considérations techniques peuvent influencer la qualité des résultats et répondre aux limites de la méthode décrite. Premièrement, la variabilité de la qualité de la perfusion est un facteur important à prendre en compte. Une perfusion incomplète peut laisser des résidus sanguins compromettant l’histologie, l’immunohistochimie et les analyses moléculaires. La perfusion après une luxation cervicale peut entraîner un traumatisme des tissus cervicaux et entraîner une contamination sanguine des poumons. La luxation cervicale ne doit donc être réalisée que par du personnel formé. Pour des résultats optimaux, la perfusion doit être réalisée sous anesthésie terminale comme décrit ailleurs^20,21 conformément aux directives IACUC et^{AVMA 13}. Deuxièmement, la fixation est un déterminant crucial de l’intégrité tissulaire. Bien que le paraformoldéhyde à 4 % (PFA) soit largement utilisé, il peut pénétrer de manière insuffisante des organes gros ou denses, ce qui entraîne une mauvaise histologie et une mauvaise conservation des antigènes. Cette limitation peut être atténuée en utilisant du formol tamponné neutre à 10 % (NBF) ou en tranchant des tissus en sections de ≤5 mm pour améliorer la^{pénétration à 22}. Troisièmement, certains tissus, en particulier le pancréas, l’estomac et le cerveau, subissent une autolyse rapide, nécessitant une fixation ou une congélation dans les 5 à 10 minutes suivant l’euthanasie et l’utilisation d’outils de dissection^{pré-refroidis 23}. Chez les souris âgées, la néoplásie peut encore déformer l’anatomie et compliquer la dissection. Des artefacts supplémentaires peuvent survenir d’un volume de fixation insuffisant ou d’un gel, entraînant un retrait et des effets de bord ; ces facteurs peuvent être minimisés en maintenant un ratio fixateur/tissu d’au moins 10:1, en évitant la surpopulation, et en pré-refroidissant les moules OCT avant l’incorporation. Enfin, l’utilisation de PFA et de formolon soulève des risques de sécurité et d’élimination ; Les fixateurs à base de glyoxal offrent des alternatives moins toxiques. Une manipulation standardisée, une fixation optimisée et un timing précis sont donc essentiels pour maximiser la reproductibilité, la qualité des tissus et la fiabilité des analyses en aval²⁴.

En prélevant des tissus de plus de 15 organes d’un même animal, ce flux de travail maximise le rendement biologique par sujet et s’aligne avec les exigences éthiques visant à réduire l’utilisation animale. La procédure systématique peut être facilement adaptée à des études de débit moyen examinant le déclin physiologique lié à l’âge et les pathologies spécifiques aux^{organes 25}.

Un traitement rapide des tissus sujets à l’autolyse est essentiel pour préserver l’intégrité histologique. L’utilisation de solutions physiologiques sans calcium et magnésium, suivies d’un PFA à 4 %, préserve de manière fiable l’architecture des organes et minimise l’autolyse dans les tissus sensibles comme le pancréas et le système digestif. Contrairement aux protocoles axés sur un seul organe ou des modèles de maladies, cette approche permet une collecte rapide et cohérente de plusieurs organes, réduisant la variabilité et améliorant le débit. L’ensemble de la dissection, de la perfusion à l’excision finale des tissus, peut être réalisé en 60 minutes par animal, ce qui le rend adapté à des études à grande échelle ou sensibles au^{temps 3,11,26}. Le respect d’une séquence précise de perfusion-fixation minimise les artefacts et permet des résultats reproductibles.

La constance dans la collecte, la taille et l’inclusion des tissus est essentielle pour une évaluation histopathologique précise, en particulier dans les études longitudinales ou multicentriques. La variabilité dans la manipulation des tissus peut introduire des artefacts, des résultats pathologiques obscurs ou conduire à une mauvaise interprétation de la charge de la maladie. Les Guides révisés pour l’échantillonnage et la coupe d’organes chez les rats et les souris, tels que les guides de coupe RENI, fournissent des protocoles détaillés et standardisés pour minimiser ces^{incohérences 22}. L’adoption de ces méthodes harmonisées améliore la comparabilité des données entre études et institutions, renforce la reproductibilité et renforce l’intégrité des résultats basés sur la pathologie dans la recherche sur^{le vieillissement 4,9}.

La collecte d’une multitude d’organes est particulièrement importante dans la recherche sur le vieillissement, où comprendre comment les systèmes organiques interagissent est essentiel pour découvrir les processus qui entraînent le déclin physiologique de l’ensemble du corps avec l’âge. Bien que cette approche puisse également être bénéfique pour diverses autres questions de recherche, l’objectif de ce protocole est de soutenir les études sur le vieillissement où les changements liés à l’âge peuvent affecter simultanément plusieurs systèmes d’organes. Cependant, elle peut aussi être appliquée aux études portant sur la fibrose, la régénération et la sénescence, en particulier celles intégrant la transcriptomique ou la découverte de biomarqueurs^{multitissulaires 9,27,28}.

Les évaluations histologiques ont révélé des altérations caractéristiques associées à l’âge sur plusieurs tissus (Figure 4). Dans la peau, les animaux âgés présentaient un amincissement épithélial et une perte de follicules pileux. Dans le rein, des coupes de souris âgées ont montré l’élargissement de la capsule de Bowman ainsi que des changements fibrotiques, nécrotiques et lymphomateux. Le tissu pancréatique d’animaux âgés a montré une accumulation de corps apoptotiques et de lymphomes, tandis que les sections de rate ont révélé des dépôts amyloïdes et des régions lymphomatiques supplémentaires. Ces observations sont cohérentes avec les phénotypes établis du vieillissement murien et démontrent l’utilité de ce protocole pour détecter des marqueurs histopathologiques représentatifs du^{vieillissement} 1,18,19,27,29,30,31,32,33,34.

En résumé, ce protocole offre un cadre fiable et évolutif pour collecter et préserver les tissus dans les modèles de vieillissement précliniques. Elle peut être adoptée aussi bien dans des études exploratoires que basées sur des hypothèses pour découvrir des mécanismes spécifiques et systémiques liés au vieillissement, à la dégénérescence et à la résilience.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Coussinet absorbant
Âgés de C57BL/souris 6J   ;	Le laboratoire Jackson & nbsp ;	#000664
Plateaux de collecte & nbsp ;
Tondeuse sans fil	BravMini+  ;	CLP-41590	Pour l’épilation
Spray à l’éthanol 70 %	Fisher Scientific	50-163-3592
Pinces Supplémentaires 5 INOX	Dumont	F6521-1EA	Pinces à pointe extra fine pour ganglions lymphatiques
Pinces	MilliporeSigma	XX6200006P	Pinces à l’extrémité émoussée
Pinces 5 INOX	Dumont	F6521-1EA	Pinces à pointe fine
Solution salée équilibrée de Hank (HBSS) 1x 500 mL	Gibco	14025092
Ciseaux micro-disséquables (droits, tranchants/tranchants, 25mm)	Roboz Surgical	RS-5668	Microciseaux standards, acier inoxydable, lame de 25 mm (M-37)
Ciseaux micro-disséquables (lames droites, tranchantes/tranchantes, fines)	Roboz Surgical	RS-5918	Ciseaux finement disséquants, 4,5" de longueur (H-327)
NBF	Sigma  ;	HT501128	Pour la fixation
Solution saline normale	Cytiva	76081-514
Température de coupe optimale (OCT)	Fisher Scientific	23730571
Paraformodéhyde (PFA) 4 %	Sciences de la microscopie électronique	15710	Pour la fixation
Plaques de Petri 100 mL x 15 mL	MilliporeSigma	P5856-500EA
Solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS)	Gibco	10010023
Épingles	Eisco Labs	DISPINS1	Fixer la souris lors de la dissection
Seringue en plastique 20 mL, verrou Luer	FisherBrand	302830	Pour la perfusion
Boîte Seal’N Freeze (Contenant Cryo)	Ted Pella, Inc.	20956
Cryray-ray Seal’N Freeze	Ted Pella, Inc.	20956-1	Pour positionner les échantillons dans le contenant cryo
Aiguille papillon Sol-Vet avec adaptateur	Sol-Millenium Medical	110301070003	pour la perfusion
Couvercle en polystyrène
Cyromold Tissulaire-Tek (Biopsie)	Sakura	25608-922
Jeunes souris C57BL/6J	Le laboratoire Jackson & nbsp ;	#000664