Article de méthode

Une méthode innovante d’isolement d’endosomes à partir de tissus cardiaques de souris et de co-culture avec des cardiomyocytes

DOI :

10.3791/69146

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10 octobre 2025

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1Pharmacological and Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Houston

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les endosomes sont un ensemble d’organites de tri intracellulaire faisant partie de la voie de transport de la membrane endocytaire. Nous avons mis au point une nouvelle méthode pour isoler les endosomes du tissu cardiaque à l’aide d’un équipement de nanofiltration automatique et étudié l’absorption cellulaire des endosomes en les co-cultivant avec des cardiomyocytes primaires.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les endosomes sont des organites liés à une membrane qui jouent un rôle essentiel dans le trafic intracellulaire, la transduction du signal et le recyclage membranaire. Bien que leurs fonctions en biologie cardiovasculaire soient de plus en plus reconnues, l’isolement efficace des endosomes du tissu cardiaque reste un défi technique important. Nous avons développé un protocole rapide et à haut rendement pour isoler les endosomes du tissu cardiaque de souris en combinant le fractionnement subcellulaire avec une plateforme d’isolement par nanofiltration ultrarapide. Cette méthode comprend la centrifugation séquentielle, la nanofiltration et la récupération des vésicules à base de membranes nanoporeuses. Les endosomes isolés ont été caractérisés par western blot, diffusion dynamique de la lumière (DLS) et analyse par cytométrie en nano-flux (NanoFCM). Pour évaluer la bioactivité, des endosomes purifiés ont été co-cultivés avec des cardiomyocytes néonatals primaires. Les marqueurs endosomaux EEA1 et Rab7 ont été fortement enrichis en vésicules isolées. L’analyse DLS a révélé un diamètre moyen de la vésicule de 187,30 ± 23,42 nm et un potentiel zêta de -26,60 ± 5,79 mV (n = 12). La quantification par nanoFCM a donné environ 1,07 ± 0,31 × 1012 particules/mL (n = 12) à partir de 100 mg de tissu cardiaque. L’absorption fonctionnelle des endosomes par les cardiomyocytes a été observée après une co-culture in vitro , indiquant la préservation de l’intégrité et de l’activité des vésicules. Cette plate-forme d’isolement intégrée fournit une méthode reproductible et efficace pour l’extraction d’endosomes de haute pureté à partir de tissus cardiaques. Le protocole facilite les études biochimiques et fonctionnelles en aval, offrant un outil précieux pour étudier les rôles des endosomes dans la physiologie et les maladies cardiovasculaires.

Introduction

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Les endosomes sont des organites intracellulaires essentiels qui régulent l’endocytose, le tri des cargaisons et les voies de signalisation 1,2. Les récepteurs de signalisation activés et d’autres protéines régulées à la baisse sont d’abord triés dans des vésicules intraluménales (ILV) à l’intérieur d’endosomes précoces (EE), qui se transforment ensuite en corps multivésiculaires (MVB) ou en vésicules de transport endosomal (ECV). Ces vésicules fusionnent ensuite avec les endosomes tardifs (EL), qui servent de centres de tri secondaires pour diriger la cargaison vers la dégradation lysosomale ou des voies alternatives. Les ILV peuvent également être sécrétées sous forme d’exosomes après la fusion de l’endosome avec la membrane plasmique 3,4 . En parallèle, la voie de l’autophagie délivre du matériel cytosolique aux EL via les autophagosomes, qui acquièrent une capacité de dégradation lors de la fusion avec des compartiments endocytaires tardifs5. Les endosomes sont maintenant reconnus comme des régulateurs essentiels du recyclage des récepteurs6, de la localisation des canaux ioniques7, de la biogenèse des exosomes8 et de la communication intercellulaire9 processus qui sont particulièrement pertinents dans les cellules spécialisées telles que les neurones et les cardiomyocytes.

De nouvelles données probantes ont mis en évidence le rôle central des voies endosomiques dans la fonction cardiovasculaire. La protéine EHD3 (Eps15 Homology Domain Protein) régule le recyclage endosomal des principaux transporteurs d’ions cardiaques, y compris l’échangeur Na+/Ca2+ et les canaux Ca2+ de type L. Le déficit en EHD3 chez la souris entraîne une bradycardie, des anomalies de conduction et une altération de la manipulation du Ca2+ 10. Le trafic fonctionnel endosome-lysosome dans les cellules musculaires lisses vasculaires empêche la calcification médiale induite par le phosphate, ce qui est pertinent pour les maladies rénales chroniques et l’athérosclérose11. Néanmoins, les rôles fonctionnels des endosomes dans les maladies cardiovasculaires et leur potentiel en tant que cibles thérapeutiques restent incomplètement compris, ce qui justifie des recherches plus approfondies.

De multiples méthodes ont permis d’isoler biochimiquement des endosomes fonctionnellement intacts. Marsh et ses collègues ont d’abord combiné la centrifugation à gradient de densité avec l’électrophorèse à écoulement libre pour récupérer les endosomes précoces et tardifs, préservant ainsi leur acidification et leur intégrité structurelle12. Des méthodologies récentes, telles que l’approche du gradient de saccharose, offrent une voie standardisée pour séparer les populations endosomiques précoces et tardives, essentielle pour les études protéomiques et lipidomiques en aval13. Des kits commerciaux basés sur des colonnes de centrifugation ont été développés pour les applications à haut débit.

L’isolement des exosomes via le système d’isolation ultrarapide automatique utilise une technologie innovante de nanofiltration par ultrasons, qui dispose d’un système de nanofiltration à double membrane intégré avec une oscillation périodique à pression négative et des oscillations harmoniques à double couplage pour permettre l’isolement d’exosomes de haute pureté à partir de biofluides14. Ici, nous avons combiné le fractionnement subcellulaire avec l’isolement de l’endosome à l’aide du système d’isolement automatique ultra-rapide pour obtenir une nouvelle méthode d’isolement rapide de l’endosome avec un rendement élevé et une grande pureté à partir de tissu cardiaque de souris.

De plus, nous avons co-cultivé les endosomes extraits avec des cardiomyocytes (CM) primaires in vitro et avons constaté que les endosomes exogènes ont pénétré avec succès dans le CM. À l’aide d’un rapporteur d’endosome, dans lequel la protéine localisée dans l’endosome Numb a été fusionnée avec la protéine fluorescente rouge mCherry15,16, nous avons observé la fluorescence de mCherry localisée à l’intérieur des CM avec un motif ponctuel.

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Protocole

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Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux directives des National Institutes of Health sur l’utilisation des animaux de laboratoire et avec l’approbation du comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Houston.

REMARQUE : Avant de lancer la procédure d’isolement, il est essentiel de s’assurer que tous les tampons requis ont été fraîchement préparés et refroidis à 4 °C. Les instruments stérilisés, les plaques de culture tissulaire et les tubes appropriés doivent être disposés aux postes de travail désignés, et tous les matériaux doivent être maintenus sur de la glace ou à 4 °C, sauf indication contraire. Les centrifugeuses et les rotors doivent être pré-équilibrés à 4 °C pendant au moins 2 à 3 h avant d’être utilisés. Le tampon de fractionnement doit être préparé avant le jour de l’expérience et stocké à 4 °C, puis conservé sur glace pendant l’expérience jusqu’à ce que nécessaire. Sauf indication contraire, toutes les étapes d’incubation et de centrifugation doivent être effectuées à 4 °C.

1. Préparation du lysat de cœur

  1. Désinfecter la zone chirurgicale à l’aide d’éthanol à 70 %, puis placer un tampon absorbant stérile sur la surface de travail, sur lequel sont disposés des instruments chirurgicaux stérilisés.
  2. Euthanasier des souris (C57BL/6 mâles, 8 à 12 semaines, 20 à 25 g, et mCherry : NumbKI mâles, 8 à 12 semaines, 20 à 25 g) par inhalation de CO2 (10 à 30 % de CO2 pendant 3 à 5 min) ou par une autre méthode approuvée par le comité de protection et d’utilisation des animaux de l’établissement concerné.
    ATTENTION : Veuillez utiliser dans un espace ouvert et assurez-vous que la bouteille de CO2 se ferme à temps pour éviter les fuites. Les souris doivent être surveillées pendant l’euthanasie pour confirmer la perte de conscience et la procédure appropriée. Une fois inconscient, utilisez une méthode secondaire, telle que la luxation cervicale, la thoracotomie ou l’exsanguination, pour assurer la mort.
  3. Positionnez la souris en position couchée et nettoyez la zone thoracique avec de l’éthanol à 70 %.
    1. Ouvrez rapidement la cavité thoracique pour prélever le cœur, puis transférez-le dans la solution saline équilibrée de Hank (HBSS) glacée dans une boîte de 60 mm placée sur de la glace.
    2. Retirez doucement le sang résiduel des cavités cardiaques à l’aide d’une pince à épiler et lavez très bien le cœur jusqu’à ce qu’il ne reste plus de sang dans les cavités. Gardez le cœur sur la glace tout au long du traitement.
      REMARQUE : Conserver 50 à 100 mg de tissu cardiaque pour l’analyse par western blot (WB) en tant que témoin positif. Le cœur peut être congelé dans de l’azote liquide et stocké à -80 °C jusqu’à 6 mois.
  4. Ajouter 8 mL de tampon de fractionnement (tableau 1) dans un tube de 50 mL sur de la glace. Transférez 100 à 120 mg de tissu cardiaque de souris frais ou congelé dans un tube contenant le tampon de fractionnement.
    REMARQUE : N’importe quelle partie du tissu cardiaque de la souris peut être utilisée pour extraire des endosomes. Un minimum de 100 mg de tissu cardiaque est nécessaire pour produire suffisamment d’endosomes pour les analyses ultérieures. Pour assurer l’uniformité entre les groupes expérimentaux, le tissu doit être pesé avec précision avant d’être ajouté au tampon de fractionnement.
    ATTENTION : Portez un EPI approprié lors de l’utilisation du tampon de fractionnement afin d’éviter tout contact direct avec le corps.
  5. Hachez le tissu en3 morceaux d’environ 1 mm à l’aide de ciseaux de microchirurgie dans un tampon de fractionnement sur de la glace tout le temps.
  6. Homogénéiser avec un homogénéisateur électrique à vitesse moyenne, dans un cycle d’arrêt de travail de 40 s 30 s. Homogénéiser pendant 5 à 7 cycles (Figure 1A).
    REMARQUE : Un processus d’homogénéisation approfondi est essentiel et aidera à augmenter la concentration finale des endosomes.
  7. Sonicez le lysat cardiaque homogénéisé pendant 10 min dans le bain d’eau glacée avec un bain à ultrasons (Figure 1A).

2. Fractionnement subcellulaire

  1. Placez une crépine de 40 μm sur un tube de centrifugation de 50 mL et filtrez le lysat de cœur homogénéisé à travers la crépine (figure 1A).
  2. Pour la pastille nucléaire : centrifuger le lysat cardiaque à 1 000 × g pendant 5 min à 4 °C. Transférez le surnageant et placez-le dans un tube fraîchement étiqueté.
    REMARQUE : Recueillir la pastille, qui est la fraction nucléaire, et remettre la pastille nucléaire en suspension dans un tampon de lyse de 200 μL de WB si la fraction nucléaire est nécessaire pour la WB. Pipetez doucement la pastille nucléaire avec un tampon de dosage par radio-immunoprécipitation (RIPA) de haut en bas 20 fois et sonicate pendant 10 min. Centrifuger le lysat nucléaire à 14 000 × g pendant 10 min. Récupérez le surnageant et conservez-le à -80 °C pour une utilisation ultérieure. L’étape 2.2 est facultative ; Il peut être sauté si seules des vésicules sont nécessaires.
  3. Pour la fraction mitochondriale : centrifuger à nouveau le surnageant à 10 000 × g pendant 10 min à 4 °C. La pastille contient la fraction mitochondriale. Transférez le surnageant et placez-le dans un tube ultracentrifugé frais.
    REMARQUE : Si une fraction mitochondriale est souhaitée pour la WB, enregistrez la pastille à l’étape 2.2 comme décrit dans la REMARQUE précédente.
  4. Équilibrez soigneusement les tubes. Pesez chaque tube et ajoutez un tampon de fractionnement à froid supplémentaire au tube plus léger pour assurer un poids égal. Prérefroidissez le rotor de l’ultracentrifugeuse et les adaptateurs pendant 2-3 h à 4 °C. Ultracentrifuger le surnageant à 160 000 × g pendant 30 min à 4 °C.
    REMARQUE : Pendant l’étape d’ultracentrifugation, il est essentiel de s’assurer que tous les tubes d’ultracentrifugation sont correctement équilibrés et remplis de tampon à environ 0,5-1 cm sous le rebord. Un remplissage inadéquat peut entraîner une déformation ou un effondrement du tube en raison des forces centrifuges élevées appliquées.
  5. Retirer le surnageant dans un tube frais. Le surnageant contient des endosomes. Installez une seringue de 10 mL fixée à un filtre de seringue de 0,45 μm sur un tube de centrifugation de 50 mL et filtrez le surnageant dans le tube. Ajouter 5 mL de tampon PBS stérilisé pour diluer la solution et éviter d’obstruer le filtre.
    REMARQUE : L’étape de filtrage garantit que tous les endosomes du surnageant sont à <450 nm au début des étapes d’isolation.
  6. Remettez la pastille en suspension avec 5 mL de tampon PBS stérilisé de l’étape 2.4 et pipetez de haut en bas au moins 20 fois pour bien mélanger la pastille. La pastille contient d’autres vésicules intracellulaires. Installez une seringue de 10 ml fixée à un filtre de seringue de 0,45 μm sur un tube de centrifugation de 50 ml et filtrez la solution de granulés dans le tube. Ajoutez 5 ml supplémentaires de tampon PBS stérilisé pour diluer la solution et éviter de boucher le filtre.
    REMARQUE : L’étape de filtrage garantit que toutes les vésicules de la pastille sont <450 nm au démarrage des étapes d’isolation.

3. Processus d’isolement des endosomes et autres vésicules intracellulaires

  1. Diluer le surnageant filtré à l’étape 2.5 et la solution de granulés filtrée à l’étape 2.6 avec un tampon PBS stérilisé jusqu’à un volume final de 30 mL dans des tubes de 50 mL, respectivement. Conservez les échantillons à 4 °C (Figure 1A).
    REMARQUE : Les échantillons peuvent être conservés à 4 °C pendant 24 h. S’il n’y a pas assez de temps pour effectuer les étapes suivantes le même jour, elles peuvent être conservées dans un réfrigérateur à 4 °C, puis attendre le lendemain pour poursuivre l’expérience.
  2. Allumez l’instrument et lancez le programme de nettoyage quotidien, qui prend généralement 20 min.
  3. Choisissez le dispositif d’isolement EXODUS moyen (M EID) pour l’isolation. Installez un adaptateur de tube de 50 ml et placez le tube de 50 ml avec l’échantillon en position d’échantillon. Appuyez sur EID à l’écran et chargez M EID.
    REMARQUE : L’EID moyen est destiné à un échantillon de 20 à 50 ml, recommandé 30 mL.
  4. Mettre en place le programme :
    1. Entrez le nom de l’échantillon et le volume de l’échantillon.
    2. Sélectionnez le type d’échantillon : Plasma.
    3. Sélectionnez le programme : Plasma. Strong-MA. A03.
    4. Sélectionnez un tube à centrifuger : 50 ml.
    5. Activez le mode Haute pureté.
    6. Sélectionnez l’option de programme 3000.
    7. Appuyez sur OK pour commencer.
      REMARQUE : L’ensemble du processus d’isolation prend 1 à 2 h. Une concentration plus élevée d’échantillons prendra plus de temps.
  5. Récupérer les endosomes et autres vésicules intracellulaires :
    1. Récupérez l’EID et apportez-le au capot pour les prochaines étapes.
    2. Transférez 200 μL de tampon PBS stérilisé dans l’EID avec une pipette de 200 μL. Rincez les deux côtés de la membrane nanoporeuse 20 fois, respectivement.
    3. Prélever les endosomes ou d’autres vésicules intracellulaires, les remettre en suspension dans 200 μL dans un tube de 1,5 mL. Conservez-le à 4 °C s’il est utilisé en 24 à 48 h, ou à -80 °C pour un stockage à long terme.
      REMARQUE : L’éluat contient les endosomes ou d’autres vésicules intracellulaires et est utilisé pour une analyse plus approfondie et une co-culture avec des cardiomyocytes. L’échantillon d’endosomes est stable lorsqu’il est stocké à -80 °C pendant 5 mois, sur la base des données obtenues.
  6. Endosomes d’élution et autres vésicules intracellulaires pour la WB :
    1. Récupérez l’EID. Transférez 80 μL de tampon de lyse WB dans l’EID. Rincez les deux côtés de la membrane nanoporeuse 20 fois, respectivement.
    2. Incuber l’EID sur de la glace pendant 30 min pour assurer une solubilisation complète, pipeter le tampon à l’intérieur de l’EID toutes les 10 min. Prélever les endosomes ou d’autres vésicules intracellulaires lysat dans des tubes de 1,5 mL. Centrifugeuse pendant 10 min à 14 000 × g à 4°C. Recueillir et stocker le surnageant à -80 °C pour un stockage à long terme. Jetez la pastille s’il reste une pastille dans le tube.

4. Quantification des protéines endosomiques et caractérisation des vésicules

  1. Analyse par transfert Western
    1. Enregistrez 5 μL de chaque échantillon pour quantifier la concentration en protéines à l’aide d’un dosage de l’acide bicinchoninique (BCA).
    2. Diluez les échantillons dans 4× tampon d’échantillon Laemmli et mélangez soigneusement par vortex. Chauffer les échantillons à 95 °C pendant 10 min pour dénaturer les protéines.
    3. Centrifuger les échantillons dénaturés à 14 000 × g pendant 10 min à 4 °C et recueillir le surnageant résultant pour analyse.
    4. Assemblez les gels de polyacrylamide dans l’appareil d’électrophorèse et remplissez la chambre avec un tampon de dodécylsulfate de sodium (SDS).
    5. Chargez un marqueur de poids moléculaire et les échantillons de protéines préparés sur le gel, en sélectionnant un pourcentage d’acrylamide approprié en fonction du poids moléculaire des protéines cibles.
      REMARQUE : En règle générale, 20 μg de protéines sont chargés par puits pour les lysats de tissu cardiaque et les lysats d’endosome.
    6. Faites fonctionner le gel à 6 V pendant environ 120 minutes ou jusqu’à ce que la face du colorant atteigne le bas du gel.
    7. Transférez les protéines du gel vers une membrane de fluorure de polyvinylidène (PVDF) à l’aide d’un système de transfert par western blot.
      REMARQUE : La méthode de transfert humide fonctionne également bien.
    8. Rincer brièvement la membrane PVDF avec une solution saline tamponnée au Tris contenant 0,05 % de Tween-20 (TBST).
    9. Bloquer la membrane avec du TBST complété par 1 % d’albumine sérique bovine (BSA) pendant 1 h à température ambiante.
    10. Incuber la membrane pendant une nuit à 4 °C avec l’anticorps primaire (Table des matériaux) spécifique au marqueur endosomal sélectionné, en utilisant un léger balancement.
    11. Le lendemain, lavez la membrane trois fois avec du TBST, chaque lavage durant 10 min à température ambiante sur une bascule.
      REMARQUE : Un bon lavage est essentiel pour réduire le bruit de fond non spécifique ; Assurez-vous que la membrane reste complètement hydratée tout au long du processus.
    12. Incuber la membrane avec l’anticorps secondaire approprié (Table des matériaux) pendant 1 h à température ambiante.
    13. Lavez la membrane trois fois avec du TBST, chaque lavage durant 10 min sur une bascule à température ambiante.
    14. Appliquez un substrat chimiluminescent sur la membrane pour la détection des protéines liées aux anticorps.
    15. Utilisation d’un système d’imagerie sur gel pour exposer la membrane et prendre des images des protéines.
  2. Analyse de la diffusion dynamique de la lumière (DLS)
    1. La taille des particules et le potentiel zêta des endosomes sont mesurés à l’aide de la technique de diffusion dynamique de la lumière (DLS)17. à l’aide d’un Litesizer 500 (Anton Paar) équipé du logiciel Kalliope version 2.10.4. Les mesures DLS sont effectuées en triple exemplaire à l’aide d’un laser de 658 nm avec un angle de détection de 90° à 25 °C.
    2. Faites une dilution de « nanosphères de taille standard » dans de l’eau ultrapure, ajoutez 1 ml de volume dans la cuvette jetable et placez-la dans la chambre.
      REMARQUE : Utilisez des nanosphères standard (petites ou grandes) en fonction de la taille attendue de l’échantillon inconnu.
    3. Ouvrez le logiciel DLS et cliquez sur l’onglet nouvelle mesure . Sélectionnez la taille des particules dans le mode de mesure. Nommez le fichier dans le champ Sans titre et mettez les paramètres d’entrée (solvant, température, etc.), puis cliquez sur démarrer. Après avoir déterminé la taille des particules standard, sortez la cuvette de la chambre.
    4. Faites une dilution du « matériau de référence du potentiel zêta » dans de l’eau ultra-pure, placez-le dans la cuvette oméga du potentiel zêta et placez-le dans la chambre de la cuvette. Cliquez sur l’onglet nouvelle mesure dans le logiciel. Sélectionnez le potentiel zêta dans le mode de mesure. Nommez le fichier dans le champ Sans titre et mettez les paramètres d’entrée (solvant, température, etc.), puis cliquez sur démarrer.
    5. Pour déterminer la taille des particules et le potentiel zêta des endosomes, diluez l’échantillon d’endosome dans de l’eau ultrapure, placez-le dans les cuvettes respectives et placez-les dans la chambre de la cuvette. Prenez les mesures de la même manière que celle décrite pour les normes.
      REMARQUE : Effectuez une dilution des échantillons inconnus en fonction de la concentration des échantillons dans de l’eau ultrapure.
  3. Analyse NanoFCM
    REMARQUE : Les concentrations de particules d’endosome sont déterminées à l’aide du nanoanalyseur de flux NanoFCM avec le logiciel Professional Suite V2.318. L’acquisition du signal de particules est effectuée pendant 2 min à l’aide d’un laser bleu de 488 nm réglé sur 20 mW avec une décroissance de 0,2 % de SS et/ou d’un laser rouge de 638 nm réglé sur 8 mW avec une décroissance de 10 % de SS, à une pression d’échantillonnage de 1,0 kPa modulée et maintenue par un module de pression à air. L’échantillon est focalisé à 1,4 μm en utilisant de l’eau ultrapure comme fluide de gaine via une alimentation par gravité. L’alignement optimal du laser est testé et calibré à l’aide de billes de QC cocktail de nanosphères de silice (S16M-Exo). Les mesures d’étalonnage de la taille sont effectuées avant l’analyse à l’aide de billes étalons de taille S16M-Exo (cocktail de nanoparticules de silice contenant 68, 91, 113 et 155 nm de diamètres de particules dont la concentration est connue de 2,17 × 1010/mL).
    1. Acquisition de la norme de concentration :
      1. Démarrer et initialiser la fluidique des nanoFCM. Diluez les billes de contrôle qualité (1:100) dans de l’eau ultrapure filtrée par membrane de 0,22 μm, ajoutez-les dans un tube de 0,5 mL et placez-les dans le quai de chargement. Sélectionnez QC FL SiNPs dans le menu déroulant Sample Inf et entrez le facteur de dilution de l’échantillon de billes de QC.
      2. Dans le menu déroulant Débit d’échantillons , sélectionnez boosting pour introduire l’échantillon de CQ à grande vitesse et retirer la solution de nettoyage du système pendant 45 s. Pendant le boost, réglez la puissance laser sur 20/50 mV pour le laser bleu de 488 nm et 20/100 mW pour le laser rouge de 638 nm, avec une décroissance SS de 0,2 %.
      3. Sélectionnez Échantillonnage dans le menu déroulant Flux d’échantillonnage et ajustez le seuil pour le signal volumineux. Pendant l’échantillonnage, ajustez manuellement l’alignement de l’objectif de condensation du signal et l’alignement de l’objectif de mise au point laser à partir du logiciel, si nécessaire. Le réglage automatique du seuil pour un signal de grande taille doit rester compris entre 50 et 120 pour le canal de diffusion latérale et inférieur à 75 pour les deux canaux de fluorescence.
      4. Cliquez sur Temps d’enregistrement pour acquérir les données pendant 120 s. Assurez-vous que la région d’intérêt (ROI) se situe entre 1500 et 15000 lors de l’acquisition des données. Enregistrez le fichier de résultat dans le dossier contextuel avec l’extension « nfa » et déchargez le tube d’échantillon.
        REMARQUE : Après chaque analyse d’échantillon, utilisez une solution de nettoyage (1x) pour retirer l’échantillon traité de la tubulure en l’augmentant pendant 45 s. Ensuite, trempez l’extrémité capillaire dans de l’eau pure pour éliminer la solution de nettoyage résiduelle de l’extérieur du capillaire avant de charger l’échantillon suivant.
    2. Acquisition de la norme de taille :
      1. Diluez les « billes de taille standard » (1:100) dans de l’eau ultrpaure filtrée par membrane de 0,22 μm et placez-les dans le quai de chargement. Sélectionnez 68-155 S16M-Exo dans le menu déroulant Échantillon Inf et entrez le facteur de dilution de l’échantillon de billes standard de taille.
      2. Dans le menu déroulant Sample Flow , sélectionnez boosting pour introduire les billes de taille standard et retirer la solution de nettoyage du système pendant une durée de 45 s. Pendant l’amplification, réglez la puissance laser sur 8/50 mV pour le laser bleu de 488 nm et 20/100 mW pour le laser rouge de 638 nm, avec une décroissance de 10 % de SS.
      3. Sélectionnez Échantillonnage dans le menu déroulant Flux d’échantillons et ajustez le seuil pour un petit signal. Quatre pics distincts (68 nm, 91 nm, 113 nm, 155 nm) doivent être visibles dans la fenêtre. Cliquez sur Temps d’enregistrement pour acquérir les données pendant 120 s. Enregistrez le fichier de résultat dans le dossier contextuel avec l’extension « nfa » et déchargez le tube d’échantillonnage.
    3. Acquisition standard vierge :
      1. Utilisez de l’eau ultrapure ou (tampon/diluant de l’échantillon) pour effectuer la mesure dans le même processus que décrit ci-dessus, enregistrez le fichier avec le nom « blank » dans le dossier avec l’extension « nfa », et déchargez le tube d’échantillon.
    4. Détermination de la concentration en particules des endosomes
      1. Diluez l’échantillon d’endosome dans de l’eau ultrapure et placez-le dans le quai de chargement.
      2. Après avoir boosté et échantillonné l’échantillon, cliquez sur Temps d’enregistrement pour démarrer les mesures. Si le seuil n’est pas compris entre 50 et 120 pour le canal de diffusion latérale, ou si le retour sur investissement est supérieur à 15 000, envisagez de diluer l’échantillon.
    5. Analyse des données :
      1. Passez de l’onglet Acquisition à l’onglet Analyse dans le logiciel et ouvrez les fichiers « nfa » enregistrés. Définissez la norme de concentration en ouvrant le fichier enregistré des résultats de contrôle qualité date__QC FL SnNPs.nfa, définissez le seuil sur un signal de grande taille en cliquant sur l’outil de définition du seuil.
      2. Sélectionnez la concentration de particules à l’aide de l’outil de contrôle circulaire. Cliquez sur Compter les MST et vérifiez la concentration de billes de CQ (2,17 × 1010/mL) avant de fermer la fenêtre.
      3. Pour définir la norme de taille, ouvrez le fichier date_68-155 S16M-Exo.nfa. Cliquez sur l’outil Taille pour ouvrir la fenêtre de génération de courbe standard et définissez le seuil pour le petit signal en cliquant sur l’outil Définir le seuil.
      4. Sélectionnez S16 exo 68-155 nm dans le menu déroulant Défini par l’utilisateur . Cliquez sur Trouver des pics pour identifier les intensités SS maximales des populations de quatre tailles.
      5. Sélectionnez le fichier vierge et cliquez sur Définir vide pour identifier le nombre de faux positifs pour le retrait de l’échantillon. Pour analyser la concentration de l’endosome, sélectionnez d’abord l’échantillon et réglez le seuil sur un petit signal en cliquant sur l’outil de réglage du seuil. Présentez les données quantifiées sous forme de rapport sur la taille (nm) et la concentration (particules/mL).

5. Culture primaire de cardiomyocytes

REMARQUE : Isolez les cardiomyocytes à l’aide d’un kit d’isolement des cardiomyocytes primaires, qui fournit suffisamment de réactifs pour l’isolement des cardiomyocytes à partir d’un maximum de 50 cœurs de souris ou de rats nouveau-nés. Le kit comprend également des composants adaptés au soutien de la culture primaire de cardiomyocytes. Tous les supports et tampons doivent être retirés avec précaution pour éviter de déranger les cellules. Le pipetage manuel à l’aide d’une pointe de pipette de 1000 μL est recommandé, l’aspiration sous vide doit être évitée. La solution saline équilibrée de Hank (HBSS) doit être pré-refroidie à 4 °C avant de commencer la procédure.

  1. Reconstituer l’enzyme d’isolement des cardiomyocytes 1 (contenant de la papaïne), disponible dans le kit, en ajoutant 2. mL de HBSS réfrigéré dans un flacon. Mélangez doucement pendant environ 5 minutes ou jusqu’à ce que l’enzyme soit complètement dissoute. Gardez la solution enzymatique sur de la glace tout au long de la procédure.
    REMARQUE : Un seul flacon de l’enzyme 1 reconstituée est suffisant pour l’isolement des cardiomyocytes de 10 cœurs néonatals. Il peut être conservé à -20 °C jusqu’à 6 mois et est stable pendant deux cycles de congélation-décongélation. Si elle est conservée à 4 °C, la solution doit être utilisée dans un délai de 1 semaine pour assurer l’activité enzymatique.
  2. Placez les cœurs néonatals fraîchement disséqués dans des stériles individuels 1. mL de tubes de microcentrifugation et ajoutez immédiatement 500 μL de HBSS glacé dans chaque tube.
    REMARQUE : Il est recommandé de traiter un cœur par tube pour maximiser le rendement et la reproductibilité.
  3. Hachez le tissu cardiaque en fragments de 1 mm³ à l’aide de ciseaux de dissection stériles. Lavez chaque échantillon deux fois avec 500 μL de HBSS glacé pour éliminer le sang résiduel.
  4. Dans chaque tube, ajoutez 200 μL d’enzyme d’isolement des cardiomyocytes 1 reconstituée (papaïne) et 10 μL d’enzyme d’isolement des cardiomyocytes 2 (contenant de la thermolysine), disponibles dans le kit. Mélangez délicatement et incubez les tubes à 37 °C pendant 30-35 min.
    REMARQUE : L’enzyme d’isolement des cardiomyocytes 2 est fournie sous forme de suspension dans le HBSS et doit être décongelée sur de la glace avant d’être utilisée. Homogénéiser l’enzyme en le pipetant de haut en bas pour assurer une suspension uniforme avant de l’ajouter aux échantillons.
  5. Après la digestion enzymatique, aspirez soigneusement la solution enzymatique et lavez chaque échantillon deux fois avec 500 μL de HBSS glacé.
  6. Ajoutez un ml de DMEM complet pour l’isolement des cellules primaires dans chaque tube. Triturez doucement le tissu en pipetant de haut en bas 25 à 30 fois à l’aide d’une pointe de pipette stérile de 1,0 ml. Minimisez la formation de bulles d’air lors de cette étape.
    REMARQUE : La perturbation des tissus par pipetage améliore le rendement cellulaire. Cependant, un pipetage excessif peut entraîner des dommages cellulaires.
  7. Centrifuger le surnageant à 300 × g pendant 5 min.
  8. Retirez soigneusement le DMEM complet à l’aide d’une pipette. Ajoutez 1 ml de Complete DMEM frais dans le tube et pipetez de haut en bas 25 à 30 fois à l’aide d’une pointe de pipette stérile de 1,0 ml. Évitez les bulles d’air lors du pipetage.
  9. Une fois que le tissu est principalement une suspension unicellulaire, ajoutez 0,5 ml de DMEM complet pour l’isolement des cellules primaires dans chaque tube pour porter le volume total à 1,5 ml. Combiner des suspensions cellulaires individuelles pour déterminer la concentration et la viabilité cellulaires.

6. Co-culture d’endosomes avec des cardiomyocytes

  1. Ensemencez les cardiomyocytes dans une boîte de 60 mm et ajoutez Complete DMEM au volume total.
    REMARQUE : On s’attend à ce que chaque cœur de souris nouveau-née soit ensemencé dans une boîte, et que le volume total de chaque puits soit de 5 mL (figure 1B).
  2. Incuber la parabole de 60 mm à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 pendant 24 h. Après 24 h, remplacez le milieu par un volume équivalent de DMEM complet frais pour l’isolement des cellules primaires contenant un supplément de croissance de cardiomyocytes dilué 1000x.
  3. Transférez l’éluat d’endosome produit à l’étape 3 de -80 °C à -20 °C pendant 1 h. Ensuite, mettez les endosomes sur de la glace et décongelez-les progressivement.
    REMARQUE : La décongélation progressive sur la glace peut rendre la membrane des endosomes plus intacte et réduire la dégradation.
  4. Après 48 h, mélanger tous les 100 μL d’éluat d’endosome avec 5 ml de DMEM Complete frais et remplacer l’ancien milieu dans chaque plat. Co-culture d’endosomes avec des cardiomyocytes pendant 24 h.
  5. Lavez les cardiomyocytes avec 2 ml de PBS stérile à froid. Ajoutez un tampon de lyse glacé dans chaque plat avec un tampon de lyse de 80 à 100 μL. Grattez les cellules à l’aide d’un grattoir en plastique froid et recueillez les cellules dans des tubes de 1,5 ml.
  6. Exécutez le protocole WB décrit à l’étape 4.1.
  7. Pour l’immunocoloration (IF), suivez les étapes décrites ci-dessous.
    1. Ensemencez des cardiomyocytes dans une lame de chambre à 8 puits. Diluer la suspension unicellulaire avec le DMEM complet de 1,5 mL à 3 mL.
    2. Semez 300 μL de suspension dans chaque chambre. Répétez les étapes 6.2 à 6.4.
    3. Fixez les cardiomyocytes avec 200 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % pendant 20 min à température ambiante et lavez-les trois fois avec 200 μL de PBS stérile. La lame de chambre à 8 puits est prête pour l’IF.
      ATTENTION : Lors de la manipulation de 4 % de PFA, veuillez porter un EPI approprié. Veuillez jeter 4 % de PFA dans un récipient approprié après utilisation.

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Résultats

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Nous avons examiné les niveaux d’expression des marqueurs des endosomes précoces, des endosomes tardifs, des lysosomes et des autophagosomes dans cinq groupes : lysat de tissu cardiaque, fraction nucléaire, fraction mitochondriale, autres vésicules intracellulaires des étapes 2.6 et 3.6, et endosomes des étapes 2.5 et 3.6. Le résultat du Western blot a montré que l’EEA1 (Early Endosome Antigen 1) avait le niveau d’expression le plus élevé dans les endosomes et était presque inexprimé dans les autres groupes (

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Discussion

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Dans cette étude, nous présentons une méthode rapide et reproductible pour isoler des endosomes de haute pureté à partir de tissus cardiaques de souris en combinant le fractionnement subcellulaire avec une plateforme d’isolement ultrarapide14. Les approches traditionnelles d’isolement des endosomes, telles que la centrifugation à gradient de densité12 ou l’isolement immunitaire, nécessitent souvent beaucoup de temps et de main-d’œuvre et né...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par les subventions suivantes : National Heart, Lung, and Blood Institute grant 2R01HL121700-06A1 et R01HL172834-01 à M.W., American Heart Association 24TPA1303770 et 25EIA1422015 grant to M.W. US EPA84045701 to X.L.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
µ ;-Slide 8 Bien hautIbidi80806-90
Tube de microcentrifugation gradué de 1,5 mLScientifique américain1615-5500
10x Tampon Tris/GlycineBio Rad1610734
4x tampon d’échantillonnage LaemmliBio Rad1610747
Centrifugeuse de paillasseEppendorfCentrifugeuse Eppendorf 5810R
Albumine sérique bovine  ;SigmaA9418
crépine cellulaireCorningCLS431750Taille des pores 40  ; &mu ; m, stérile
Boîtes de culture tissulaire CELLSTARVWR82050-546Polystyrène, stérile, 60 mm & aigu ; 15 millimètre
Système d’imagerie ChemiDocBio RadChemiDoc XRS+
Solution de nettoyageNanoFCM17159
DMEM pour les kits d’isolement de cellules primaires PierceFisher ScientificPI88287
La TNTFisher ScientificBP172
Dulbecco' s solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Thermo Scientific10010023
Réactif de détection par transfert Western ECLBio Rad1705061
EDTASigmaE4884
EEE1Signalisation cellulaire3288SWB (1:1000)
EGTASigmaE-4378-25
EIDEXODEMA03 EID
ERp72Signalisation cellulaire5033SWB (1:1000)
ÉthanolMagasin de recherche UH200 preuves, 5 gallons
EXODE H-600EXODEH-600
GAPDHProteintech10494-1-APWB (1:5000)
Hank' s solution saline équilibrée (HBSS)Thermo Scientific14175095
HEPESSigmaN° H3375
HomogénéisateurFisher Scientific15340167
KclSigmaRéf. P3911
Lampe1AbcamAB320851WB (1:2000)
LC3Signalisation cellulaireN ° 2775SWB (1:1000)
Litesizer 500  ;Anton PaarLitesizer 500D’autres équipements tels que Zetasizer (Malvern) ou DLS  ; (Wyatt) peut être utilisé
mCeriseBiorbytORB66657WB (1:500)
MgCl2Fisher ScientificBP214-500
NaClSigmaRéf. S7653
NanoFCMNanoFCMNanoanalyseur de flux
Normes de taille des nanosphèresThermo Scientific3020A
Microscope confocal AXR de NikonNikonL’AXR
Solution de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBSBiotechnologie de Santa CruzSC-281692
Sondes de marquage de phalloïdineInvitrogenN° A22284SI (1:500)
Kits de dosage des protéines Pierce BCAThermo Scientific23227
Kit d’isolement des cardiomyocytes primaires PierceThermo Scientific88028
Filtre seringue en polyéthersulfoneMilliporeSLHPR33RSTaille des pores 0,45  ; &mu ; m, stérile
Gels protéinés préfabriquésBio Rad4561093
Perles QCNanoFCMQS2503
Rab7Signalisation cellulaireRÉF 9367SWB (1:1000)
Tampon de lyse et d’extraction RIPAThermo Scientific89900
Roche PhosSTOP (PI Cocktail)Roche4906837001
Nanosphères de siliceNanoFCMS16M-EXO
SaccharoseSigma84097
Rotor à godet oscillantBeckman CoulterSW55Ti
Système de transfert turbo Trans-Blot Kits de transfert RTABio Rad1704270
Préadolescent 20Bio Rad1662404
UltracentrifugeBeckman CoulterOptima XE-90
Tubes d’ultracentrifugation  ;Beckman Coulter326819
Bain de nettoyage par ultrasonsÉchographies BransonCPX952238R
VWR Tube Cent 50 mLVWR89039-656
Centrifugeuse à tube VWR 15 mLVWR89039-666
Matériau de référence du potentiel zêtaAnton Paar175108

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cullen, P. J., Steinberg, F. To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (11), 679-696 (2018).
  2. Gould, G. W., Lippincott-Schwartz, J. New roles for endosomes: from vesicular carriers to multi-purpose platforms. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (4), 287-292 (2009).
  3. Bissig, C., Gruenberg, J. Lipid sorting and multivesicular endosome biogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (10), a016816(2013).
  4. Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. EMBO J. 30 (17), 3481-3500 (2011).
  5. Lamb, C. A., Yoshimori, T., Tooze, S. A. The autophagosome: origins unknown, biogenesis complex. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (12), 759-774 (2013).
  6. Singh, J., et al. Endosome transcriptomics reveal trafficking of Cajal bodies into multivesicular bodies. bioRxiv. , (2025).
  7. Scott, C. C., Gruenberg, J. Ion flux and the function of endosomes and lysosomes: pH is just the start: the flux of ions across endosomal membranes influences endosome function not only through regulation of the luminal pH. Bioessays. 33 (2), 103-110 (2011).
  8. Lopez-Verrilli, M. A. Exosomes: mediators of communication in eukaryotes. Biol Res. 46 (1), 5-11 (2013).
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  10. Curran, J., et al. EHD3-dependent endosome pathway regulates cardiac membrane excitability and physiology. Circ Res. 115 (1), 68-78 (2014).
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  12. Marsh, M., et al. Rapid analytical and preparative isolation of functional endosomes by free flow electrophoresis. J Cell Biol. 104 (4), 875-886 (1987).
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  14. Chen, Y., et al. Exosome detection via the ultrafast-isolation system: EXODUS. Nat Methods. 18 (2), 212-218 (2021).
  15. Miao, L., et al. Cardiomyocyte orientation modulated by the Numb family proteins-N-cadherin axis is essential for ventricular wall morphogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (31), 15560-15569 (2019).
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  21. Bucci, C., et al. Rab7: a key to lysosome biogenesis. Mol Biol Cell. 11 (2), 467-480 (2000).
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Mots-clés

Tissu cardiaque de sourisfractionnement subcellulaireplateforme de nanofiltrationcentrifugation s quentiellenano cytom trie en fluxdiffusion dynamique de la lumi reco culture de cardiomyocytesmarqueurs endosomauxcaract risation des v sicules

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