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Imagerie moléculaire spatiale du Glycome à l’aide de la spectrométrie de masse

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DOI :

10.3791/69154

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28 novembre 2025

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1Center for Advanced Spatial Biomolecule Research (CASBR), University of Florida, Gainesville, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Florida, Gainesville, 3Markey Cancer Center, University of Kentucky, 4Department of Pathology & Laboratory Medicine, University of Kentucky

Dans cet article

Résumé

Ce protocole détaille les étapes clés permettant une mesure rigoureuse et reproductible des glycanes liés au glycogène et aux glycans liés à l’Atomogène grâce à l’imagerie par spectrométrie de masse.

Résumé

L’organisation spatiale du glycome au sein des tissus est essentielle à la base moléculaire du fonctionnement physiologique. Ce glycome diversifié et dynamique est essentiel pour les processus cellulaires fondamentaux, notamment le métabolisme, la signalisation et l’adhésion. Les innovations en biologie spatiale ont ouvert de nouvelles voies pour l’imagerie moléculaire spatiale de diverses classes de glycomes. Ici, nous décrivons un protocole optimisé pour l’imagerie biomoléculaire spatiale du glycome dans le foie de souris fraîchement congelé. Le flux de travail comprend (1) la récolte rapide et la congélation, (2) le coupement par cryostat à une épaisseur et une position optimales, (3) la préparation des tissus et la digestion enzymatique sur tissu utilisant des enzymes actives en glucides, (4) l’application de matrice et l’acquisition de données par imagerie par désorption/imagerie de masse par ionisation assistée par la matrice (MALDI-MSI), et (5) le traitement et la visualisation des données pour situer les résultats dans un contexte biologique. L’utilisation de cette approche permet d’acquérir des cartes spatiales détaillées des glycanes et du glycogène liés par les N, révélant des caractéristiques physiologiques et cellulaires clés. Ces données permettent de définir l’hétérogénéité glycomique spatiale clé associée à la fonction et aux dysfonctions hépatiques. Ce flux de travail permet une glycomique spatiale hautement reproductible et sensible du foie de souris. De plus, il s’adapte facilement à d’autres tissus ou espèces, facilitant de nouvelles connaissances spatiales sur la biologie des glycomes en santé et en maladie.

Introduction

Le domaine de la biologie spatiale s’élargit rapidement, fournissant des informations cruciales sur la complexité biomoléculaire spatiale dynamique des organismes vivants. Plusieurs approches sont employées pour étudier des biomolécules distinctes dans un contexte biologique. Bien que certaines soient des techniques très spécialisées, la spectrométrie de masse (SEP) est devenue une technique générale importante pour quantifier un large éventail de biomolécules dans le contexte des cellules, des tissus ou des organismes.

L’imagerie par spectrométrie de masse par désorption/ionisation assistée par laser matricielle (MALDI-MSI) est l’une des techniques générales émergentes pour l’imagerie multiomique, de biomolécules spatiales. Il a été initialement créé pour la visualisation des protéines et peptides dans les tranchestissulaires 1. Depuis, elle a été étendue à de nombreux échantillons biologiques etmolécules divers 2. La technique peut être appliquée aux échantillonscellulaires 3,organoïdes 4, animauxmodèles 5, et échantillons depatients 6,7. Certaines classes moléculaires peuvent être mesurées directement à l’aide d’approches basées sur l’IMS, incluant de nombreux métabolites et lipides, tandis que d’autres types de biomolécules plus complexes, telles que les protéines et les glycanes, nécessitent un traitement enzymatique ou chimique pour être adaptées à la détection basée surl’IMS 2,8.

MALDI-MSI a également été appliqué à l’analyse spatiale des glycanes et glycogènes liés par les N, utilisant des flux de travail nécessitant un traitement enzymatique pour produire des fragments de glycane adaptés à la détectionMSI 9,10,11,12,13,14,15. Les N-glycanes sont séparés du résidu asparagine des protéines contenant la PNGase F, et les chaînes glucosiques du glycogène sont clivées avec l’isoamylase. Les principaux avantages de l’analyse du glycogène MALDI sont qu’elle permet de définir spatialement la distribution du glycogène dans l’échantillon biologique, de quantifier la relativité et d’obtenir des informations sur la ramification des chaînes glucosiques. Parce que les flux de travail N-glycanes et glycogènes nécessitent tous deux un traitement enzymatique de l’échantillon pour l’analyse MSI, ils ont été combinés en un flux de travail intégré pour l’analyse de glycome (Figure 1A). Ce flux de travail nécessite une préparation minutieuse des échantillons biologiques et un traitement spécifique pour permettre l’analyse en EM du glycome, suivie de l’acquisition et du traitement des données. Bien que le flux de travail nécessite une série d’étapes spécialisées, il produit des données spatiales glycome riches et de haute qualité, hautement reproductibles et pouvant être adaptées à de nombreux types d’échantillons16. De plus, le flux de travail est modulaire, de sorte que les étapes de traitement des échantillons peuvent être réalisées par des laboratoires de recherche indépendants avant la soumission des échantillons à des établissements spécialisés qui réalisent les dernières étapes de l’acquisition et de l’analyse des données MALDI-MSI.

Protocole

Cette recherche a été réalisée conformément aux directives du comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Floride. Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Prélèvement du foie

  1. Euthanasie animale et dissection
    1. Effectuer une luxation et une décapitation cervicales pour euthanasier la souris (selon les protocoles approuvés par l’institution).
      REMARQUE : Pour cet exemple, une souris sauvage de type C57BL/6J de 6 mois a été utilisée. À cet âge, les souris pèsent entre 25 et 33 g. Une large gamme d’âges, de tailles et de souches convient parfaitement à cette analyse.
    2. Placez immédiatement l’animal sur un sous-coussin absorbant et exposez la cavité abdominale à l’aide d’un scalpel stérile.
    3. À l’aide de pinces et de ciseaux stériles, isoler le foie avec un minimum de manipulation et de dommages tissulaires.
      REMARQUE : Les changements métaboliques surviennent rapidement. Évitez la perfusion ou la sédation si possible, et veillez à ce que les étapes de dissection soient effectuées aussi rapidement quepossible 17.
  2. Lavez et nettoyez rapidement le mouchoir.
    1. Trempez doucement le foie dans une solution physiologique tamponnée phosphate (PBS) pour éliminer tout sanguin.
    2. Trempez le tissu dans de l’eau déionisée (DI) deux fois.
    3. Bouchez l’excès d’eau en touchant doucement le mouchoir sur un essuie-glace propre.
      REMARQUE : Les échantillons plus grands que ce qui peut tenir sur une lame de microscope standard doivent être découpés en morceaux avant la congélation.
  3. Congélation d’échantillons
    1. Placez le foie nettoyé directement dans un bateau de pesée en polystyrène jetable pré-refroidi flottant sur de l’azote liquide.
    2. Une fois que le mouchoir change de couleur pour devenir un opacité brillant, environ 3 minutes, puis placez le mouchoir dans des sachets de papier aluminium préfabriqués et étiquetés sur de la glace sèche.
    3. Placez les sachets de papier aluminium avec les échantillons dans un congélateur à -80 °C pour les stocker. Les échantillons peuvent être conservés à long terme à -80 °C.

2 : Préparation d’un échantillon biologique

  1. Préparation à la cryosection
    1. Assurez-vous que le cryostat est allumé et équilibré à une température adaptée au tissu, entre -16 °C et -20 °C. La température exacte dépendra du type de tissu. Le foie doit être sectionné à une température légèrement plus chaude, d’environ -16 °C à -17 °C, pour éviter les déchirures tissulaires, tandis que les autres tissus doivent être sectionnés à -20 °C.
    2. Assurez-vous qu’il y a au moins deux mandrins, deux pinceaux fins, une pince à épiler fine et un insert en verre de 70 mm à la température du cryostat. De plus, étiquetez les lames au crayon avant de les placer dans le cryostat pour s’acclimater.
    3. Transférez le tissu du congélateur à -80 °C au cryostat sur de la glace sèche.
    4. Laissez les tissus s’acclimater à la température du cryostat pendant au moins 30 minutes.
    5. Assurez-vous qu’il n’y a pas de dommage au bord de l’insert en verre et qu’il est lisse là où le mouchoir rencontrera le guide anti-roulis en faisant glisser un doigt ganté le long du bord.
    6. Placez l’insert en verre dans le guide anti-roulis.
    7. Prenez une lame à profil bas et glissez-la soigneusement dans le porte-lame ouvert, puis refermez-le. Placez la protection rouge de la lame sur la lame jusqu’à la coupe.
    8. Montez le mouchoir sur le mandrin à l’aide d’un support M1, compatible avec MS. Placez un support de montage M1 à température ambiante sur le mandrin à l’intérieur du cryostat, en couvrant au moins deux anneaux du mandrin afin que le tissu soit bien fixé.
      REMARQUE : Le composé à température de coupe optimale (OCT) est souvent utilisé en cryosection ; cependant, elle provoque une suppression des ions dans les applications MS et doit être évitée. Si l’OCT doit être utilisé, alors un protocole supplémentaire en plusieurs étapes doit être utilisé pour minimiser ou supprimer l’OCT. De plus, certains centres de ressources MS n’analysent pas les échantillons qui ont été intégrés dans l’OCT.
    9. Prenez une pince à épiler refroidie et retirez le mouchoir du papier aluminium. Utilisez la pince à épiler pour positionner le mouchoir sur le mandrin dans l’orientation souhaitée.
    10. Placez le mandrin dans le cryostat pour permettre au support de monter de geler, environ 2 minutes. Une fois congelé, il sera durci et paraîtra opaque.
  2. Cryosectionnement des tissus hépatiques
    1. Placez le mandrin avec le mouchoir monté dans le porte-mandrin. Positionnez le mandrin de façon à ce que le tissu coupe à un angle de 90° par rapport à la lame.
    2. Rétractez le porte-mandrin jusqu’à ce que le tissu ne touche plus la lame. Apportez lentement le mandrin jusqu’à ce que le tissu soit immédiatement adjacent à la lame pour commencer à sectionner.
    3. Commencez la coupe avec une tranche d’épaisseur de 30 μm pour éliminer les tissus indésirables.
    4. Assurez-vous que la profondeur de la plaque de roulement crée une section lisse et que le tissu ne roule pas sur la plaque de rouleau. Si c’est le cas, alors desserrez légèrement la plaque de roulement. Si le tissu déplace la plaque de roulement et la frappe une seconde fois lors de la réinitialisation de la rotation, alors resserrez légèrement la plaque de roulement.
    5. À l’approche de la section souhaitée, diminuez l’épaisseur prévue de la tranche à 10 μm, ou une autre épaisseur souhaitée adaptée à l’application spécifique.
    6. Effectuez 10 rotations pour que le mandrin ait la bonne épaisseur afin d’éviter les affaissements et les sections inégales.
    7. Utilisez un pinceau refroidi pour dégager l’étape en vue du découpage. Fermez la plaque de roulement sur la lame et prenez lentement une section du mouchoir.
    8. Soulevez la plaque de roulement et utilisez les deux pinceaux fins et refroidis pour détacher doucement la section de la lame. Tirez la section sur le côté de la scène pour faciliter le montage sur la glissière.
    9. Prenez une lame refroidie d’un support de lame dans le cryostat et placez un index de l’autre côté de la lame par rapport à l’endroit où le tissu sera positionné pendant 10 secondes.
    10. Posez doucement la culasse sur le mouchoir et remontez-le. Ne poussez pas trop fort, car cela déchirerait le tissu. Le tissu doit fondre sur la lame et devenir translucide.
    11. Transférez rapidement les lames dans un dessiccateur pour séchage. Séchez la culasse dans le dessiccateur pendant 1 heure.
    12. Après séchage, les lames peuvent être directement traitées pour la MS ou scellées sous vide et stockées à -80 °C.

3. Préparation des lames pour l’ISM de glycomique

  1. Préparation des enzymes
    REMARQUE : La PNGase lyophilisée à faible teneur en sel prête pour la SEP peut être achetée et utilisée directement.
    1. L’isoamylase nécessite une dialyse pour éliminer l’excès de sel dans les applications en SEP. Préparez une ou plusieurs coupes de dialyse en les plaçant dans de l’eau HPLC pendant 15 minutes.
    2. Dialyser 200 μL d’isoamylase d’origine à l’aide d’une coupe de dialyse de 500 μL dans 14,3 mL d’eau HPLC pendant 2 heures à 4 °C, sans brasser. Remplacez les 14,3 mL d’eau HPLC par de l’eau HPLC fraîche et dialysez pendant 16 heures supplémentaires (toute la nuit) à 4 °C. Remplacer les 14,3 mL d’eau HPLC par de l’eau HPLC fraîche et dialyser pendant 8 heures supplémentaires à 4 °C.
    3. Retirez doucement l’isoamylase de la coupe avec une pipette et placez-la dans un tube microcentrifuge de 1,5. Mesurez le volume total de solution d’isoamylase après dialyse (en μL). À partir de l’activité initiale du stock, généralement 200 unités/mL, et du volume final, calculez le volume total nécessaire pour 3 unités d’isoamylase.
    4. Des aliquotes de pipette de 3 unités d’isoamylase dans des tubes PCR à paroi fine. Tubes de congélation instantanés dans de l’azote liquide. Conserver à -80 °C. Un tube de solution d’isoamylase dialysée peut être utilisé pour chaque protocole de pulvérisation, ce qui suffit pour quatre lames. Évitez les cycles de congélation/dégel pour maintenir l’activité enzymatique.
  2. Fixation et lavage des tissus
    1. Placez les lames dans un porte-lames et plongez-les dans un récipient en verre rempli de formol tamponné neutre à 10 % (NBF) pendant 1 heure.
    2. Retirez les glissières du NBF. Immergez les lames dans 70 % d’éthanol pendant 2 heures.
    3. Préparez quatre bocaux Coplin contenant 70 %, 80 %, 90 % et 100 % d’éthanol. Étiquetez clairement chaque bocal pour éviter toute confusion lors des lavages séquentiels.
    4. Transférez successivement les lames suivantes : 70 % d’éthanol pendant 5 minutes, 80 % d’éthanol pendant 5 minutes, 90 % d’éthanol pendant 5 minutes, 100 % d’éthanol pendant 5 minutes.
    5. Transférez les lames dans une boîte de Pétri en verre remplie de xylène frais à 100 %. Assurez-vous que les lames sont complètement immergées. Incubez les lames sur un shaker à 70 tr/min pendant 1 heure, selon la teneur en lipides du tissu. Répétez cette étape deux fois supplémentaires en utilisant du xylène frais à chaque lavage.
      REMARQUE : Ce protocole est conçu pour permettre une délipidation maximale, puisque les lipides sont connus pour entraîner une suppression des ions, et donc une reproductibilité maximale. Cependant, cela entraîne une délocalisation des signaux, diminuant ainsi la résolution obtenue. Une diminution des étapes de lavage, une limitation du temps de traitement et un contrôle attentif de l’humidité peuvent diminuer la délocalisation et ainsi améliorer la résolution des données.
    6. Placez les lames dans un dessiccateur toute la nuit pour les faire sécher.
    7. Placez les lames dans de l’éthanol à 70 % pendant 1 minute pour les réhydrater. Placez les toboggans dans de l’eau DI pendant 3 minutes. Répétez le lavage à l’eau DI avec de l’eau DI fraîche.
    8. Faites sécher les lames dans un dessiccateur pendant 10 minutes, ou jusqu’à ce qu’elles soient complètement sèches.
  3. Préparation des lames pour l’application enzymatique
    1. Préparez une chambre d’humidité HTX pour l’incubation en plaçant un essuie-tout imbibé d’eau DI sous la grille métallique. Placez la chambre dans un incubateur à 37 °C.
    2. Préparez un vapeur alimentaire en remplissant le réservoir d’eau jusqu’au sommet avec de l’eau du robinet. Réglez le minuteur à 60 minutes pour allumer l’appareil.
    3. Préparez le tampon citraconique en ajoutant 50 mL d’eau de qualité HPLC, 25 μL d’anhydride citraconique et 2 μL de 12 M HCl dans un tube Falcon de 50 mL. Faites un vortex sur la solution pendant 10 secondes pour bien mélanger. Chaque tube centrifugeuse de 50 mL de tampon citraconique suffit pour quatre lames. Vérifiez que le pH de la solution est de 3,0 (plage acceptable : 2,5-3,5).
    4. Remplissez chaque maillet avec le tampon citraconique préparé. Placez la lame avec le tissu tourné vers l’intérieur pour empêcher le tissu de toucher les côtés et permettre une extraction efficace de l’antigène. Deux glissières peuvent être utilisées par mailling, en utilisant les deux positions des bords, chaque coulisse ayant des tissus tournés vers l’intérieur.
    5. Vérifiez que la vapeur est émise par le distributeur à vapeur. Placez les enveloppes dans le défroisseur et faites couver pendant 30 minutes.
    6. Transférez les mailers dans un bain marie DI pendant 5 minutes. Remplacez la moitié du tampon citraconique dans le maillot par de l’eau DI et laissez reposer encore 5 minutes. Répétez cette dilution deux fois de plus.
    7. Retirez tout le solvant et lavez les lames en ajoutant de l’eau 100 % DI dans la courrier à culasse, puis en retirant l’eau DI. À l’aide d’une lingette de laboratoire, séchez au point les zones où le tissu n’est pas présent.
    8. Dessinez un cercle et un triangle au verso de chaque diapositive pour indiquer les emplacements internes standards. Appliquez 1 μL de 1 mg/mL de peroxydase de raifort (HRP ; cercle) et 1 μL de 10 mg/mL de glycogène hépatique de lapin (triangle) à l’avant de la lame.
    9. Placez les lames dans le dessiccateur pendant 15 minutes pour les faire sécher complètement.
  4. Pulvérisation enzymatique et digestion
    1. Retirez un tube de 100 μg de PNGase lyophilisée F (500 unités/μg) et un tube de 3 unités d’isoamylase et laissez décongeler pendant 10 minutes. Tubes à centrifugation à ~2000 x g pendant 5 s dans un tube microcentrifuge. C’est une enzyme suffisante pour pulvériser 4 lames.
    2. Pipeter 50 μL d’eau DI dans chaque tube F de la PNGase lyophilisée, faire tourner doucement pendant 10 s, puis faire tourner un microfuge à ~2000 x g pendant 5 s. Pipeter la solution de 50 μL de PNGase F directement dans le tube d’isoamylase. Ajoutez de l’eau HPLC à un volume final de 1 mL.
    3. Vortex le tube microcentrifuge à double enzyme 10 secondes et centrifuge à ~2000 x g pendant 5 secondes.
    4. Allumez le pulvérisateur HTX M5 et ouvrez le logiciel HTX M5. Assurez-vous que le type de plateau est réglé sur Ambiant sous l’onglet Système .
    5. Éteignez la pompe Knauer en appuyant sur le bouton stop à l’avant droit. Allumez la pompe à seringue externe via l’interrupteur sur son panneau arrière.
    6. Dans le logiciel HTX, sous l’onglet Méthodes , sélectionnez la méthode appropriée pour la pulvérisation à double enzyme. Les paramètres doivent être réglés à une température de la buse de 45 °C, 15 passages, débit de 0,025 mL/min, vitesse de 1200 mm/min, espacement des voies de 3 mm, diagramme CC, pression réglée à 10 psi, débit de gaz de 3 L/min et hauteur de la buse de 40 mm.
    7. Naviguez dans l’onglet Température et réglez la température de la buse pulvérisatrice à 45 °C. Utilisez une clé pour déplacer la ligne du pulvérisateur vers le connecteur supérieur.
    8. Ouvrez la vanne à gaz azote ultra-haute pureté et assurez-vous que la pression du pulvérisateur est de 10 psi. Sur la pompe à seringue, réglez le débit à 95 μL/min.
    9. À l’aide d’une seringue et d’une aiguille fraîches, remplissez 4 mL d’eau HPLC. Enlève toutes les bulles. Faites couler 2 mL d’eau à travers une section de ~6 pouces de la conduite du pulvérisateur jusqu’à un bécher à déchets.
    10. Fixez la seringue à la conduite du pulvérisateur et faites passer de l’eau à travers la pompe en démarrant et en faisant fonctionner à 95 μL/min pendant 5 minutes.
    11. Lors du rinçage de la pompe à seringue, collez les coulisses dans le coin inférieur gauche du plateau chauffé à l’aide d’un guide d’alignement métallique pour garantir que le tissu se trouve dans la zone de pulvérisation. Sous l’onglet Échantillon , définissez les paramètres X et Y pour la région de pulvérisation, en permettant un léger surpulvérisation pour assurer une couverture complète de la lame.
    12. Après 5 minutes, mettez la pompe en pause, déconnectez la seringue, aspirez de l’air dedans, puis poussez de l’air à travers la conduite du pulvérisateur pour purger toute eau résiduelle. Répétez si besoin.
    13. Chargez la solution à double enzyme dans une nouvelle seringue et connectez-la à la pompe, en veillant à ne pas laisser de bulles.
    14. Fixez la seringue à la conduite du pulvérisateur. Sur la pompe à seringue, ajustez le débit à 25 μL/min.
    15. Une fois que la buse de pulvérisation atteint 45 °C, appuyez sur Start sous l’onglet Cycle . Cliquez sur Non lorsque vous êtes invité à allumer la pompe Knauer. Appuyez sur Start sur la pompe à seringue pour commencer la pulvérisation.
    16. Placez une lame vierge sous la buse de pulvérisation pour confirmer le dépôt visible de la pulvérisation enzymatique. Une fois observé, cliquez sur Continuer sur le logiciel, placez le couvercle en verre sur le pulvérisateur, et surveillez la pulvérisation pour une application uniforme, comme indiqué par un mouillage uniforme.
    17. Lorsque le cycle de pulvérisation est terminé, appuyez sur stop sur la pompe, coupez l’azote gazeux, puis cliquez sur Confirmer la charge de la valve. Nettoyez la conduite et l’étage du pulvérisateur et coupez le pulvérisateur, en vous assurant que la pompe Knauer est remise en marche.
    18. Incubez les lames dans la chambre d’humidité HTX à 37 °C pendant 2 heures, en plaçant les lames orientées vers le haut. Une fois terminé, placez les lames dans le dessiccateur pendant 15 minutes. Les lames peuvent rester dans le dessiccateur toute la nuit, ou le protocole peut être poursuivi.
  5. Préparation et application de la matrice MALDI
    1. Avant l’application de la matrice, capturez une image optique de la lame à l’aide d’un scanner.
    2. Pèse 40 mg de CHCA solide dans un tube conique de 15 mL. Dissoudre la poudre de CHCA dans une solution d’acide trifluoroacétique à 0,1 % et d’acétonitrile à 50 % (ACN) à une concentration de 7 mg/mL.
    3. Sonicez la solution matricielle pendant 10 minutes en utilisant des cycles de 90 s allumés et 30 secondes éteints. Répétez ces étapes 5 fois pour assurer une dissolution complète et une homogénéité.
    4. Allumez le pulvérisateur HTX M5 et ouvrez le logiciel HTX M5. Ouvrez la vanne à gaz azote et réglez la pression du système à 10 psi.
    5. Dans le logiciel HTX, sous l’onglet Méthodes , sélectionnez la méthode appropriée pour la pulvérisation de matrice CHCA. Paramètres réglés à une température de la buse de 79 °C, 10 passages, débit de 0,1 mL/min, vitesse de 1300 mm/min, espacement des voies de 3 mm, diagramme CC, pression réglée à 10 psi, débit de gaz de 3 L/min et hauteur de la buse de 40 mm.
    6. Naviguez dans l’onglet Température , réglez la température de la buse pulvérisatrice à 79 °C. Sous l’onglet Pompe, réglez le débit à 100 μL/min.
    7. Collez les coulisses dans le coin inférieur gauche du plateau chauffé à l’aide d’un guide métallique pour assurer un bon alignement dans la zone de pulvérisation. Sous l’onglet Échantillon , définissez les paramètres X et Y pour la région de pulvérisation, en permettant un léger surpulvérisation pour assurer une couverture complète de la lame.
    8. Utilisez une seringue jetable et une aiguille pour extraire 5,5 mL de 50 % d’ACN (enlever les bulles).
    9. Réglez le pulvérisateur en mode CHARGE . Insérez la seringue ACN et injectez l’ACN. Retirez la seringue ACN et remplacez-la immédiatement par une nouvelle contenant 5,5 mL de solution filtrée de CHCA, en veillant à éviter les bulles. Réglez le pulvérisateur en mode SPRAY .
    10. Une fois que la buse de pulvérisation atteint 79 °C, appuyez sur Start sous l’onglet Cycle . Cliquez sur Oui quand on vous le demande.
    11. Utilisez une lame d’essai vierge et placez-la sous la buse du pulvérisateur. Pour confirmer le dépôt visible par pulvérisation matricielle, un dépôt en matrice jaune sera trouvé sur la lame. Une fois observé, cliquez sur Continuer, placez le couvercle en verre sur l’instrument et surveillez la texture du spray. Une pulvérisation constante produira une lame avec une opacité uniforme.
    12. Lorsque le cycle de pulvérisation est terminé, réglez le pulvérisateur en mode CHARGE et cliquez sur Confirmer la charge de la valve.
    13. Nettoyez le pulvérisateur en réglant la pompe à 300 psi et en baissant la température à 30 °C. Absorbez et poussez à travers la ligne 5 mL d’acétonitrile à 50 % deux fois et 5 mL de méthanol à 50 % deux fois. Nettoyez la scène avec du méthanol à 100 %. Lorsque la température atteint 30 °C, passez en CHARGE, coupez le gaz, coupez le pulvérisateur et assurez-vous que la pompe Knauer est rouverte.
    14. Placez les lames dans le dessiccateur pendant 15 minutes jusqu’à ce que la matrice soit complètement sèche. Les diapositives doivent être lancées dès que possible après la pulvérisation, dans un délai maximal de 14 jours, afin d’assurer une collecte fiable des données avec un rapport signal sur bruit approprié.

4. Collecte de données glycomiques MALDI-MSI

  1. Préparation à la collecte des données
    1. Fixez la culasse dans le porte-échantillon de l’instrument MALDI avec l’adaptateur de culasse. Insérez le porte-échantillon dans le MS et assurez-vous qu’il est bien placé pour l’imagerie.
    2. Ouvrez le logiciel flexImaging et importez l’image de diapositive optique précédemment enregistrée, voir l’étape 3.4.1. Si nécessaire, calibrez l’alignement de l’image avec l’étage de l’instrument afin que les sections tissulaires et les points standards soient correctement positionnés pour la sélection de la région.
    3. Définissez les régions d’imagerie des sections tissulaires, la norme HRP, la norme glycogène et le carré de la matrice de contrôle dans le logiciel. Décrivez chaque région comme une région distincte.
    4. Réglez la taille du pas raster à 50 μm, ce qui donne une résolution en pixels de 50 × 50 μm.
    5. Dans le logiciel de contrôle des instruments, sélectionnez le mode MS à ions positifs et réglez la plage de balayage à m/z 500 - 4000 avec une coupure de faible masse de 700,00 m/z.
    6. Chargez le paramètre d’accord d’imagerie MALDI pré-optimisé dans le logiciel de contrôle de l’instrument (ou saisissez les valeurs manuellement si nécessaire). Vérifiez que les tensions source et optique ionique sont réglées aux valeurs spécifiées : décalage de plaque MALDI 50,0 V ; Déviation 1 Delta 70.0 V ; Funnel 1 RF 500.0 Vpp ; Funnel 2 RF 500.0 Vpp ; Multipolaire RF 500.0 Vpp ; Énergie ionique 5,0 eV. Confirmez les paramètres de la cellule de collision et de la synchronisation TOF : Énergie de collision 10.0 eV ; Collision RF 4000.0 Vpp ; Temps de transfert 180,0 μs ; Stockage pré-impulsion 25,0 μs.
    7. Confirmez les réglages du laser sous l’onglet Laser. Sélectionnez Imaging 50 μm comme option par défaut.
    8. Étalonnez le spectromètre de masse à l’aide d’un mélange de calibrant externe tel que le mélange de mélodies. Introduisez le calibrant et exécutez la routine d’étalonnage de l’instrument. Ajustez l’étalonnage pour que l’erreur de précision de masse soit à 0,001 % et le score de précision de calibration à 100 %.
    9. Régler l’acquisition pour effectuer une rafale de 320 tirs laser à une fréquence de 10 000 Hz. L’atténuation du laser doit être ajustée à 37 % pour maintenir l’intensité du signal dans la plage dynamique optimale. Ajustez les tirs laser et l’atténuation selon les besoins.
    10. Utilisez la fonction automatisée d’alignement du faisceau, l’ajustement du profil de la cible et l’ajustement de la mise au point pour garantir que le laser est correctement focalisé sur l’échantillon. Dans une région hors du tissu, exécutez l’ajustement automatique du faisceau sous l’onglet Laser dans le logiciel de contrôle pour aligner le laser avec l’optique ionique. Cela garantira que le laser et l’étage sont ajustés pour une collecte optimale des données. Enfin, effectuez la génération de profil cible et les ajustements de réglage de la mise au point dans l’onglet porteuse d’échantillon.
    11. Confirmez que les points standards internes produisent les pics ioniques attendus, indiquant la préparation à la collecte des données. La HRP devrait avoir un pic glycané prononcé à 1211,42. Le glycogène devrait avoir des pics proéminents régulièrement espacés, avec les pics d’intensité les plus élevés à 1013,32, 1175,37 et 1337,43.
      REMARQUE : Si des problèmes d’intensité sont identifiés, revenez à la configuration laser. Si des problèmes de précision massive sont identifiés, revenez sur la calibration.
  2. Collecte des données MALDI-MSI
    1. Commencez l’acquisition de l’imagerie MALDI-MS pour les régions définies en cliquant sur le bouton Start dans le logiciel d’imagerie. L’instrument rastera automatiquement le laser sur chaque région définie à des intervalles de 50 μm, acquérant un spectre MS1 à ions positifs (m/z 500-4000) à chaque pixel. Le temps typique de collecte des données pour une section hépatique à cette résolution est de 135 minutes.
      REMARQUE : Après l’exécution, l’instrument sauvegarde automatiquement les spectres pour chaque pixel acquis, créant un dossier .d avec les données brutes.

5. Analyse des données MALDI-MSI

  1. Importation et exportation de données
    1. Importez le jeu de données dans SCiLS Lab, ou un logiciel d’analyse MSI équivalent, pour visualiser les cartes d’intensité ionique du glycome à travers les sections tissulaires.
    2. Ouvre le laboratoire SCiLS. Sélectionnez Nouveau. Sélectionnez le fichier .mis depuis la sortie MALDI.
    3. Une fois que le fichier .mis s’ouvre dans SCiLS, cliquez sur Suivant. Sélectionnez la plage automatique pour la portée m/z. Sélectionnez l’axe automatique pour les paramètres d’axe. Sélectionnez la taille absolue du bac. Cliquez sur Suivant puis sur Importer. Sélectionnez le dossier où le fichier sera enregistré.
    4. Une fois l’importation terminée, ouvrez le nouveau fichier .slx.
    5. Cliquez sur fichier, Importer, et sélectionnez la liste des fonctionnalités dans l’option fichier. Importez les annotations de glycome et créez des images ions en allant dans le volet de la liste de fonctionnalités, en sélectionnant la bonne liste, puis en cliquant sur le bouton créer des images ioniques.
      REMARQUE : Des listes de fonctionnalités robustes sont disponibles pour les N-glycanes16, 18, 19 etglycogène 13.
    6. Normaliser les données, selon les besoins. Le nombre total d’ions (TIC) est la normalisation la plus couramment utilisée.
    7. Une fois les images ioniques chargées, parcourez la liste des fonctionnalités et assurez-vous d’une intégration correcte des pics, en ajustant manuellement pour les caractéristiques où le pic n’est pas entièrement intégré. Pour ajuster, cliquez gauche sur le pic en maintenant shift. Une fois le pic intégré, appuyez sur contrôle et la barre d’espace sur le clavier. Cela générera une nouvelle image ionique pour le pic ajusté.
    8. Après avoir répété pour le reste de la liste des fonctionnalités, dans le panneau d’images ioniques, sélectionnez la liste Sauvegarder , nommez la liste et cliquez sur Enregistrer.
    9. Allez dans la table des fichiers, des fonctionnalités, et ouvrez la table des listes des fonctionnalités qui vient d’être sauvegardée. Triez par m/z. Les caractéristiques ajustées apparaîtront avec une case vide dans la colonne du nom. Renommer les sommets ajustés en copiant-coller le nom et en supprimant le pic original en sélectionnant le bouton supprimer la ligne sélectionnée de la liste des caractéristiques situé en haut au centre de la table des caractéristiques.
    10. Après ajustement de tous les noms, une liste finale annotée des pics est obtenue. Cliquez sur le bouton d’ajouter de l’intensité situé près du bouton supprimer. À partir de là, sélectionnez les échantillons d’intérêt pour exporter l’intensité moyenne des caractéristiques annotées pour chaque région imagée.
    11. Assurez-vous de sélectionner le mode de traitement de l’intervalle de crête et le compte total d’ions pour la normalisation. Cliquez sur OK. De nouvelles colonnes apparaîtront avec les données correspondantes. Pour exporter les données, sélectionnez la flèche orientée vers l’extérieur et enregistrez en tant que .csv.

Résultats

Un traitement soigneux d’un foie provenant d’une souris de type sauvage, y compris la coupe d’une coupe transversale complète (Figure 1A), a permis de définir le glycome par MALDI-MSI, avec divers oligosaccharides dérivés du glycogène et des glycanes liés à la N sur une plage de m/z (Figure 1B). Le glycogène était largement localisé dans les hépatocytes hépatiques et manquait de vaisseaux et de tissu conjonctif dans les voies portes, comme prévu (Figure 1C,D). Il est important de noter que les données MALDI-MSI ont permis de mesurer à la fois la distribution spatiale du glycogène et la distribution de la longueur de chaîne, une caractéristique clé du glycogène dans le métabolisme normal et les états pathologiques (Figure 1D). De plus, les différents glycanes liés à l’Azot présentent des organisations variées. La distribution spatiale observée varie de la répartition large des hépatocytes (Figure 1E) à des foyers régionaux, cohérents avec l’organisation sinusoïdale du foie (Figure 1F), jusqu’au marquage spécifique des éléments du voile porte (Figure 1G-I).

figure-results-1
Figure 1 : Analyse MALDI-MSI du glycome du foie de souris. (A) Schéma des méthodes critiques dans la préparation des échantillons, l’acquisition de données et l’analyse. (B) Échantillonner les spectres de masse dérivés de cette approche. Des flèches en rouge illustrent les oligosaccharides régulièrement espacés dérivés du glycogène, différant d’un monosaccharide de glucose. Les flèches en bleu indiquent les N-glycans, qui se trouvent réparties à travers les spectres. Dans le foie, les pics de glycogène sont généralement plus prononcés, surtout à des valeurs m/z élevées. (C) Distribution spatiale du maltohexaose (DP6) dérivé du glycogène dans le foie. (D) Distribution des longueurs de chaînes de glycogène dans le foie. (E-G) Répartition spatiale des différentes espèces de glycanes liés à l’Azom dans le foie. (H) Coloration hématoxyline et éosine (H&E) pour une région centrale ciblée, accompagnée d’annotations anatomiques. (I) Insertion focalisée correspondante montrant la localisation spatiale d’un glycane lié à N supplémentaire (Hex5dHex1HexNAc5) dans les éléments du tractus portail. Barres d’échelle : 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Discussion

MALDI-MSI est un outil émergent pour la biologie spatiale des glycomes. Il est important de noter que, bien que ce protocole se concentre sur la collecte de données à l’aide de matériel spécifique, il peut être facilement adapté aux plateformes MALDI-MSI de plusieurs fournisseurs13. Le traitement des échantillons est identique jusqu’à la méthode 4, bien que certains fournisseurs puissent exiger l’utilisation de lames spécialisées. Les modifications de la collecte de données, utilisant des paramètres spécifiques à la plateforme MALDI-MSI, permettent une adaptation rapide de ce protocole. Des logiciels spécifiques au fournisseur pour le traitement des données peuvent être utilisés, comme détaillé à l’étape 5, ou, alternativement, des plateformes pour un traitement rigoureux et reproductible des données MALDI-MSI peuvent êtreemployées 19.

MALDI-MSI est un outil particulièrement utile pour comprendre la biologie, car différents organes, tissus et cellules ont des schémas différents pour leur glycome. Le foie est bien adapté à l’analyse du glycome car il contient des niveaux élevés de glycogène et une diversité de glycanes liés à laN-13. D’autres organes présentent des niveaux et une diversité plus élevés de glycanes liés à la N, et des niveaux plus faibles deglycogène 13. Il est important de noter que le glycome varie selon les organes selon l’état métabolique et pathologique de l’organisme, et donc le glycome fournit une source riche d’informationsbiologiques 5,14,15,20. Le développement continu d’enzymes uniques actives en glucides pour l’analyse MALDI-MSI promet d’étendre l’analyse glycome à d’autres biomolécules orthogonales dans le glycome.

Bien qu’il présente de nombreux avantages, MALDI-MSI est actuellement limité en résolution par rapport aux autres outils utilisés en biologie spatiale. Ce protocole utilisait la collecte de données à résolution de 50 μm. Bien qu’excellentes pour l’analyse physiologique, les données à résolution unicellulaire feraient progresser significativement le champ21. En particulier, la délocalisation peut constituer un obstacle important à une résolution accrue dans les méthodes utilisant la pulvérisation enzymatique et l’incubation ultérieure dans des conditions humides. Les avancées récentes dans le matériel de traitement des échantillons, les méthodologies de gestion des échantillons, le matériel d’acquisition de données, l’utilisation de l’étiquetage sélectif et le traitement des données permettent à la collecte de données MALDI-MSI d’atteindre la résolutioncellulaire 22,23. Cependant, il existe des compromis entre résolution et rapport signal sur bruit ainsi que des limitations inhérentes aux méthodes actuelles de préparation des échantillons pour MALDI qui doivent être prises en compte. Des applications très spécifiques atteignent déjà l’objectif de MALDI-MSI résolu en cellule unique en utilisant des innovations à la fois dans le traitementd’échantillons 24 et dans les algorithmes novateurs, suggérant que des solutions générales à ces problèmes sontaccessibles 25,26,27.

Après la collecte des données, la lame peut être colorée via H&E à des fins d’annotation histologique. Cependant, des lésions cellulaires et tissulaires sont associées à la collecte de données MALDI-MSI, cette stratégie limite donc l’étendue de l’annotation cellulaire. Sinon, des tranches de tissu séquentielles peuvent être utilisées pour l’H&E. Cette stratégie fournit des données de haute qualité, mais nécessite un alignement et une intégration de coupes d’échantillons discrètes.

À noter, les tissus embêtés en paraffine fixée au formol (FFPE) sont très adaptés à l’analyse de glycome par MALDI-MSI avec de légères modifications dans le protocole de préparation del’échantillon 13. Cependant, le tissu FFPE ne peut pas être utilisé efficacement pour la métabolomique et d’autres analyses similaires, c’est pourquoi les échantillons fraîchement congelés, comme détaillé ici, sont préférés pour les approches multiomiques28. La préparation des échantillons est un élément essentiel de toute chaîne MSI pour les biomolécules labiles, ce qui nécessite des approches particulières pour la récolte et la manipulation deséchantillons 17, 29, 30.

Les méthodologies visant à étendre la généralité et l’utilisation généralisée des approches basées sur MALDI-MSI progressent rapidement avec des améliorations spectaculaires du matériel etdes logiciels 19. De plus, les approches de pointemulti-amique 28 etmultimodale 21 combinées à l’apprentissage automatique et à l’intelligence artificielle sont particulièrement prometteuses pour gérer ces ensembles de données trèscomplexes 31.

Déclarations de divulgation

R.C.S., M.S.G. et C.W.V.K. sont co-directeurs du Center for Advanced Spatial Biomolecule Research (CASBR) à l’Université de Floride et cofondateurs de Sugar3 LLC. R.C.S. a reçu un soutien à la recherche et/ou des honoraires de conseil de Maze Therapeutics. M.S.G. a reçu un soutien à la recherche, des composés de recherche ou des honoraires de conseil de la part de Maze Therapeutics, Valerion Therapeutics, Ionis Pharmaceuticals, PTC Therapeutics et Aro Biotherapeutics. M.S.G. est membre du comité consultatif scientifique de Chelsea’s Hope, de la Glut1-Deficiency Syndrome Foundation et de l’Adult Polyglucosan Body Disease Foundation.

Remerciements

Nous remercions les membres des laboratoires Vander Kooi, Sun et Gentry pour leurs discussions fructueuses. Cette étude a été soutenue par des subventions des National Institutes of Health (NIH) au Biospecimen Procurement & Translational Pathology Shared Resource Facility du Centre de cancérologie Markey de l’Université du Kentucky, P30CA177558 au D.B.A., R01AG066653, R01CA266004, R01AG078702, R01CA288696, RM1NS133593 au R.C.S., R35NS116824 au M.S.G., R01DC019054 au C.W.V.K., et au College of Medicine de l’Université de Floride.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Sous-coussinet absorbantDenville ScientificB1623
Acétonitrule (ACN)Sigma-Aldrich34851-4X4L
Feuille d’aluminiumFisher Scientific & nbsp ;15078292
Anhydride citraconiqueSigma-Aldrich125318
Tube conique (15 mL)Alkali ScientificCW5600
Bocaux CoplinDWK Sciences de la Vie900570
Cryostat  ;LeicaCM1860
Manteau cryostatLeica14041926491
DessiccateurBel ArtF424004131
Coupelle de dialyseThermo Fisher88400
ÉthanolFisher Scientific & nbsp ;22032601
Cuiseur vapeur alimentaireRival  ;CKRVSTLM21  ;   ;
Insert en verre (70 mm)Gel CompanyLGI50
GlycogèneSigma-AldrichG8876Standard
Peroxydase de raifort (HRP)Sigma-AldrichP8125Standard
Eau HPLCSigma-Aldrich270733-4X4L
Pulvérisateur HTXHTX TechnologiesM5
Acide chlorhydriqueFisher Scientific & nbsp ;A144-500
IsoamylaseMegazymeE-ISAMY
Pompe de KnauerKnauerP 4.1 S
Lame à profil basSciences de la microscopie électronique63059-01
Support de montage M1Epredia1310
Spectromètre de masseBruker DaltonicstimsTOF fleX
Tube Microfuge (1,5 mL)Alkali ScientificCN3016
AiguilleBD305109
NBF de formol tampon neutreMillipore sigmaHT501128-4L
Gaz azoteAirgasNIUHP300
PBSFisher Scientific & nbsp ;SH30256. FS
Tubes PCRPartenaires MedSupply62-1091-1
PNGase F PRIME-LY ULTRA & nbsp ;Biographie du BulldogNZPULT10LY
Laboratoire SCiLSBruker Daltonics1889000
ShakerThermo Scientific88882007
Diapositive  ;   ;Sciences du microscope électronique71873-02
Courrier à diapositivesProduits RPI212620A
Sonicater (Bioruptor Pico)DiagénodeB01080010
Pinces stérilesDR InstrumentsS08098
Scalpel stérileWPIWPI-500240
Ciseaux SterilesOutils scientifiques finement14084-08
Seringue  ;   ;Grainger19G342
Pompe à seringueNouvelle èreNE-300
BandeFisher Scientific & nbsp ;15-901-R
Pinceau finAnezus#00
Acide trifluoroacétiqueSigma-AldrichT6508-1L
Mix de mélodie, ESI faible concentrationAgilentG1969-85000
Bateaux de poidsSigma-AldrichHS120882
XylèneSigma-Aldrich534056
&alpha ;-cyano-4-acide hydroxycinnamique (CHCA)Société Chimique Caïman15254

Références

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