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Méthodes de clamp dynamique pour étudier l’excitabilité neuronale altérée associée à l’autisme

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DOI :

10.3791/69155

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17 octobre 2025

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1Department of Biology, Miami University

Dans cet article

Résumé

L’électrophysiologie à pince dynamique peut établir des liens de causalité entre les déficits de décharge neuronale et le dysfonctionnement des canaux ioniques. Nous décrivons des méthodes et des protocoles de clamp dynamique dans les neurones cérébelleux de Purkinje de souris, en notant les ressources utiles et les considérations techniques. Dans une étude représentative, nous ajoutons une conductance sodique modélisée aux neurones de Purkinje Tsc1-/- pour sauver les décharges répétitives.

Résumé

Les troubles du spectre autistique (TSA) résultent d’un large éventail de facteurs génétiques et environnementaux. Alors que de nombreuses mutations liées aux TSA perturbent le développement ou la plasticité des synapses, il a été démontré qu’un nombre croissant d’entre elles modifient l’expression et le fonctionnement des canaux ioniques voltage-dépendants, entraînant des déficits de l’excitabilité intrinsèque neuronale. Les enregistrements de tension par pince de tension de cellules entières peuvent être utilisés pour caractériser comment les mutations liées aux TSA affectent le fonctionnement des canaux ioniques. Cependant, ces expériences ne parviennent pas à évaluer directement comment une conductance ionique altérée affecte l’activation du potentiel d’action neuronale. L’électrophysiologie à pince dynamique comble cette lacune en permettant l’injection en temps réel de conductances ioniques définies par l’utilisateur dans des neurones vivants. Cela permet de tester de manière causale comment les changements dans les propriétés des canaux ioniques affectent l’activité électrique d’un type de cellule donné. Dans cet article sur les méthodes, nous décrivons comment mettre en œuvre l’électrophysiologie par pince dynamique dans des neurones Purkinje de souris adultes enregistrés dans des conditions physiologiques dans des tranches de cerveau cérébelleux préparées avec acuité aiguë. Les neurones de Purkinje sont un modèle particulièrement pertinent pour ce travail car ils ont une capacité intrinsèque à déclencher des potentiels d’action répétitifs à haute fréquence (20-100 Hz) et sont systématiquement impliqués dans le dysfonctionnement du circuit cérébelleux lié aux TSA. Nous nous concentrons sur Tsc1, un gène dont les mutations de perte de fonction sont parmi les causes monogéniques les plus courantes de TSA. Dans les neurones Purkinje de souris, la délétion de Tsc1 a également été associée à une réduction de l’expression du canal sodique voltage-dépendant (Nav). Nous utilisons des modèles d’état cinétique de Markov pour simuler et reproduire les propriétés de conductance Nav des neurones de Purkinje, puis nous utilisons la pince dynamique pour évaluer directement comment les changements de conductance Nav affectent l’activation intrinsèque des neurones cérébelleux intacts de Purkinje. Nous fournissons des instructions et des ressources pour modifier et ajuster les modèles de conductance ionique. En intégrant la modélisation de la conductance ionique, la pince dynamique et les techniques conventionnelles de patch-clamp, cette approche fournit un cadre puissant et flexible pour relier les perturbations génétiques aux résultats physiologiques dans les neurones pertinents pour les TSA.

Introduction

Des recherches antérieures sur les facteurs moléculaires et cellulaires des troubles du spectre autistique (TSA) ont souvent mis l’accent sur le dysfonctionnement synaptique comme élément central de la physiopathologie du trouble 1,2. De nombreuses études ont démontré une augmentation de la densité des synapses excitatrices 2,3,4, une altération de l’élagage synaptique5 et des altérations des protéines de densité postsynaptique 6,7 dans des modèles TSA. Cependant, des travaux récents ont montré que les changements dans l’excitabilité neuronale intrinsèque sont également des moteurs de la pathologie des TSA. Par exemple, des modèles de souris transgéniques TSA et des lignées cellulaires dérivées de patients ont révélé une altération de la génération de potentiel d’action dans les neurones cérébelleuxde Purkinje 8,9,10 et les neurones pyramidaux corticaux11, ainsi qu’une excitabilité dendritique atténuée et une intégration synaptique dans des sous-classes de neurones pyramidaux corticaux12. Les canalopathies impliquant des mutations de perte de fonction dans SCN2A, codant pour le canal sodique voltage-dépendant (Nav) Nav1.2 formant des pores α sous-unité, sont maintenant une cause monogénique bien connue de TSA13, et il a été démontré qu’elles provoquent des déficits dans l’excitabilité intrinsèque de diverses classes de neurones centraux 14,15,16,17. Au fur et à mesure que ces types d’investigations progressent, il est important d’établir des liens de causalité entre les changements pathogènes des conductances ioniques et les effets de ces changements sur le fonctionnement des neurones et des circuits. L’électrophysiologie à pince dynamique offre une approche efficace pour cette tâche. Sharp et al. (1992 et 1993)18,19, ainsi que Robinson et Kawai (1993)20 ont initialement décrit des méthodes de pince dynamique dans lesquelles une conductance ionique non linéaire simulée, avec ou sans propriétés dépendantes de la tension, est injectée/ajoutée dans des neurones vivants, permettant aux chercheurs d’évaluer en temps réel comment les propriétés ou les changements présumés d’une conductance ionique voltage-dépendante affectent l’activation neuronale21, 22. Épisode 22

La mise en œuvre d’expériences de pinces dynamiques a été facilitée par plusieurs systèmes logiciels disponibles gratuitement tels que RTXI23, QuB 24,25 et StdpC26 ; Cependant, les progrès récents ont simplifié la mise en œuvre des pinces dynamiques avec des systèmes commerciaux plug-and-play qui permettent de développer, de modifier et d’appliquer des conductances de modèle sur un seul ordinateur et dans un seul progiciel de fabrication. Ici, nous fournissons des protocoles pour effectuer une clamp dynamique à l’aide d’un système Sutter dPatch27 et fournissons une enquête d’échantillon dans laquelle nous testons comment la délétion ciblée de la sclérose tubéreuse 1 (Tsc1)9, qui est un locus prévalent de mutations pour ASD28, affecte l’activation intrinsèque des neurones cérébelleux de Purkinje à la suite de changements dans l’expression de la conductance sodique voltage-dépendante8.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par les directives du comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de Miami (protocole #1044). Les expériences ont utilisé des souris C57BL/6J de type sauvage mâles et femelles et des lignées transgéniques avec un arrière-plan de souche C57BL/6J. Pour les expériences électrophysiologiques, les animaux étaient âgés de 6 à 7 semaines. Tous les enregistrements ont été effectués à partir de neurones de Purkinje dans les lobules 5, 6 ou 7 du vermis cérébelleux.

1. Configuration et préparation tissulaire pour les expériences de patch-clamp de neurones de Purkinje

  1. Préparez 1 L de liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) contenant : 125 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de NaH2PO4, 25 mM de NaHCO3, 2 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2 et 25 mM de dextrose à pH 7,4 (~300 mOsM/L). Préparez également 250 mL de « solution de coupe » contenant : 240 mM de saccharose, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de NaH2PO4, 0,5 mM de CaCl2 et 7 mM de MgCl2. Étaler (bulles) l’ACSF et les solutions de coupe avec du gaz carbogène (95 % O2 / 5 % CO2) pendant au moins 20 minutes avant utilisation et en continu tout au long de toutes les expériences.
  2. Préparez une chambre de stockage de tranches de cerveau remplie d’ACSF pour une utilisation ultérieure. Assurez-vous que les tranches cérébelleuses (une fois ajoutées à la chambre de tranche) sont immergées avec les deux côtés des tranches cérébelleuses exposées à l’ACSF. Pour ce faire, placez les tranches immergées sur un treillis en nylon étroitement étiré qui est également immergé.
  3. Préparez le poste de chirurgie. Préparez quatre morceaux de ruban adhésif qui serviront à épingler l’animal anesthésié. Dans un seau rempli de glace ou une glacière, placez la moitié inférieure d’une boîte de Pétri dans la glace avec les parois vers le bas et le fond de la boîte de Pétri vers le haut. Placez un papier filtre (≥ 3 cm2) sur le fond de la boîte de Pétri et imprégnez-le de 2 à 3 ml de solution de coupe.
    REMARQUE : Pour les expériences décrites, un vibratome compresstome est utilisé pour trancher des tranches cérébelleuses parasagittales de 350 μM. Avec le compresstome, le tissu pour le tranchage est collé à un tube d’échantillon en plastique qui s’insère à travers un mince tube métallique environnant. Lors du tranchage, le tube de l’échantillon est poussé à travers le tube métallique, qui reste fixe. Une fois que le tissu est collé au tube de l’échantillon, le tissu est noyé dans de l’agarose réchauffé à 2 %. La lame du compresstome est collée sur un support fixe, qui est fixé au bras du vibratome. D’autres types de vibratomes ne nécessitent pas d’enrober du tissu dans de l’agarose réchauffée, mais devraient fonctionner de la même manière pour les expériences décrites.
  4. De plus, dans la glace, placez une lame de rasoir à un seul tranchant et un petit bécher (10 ml) rempli de solution de coupe. Conservez un bloc réfrigérant, qui sert à refroidir rapidement l’agarose réchauffé une fois qu’il est ajouté au tube de l’échantillon, ainsi qu’une seringue de 30 mL remplie de solution de coupe refroidie sur de la glace. Assurez-vous que la seringue de 30 ml est reliée à une section de 30 à 60 cm de tube intraveineux (IV) (à l’aide d’un cône mâle Luer lock) qui est reliée (à l’extrémité terminale) à une aiguille (≥ 26 G) avec une base femelle Luer lock.
  5. Placez le reste de la solution de coupe dans un congélateur à -80 °C. Une fois que cette solution de coupe a la consistance d’une glace en poudre (20-25 min), retirez-la du congélateur à -80 °C et placez-la sur de la glace.
  6. Anesthésier une souris adulte âgée de 5 à 8 semaines à l’aide d’une injection intrapéritonéale de 1 mL/kg de poids animal de kétamine (10 mg/mL)/xylazine (0,25 mg/mL) cocktail.
  7. Préparez une solution d’agarose à 2 % en dissolvant 0,5 g d’agarose dans 25 mL de solution de coupe. Une fois que l’animal est anesthésié (ne répond pas au pincement des orteils), chauffer la solution d’agarose à 2 % (~30 s au micro-ondes) et transférer la solution d’agarose réchauffée dans un bain-marie à 40 °C.
    REMARQUE : Les étapes numérotées 1.8-1.18 doivent être effectuées de toute urgence et avant que l’agarose réchauffée ne se solidifie.
  8. Épinglez les membres de l’animal à la table d’opération avec du ruban adhésif. À l’aide de ciseaux, ouvrez la cavité thoracique de l’animal, en veillant à ce que les poumons et les organes abdominaux ne soient pas coupés. Utilisez des pinces de verrouillage ou des hémostatiques pour maintenir la cage thoracique ouverte, exposant le cœur. Pour ce faire, verrouillez la pince sur le sternum et posez-la soigneusement vers l’avant de l’animal (avec les trous pour les doigts de l’outil à côté de la tête de l’animal).
  9. Insérez l’aiguille reliée à la seringue de 30 ml dans le ventricule gauche et utilisez une pince pour comprimer le tissu autour de l’aiguille, en maintenant l’aiguille dans la chambre intraventriculaire gauche. À l’aide de ciseaux chirurgicaux, faites une petite incision dans l’oreillette droite et perfuser rapidement l’animal avec les 25 ml de solution de coupe réfrigérée.
    REMARQUE : Assurez-vous que le perfusat pénètre dans le ventricule gauche et sort de l’oreillette droite, évacuant le sang du système circulatoire de l’animal.
  10. Lorsque la perfusion est terminée, décapitez rapidement l’animal et coupez le cuir chevelu le long de la ligne médiane de la tête vers le bregma pour exposer la surface du crâne.
  11. À l’aide de ciseaux, retirez le tissu conjonctif de la face postérieure du crâne et retirez l’excès de tissu de la moelle épinière, en veillant à ce que la moelle épinière ne dépasse pas du foramen magnum.
  12. Placez une lame de ciseau dans le foramen magnum et coupez le long de la circonférence du crâne sur les deux faces temporales vers le bregma, en laissant un peu de tissu crânien en place au bregma.
  13. Placez une lame de ciseaux ou la moitié d’une pince fine dans le foramen magnum et soulevez-le vers le haut, en séparant le crâne du cerveau. Veillez à ne pas enfoncer la lame de ciseaux ou la pince dans le cerveau tout en soulevant le crâne.
  14. À l’aide d’une spatule chirurgicale, on peut prélever sous le cervelet (à partir de la partie antérieure) et retirer délicatement le cerveau dans le bécher de 10 ml contenant une solution de coupe réfrigérée, en prenant soin de protéger le cervelet pendant le transfert du cerveau. Mettez des gants propres à ce stade.
  15. Retirez délicatement la cervelle du bécher (à l’aide de la spatule) et placez-la sur le papier filtre (sur une boîte de Pétri). Utilisez la lame à un seul tranchant pour couper le long de l’axe parasagittal à quelques millimètres de la ligne médiane. Jetez le plus petit tissu sectionné parasagittal. Faites une deuxième incision coronale à mi-chemin du cerveau antérieur (en avant du cervelet). Jetez le tissu coronaire coupé qui est en avant du cervelet.
  16. Glissez la lame à un seul tranchant sous la partie antérieure du cerveau antérieur et soulevez-la afin de faire pivoter le tissu restant de sorte que le côté de la coupe parasagittale initiale soit tourné vers le bas (sur le papier filtre) et que l’hémisphère cérébelleux non coupé soit tourné vers le haut.
  17. Placez le tube d’échantillon à la verticale dans la glace et ajoutez une fine couche de superglue (adhésif cyanoacrylate) sur la surface du tube. À l’aide d’une spatule courbée à 90°, transférez soigneusement le tissu cérébral du papier filtre à la surface du tube d’échantillon, en maintenant l’orientation du tissu. Assurez-vous que l’hémisphère cérébelleux non coupé continue d’être tourné vers le haut. Une fois le tissu placé/collé sur le tube d’échantillon, faites glisser le tube métallique vers le haut de manière à ce qu’il entoure le tissu cérébral.
  18. À l’aide d’une pipette motorisée de 10 ml, remplissez le tube de l’échantillon avec l’agarose réchauffé (qui encastre le tissu cérébral). Refroidissez rapidement le tissu (maintenant nausé dans de l’agarose réchauffée) en serrant le bloc de refroidissement autour du tube métallique pendant ~30 s.
  19. Placez le tube de l’échantillon dans la chambre de bain du vibratome et remplissez le bain avec la solution de coupe bouée. Étalez continuellement la solution de coupe pendant le tranchage du tissu cérébral, mais n’exposez pas directement les tranches cérébelleuses aux bulles de gaz.
  20. Coupez des tranches parasagittales de 300 à 350 μm, en transférant immédiatement chaque tranche dans la chambre de maintien des tranches, remplie d’ACSF à température ambiante. Une fois que toutes les tranches sont dans la chambre de tranchement, incubez la chambre de tranche dans un bain-marie à 33 °C pendant 25 minutes.
  21. Après 25 minutes dans le bain-marie, placez (à nouveau) la chambre de coupe à température ambiante, en attendant au moins 35 minutes supplémentaires avant de tenter des enregistrements de patch à partir de l’une des tranches cérébelleuses.

2. Configuration d’un modèle de conductance basé sur Markov dans la pince dynamique

REMARQUE : La pince dynamique est l’application en temps réel d’une conductance modélisée à une cellule vivante. La tension de la membrane est enregistrée/échantillonnée à l’aide d’une électrode pointue ou d’une électrode patch, et le signal numérisé est envoyé à un logiciel de pince dynamique, qui calcule, à l’aide du ou des modèles de conductance ionique appliqués, l’injection de courant de pince dynamique appropriée pour la tension échantillonnée. Le signal d’injection de courant de pincement dynamique calculé est envoyé à l’amplificateur et à l’étage de tête pour être injecté (via une électrode) dans la cellule. Pour qu’une conductance modélisée soit ajoutée de manière appropriée à une pile qui déclenche des potentiels d’action, qui entraînent des changements transitoires rapides de la tension membranaire, la fréquence d’échantillonnage de la tension doit être suffisamment élevée et le délai entre l’échantillon de tension et l’injection de courant de pince dynamique (parfois appelé latence) doit être minimal et invariant29.

  1. Avant toute expérience de pince dynamique, élaborer ou obtenir le modèle mathématique de la ou des conductances ioniques à utiliser dans l’expérience de pince dynamique. Ces modèles peuvent se présenter sous la forme d’un modèle d’état cinétique de Markov, d’un modèle de Hodgkin-Huxley (HH) ou d’une conductance passive (linéaire). Assurez-vous que le modèle de conductance choisi reproduit avec précision les propriétés cinétiques et dépendantes de la tension de la conductance ionique prévue.
    REMARQUE : Les expérimentateurs peuvent confirmer les propriétés d’une conductance ionique modélisée, avant de l’utiliser dans des expériences de pince dynamique, en testant la conductance modélisée (in silico) dans des études de simulation de pince de tension. Les propriétés et considérations importantes des modèles d’état cinétique de Markov et de conductance HH sont décrites dans la section Discussion. Les étapes ci-dessous décrivent la configuration d’un modèle de conductance de Markov dans un logiciel de pince dynamique.
  2. Créez ou obtenez un diagramme de transition d’état de Markov pour le modèle de conductance à utiliser dans les expériences de pince dynamique. Utilisez ce schéma pour assembler avec précision le modèle de conductance de Markov dans le logiciel de pince dynamique (décrit ci-dessous).
    REMARQUE : SutterPatch est le logiciel d’acquisition de données de l’amplificateur dPatch. Des expériences de pince dynamique peuvent être réalisées dans le logiciel, ce qui permet l’assemblage et l’application de conductances modélisées par injection de courant pendant les protocoles de pince de courant. La figure 1A présente un diagramme de transition d’état de Markov pour une conductance sodium voltage-dépendante modélisée, basé sur des mesures de courant Nav provenant de neurones Purkinje de souris. Ce modèle a été développé par Ransdell et al., 202230 et a été utilisé pour étudier le rôle des composants persistants et résurgents du courant sodique dans l’activation des neurones de Purkinje31. Les états de déclenchement (C, IC, IF, IS et O) sont interconnectés par des constantes de vitesse de transition, désignées par des variables (c’est-à-dire S0, S3, S1, S4). Ce modèle est utilisé dans les expériences de pince dynamique représentatives, et est disponible en téléchargement sur GitHub : https://github.com/morenomdphd/Resurgent_INa.
  3. Dans le logiciel d’acquisition de données, ouvrez la fenêtre Dynamic Clamp Editor à partir de l’onglet SutterPatch > Dynamic Clamp Editor ou en cliquant sur l’icône correspondante dans la fenêtre du tableau de bord . Des parties de la fenêtre de l’éditeur de pinces dynamiques sont illustrées à la Figure 1B.
    REMARQUE : La fenêtre Dynamic Clamp Editor contient tous les paramètres nécessaires pour appliquer la conductance modélisée lors d’un protocole d’enregistrement de pince de courant. L’interface du pool de conductance (Figure 1B, en haut à gauche) permet aux utilisateurs d’organiser et de charger simultanément des groupes de conductances de modèle.
  4. Dans l’interface Pool de conductance (Figure 1B, en haut à gauche), créez un pool en cliquant sur Nouveau et en le nommant comme vous le souhaitez. Une fois qu’un pool de conductance est sélectionné, à droite de la fenêtre de l’interface de sélection Headstage (Figure 1B, en bas à gauche), sélectionnez le type de modèle pour le pool de conductance respectif (Modèle - Markov, Hodgkin-Huxley, conductance variable, etc.) et le moment où la ou les conductances du modèle doivent être appliquées, par exemple pendant une routine/un protocole (mode actif). L’interface du sélecteur Headstage permet également de sélectionner la fréquence de mise à jour de la pince dynamique (en kHz) et la source de signal de tension (voir Figure 1B, à droite). Pour Source de signal de tension, sélectionnez le foulard qui enregistre le signal de tension.
  5. Dans le panneau de sélection Headstage , pour l’exemple de modèle de Markov de conductance Nav (Figure 1A), sélectionnez Modèle de Markov pour le modèle, Pendant les balayages pour le mode actif, 200 kHz pour la fréquence de mise à jour et Headstage 1 pour la source de signal de tension. Cochez les cases Appliquer et commander le signal à AuxOUT1 pour lancer les calculs du modèle en réponse au signal de tension et ajouter l’injection de courant de pince dynamique à n’importe quel protocole de pince de courant, respectivement (Figure 1B, en bas à gauche).
  6. Sous les panneaux principaux de l’éditeur de pinces dynamiques se trouve la matrice d’état (Figure 1C, en bas). Modifiez la matrice d’état en cliquant d’abord sur Modifier les paramètres du modèle dans l’interface de sélection Headstage (Figure 1B, en bas à gauche). Une nouvelle fenêtre apparaîtra à côté de l’éditeur appelé Paramètres du modèle de Markov de pince dynamique. Dans ce panneau, entrez les équations de la matrice d’état représentant la conductance du modèle de Markov.
  7. Dans le panneau Paramètres de canal (Figure 1B, en haut à droite), sélectionnez les modèles de conductance enregistrés à appliquer (en pince dynamique). Vous pouvez également sélectionner un canal vide et commencer à créer un nouveau modèle de conductance. Sur la droite de ce panneau, entrez l’inversion V (potentiel d’inversion des ions de conductance modélisée). Pour notre étude utilisant une conductance sodique, entrez 55,0 mV pour refléter le potentiel d’inversion du sodium basé sur l’ACSF et la solution interne patch-électrode.
  8. Toujours dans le panneau Paramètres de canal , indiquez le nombre d’états cinétiques de la conductance sélectionnée (voir Figure 1B, en haut à droite, encadré rouge). Ici, entrez 9 pour refléter les 9 états cinétiques de la conductance modélisée (voir Figure 1A).
  9. Sous le panneau Paramètres de canal se trouve le panneau Équations d’état . Placez les équations de la constante de vitesse de transition d’état de manière appropriée dans la matrice d’état de porte pour refléter l’arrangement topologique du modèle de Markov. Entrez les équations dans le panneau Equations d’état et fournissez un ID, commençant par « S0 » (Figure 1B, milieu).
    REMARQUE : L’ordre dans lequel ces équations sont saisies n’a pas d’importance, tant que ces variables sont correctement renseignées dans la matrice d’état de déclenchement pour refléter la topologie du modèle de Markov.
  10. Pour remplir la matrice d’état de contrôle avec les variables de constante de vitesse maintenant définies, cliquez sur Modifier la matrice d’état sur le côté droit du panneau Équations d’état (Figure 1B, au milieu). Chaque état cinétique reçoit un numéro, commençant à 0. Par exemple, pour un modèle à deux états cinétiques, contenant les états X et Y, ces états seront appelés « 0 » et « 1 » et comprendront deux constantes de vitesse de transition a1 et b1, où a1 passe de 0 à 1 et b1 passe de 1 à 0.
  11. Pour relier correctement ces équations à l’aide de l’éditeur de matrice d’état (Figure 1B, en bas), entrez les constantes de vitesse dans un tableau contenant des lignes et des colonnes numérotées, toutes deux commençant par 0 (voir l’exemple de la figure 1C).
    REMARQUE : Le mouvement d’un état à un autre est déterminé par leur position dans ce tableau sous la forme « ligne à colonne ». Par exemple, dans l’exemple du modèle à deux états de l’étape 2.1, la transition de l’état 0 à l’état 1 repose sur la constante de vitesse « a1 » qui est ensuite placée dans la ligne 0, colonne 1. La constante de vitesse de transition « b1 » entraîne les transitions de l’état 1 à l’état 0, et la constante de vitesse doit donc être placée dans la ligne 1, colonne 0. Dans la figure 1C, l’exemple de matrice d’état de déclenchement a des constantes de vitesse qui reflètent la topologie du modèle de conductance Nav illustré à la figure 1A. Par exemple, « S0 » est la constante de vitesse qui définit les transitions de l’état cinétique IC1 à l’état cinétique IC2 ; ainsi, « S0 » est placé dans la ligne 0, colonne 1 de la matrice d’état de porte (Figure 1C). Les équations de constante de vitesse de transition définissant la variable de chaque constante de vitesse remplissent ensuite une matrice d’état remplie (Figure 1C, ci-dessous).
  12. Lorsque les équations de constante de vitesse sont connectées via le panneau de l’éditeur de matrice d’état, les connexions (la ligne et la colonne correspondantes) remplissent le panneau Connexions à côté de l’équation (Figure 1B, au milieu à droite). Prenez note de l’état Ouvert/Conducteur dans le modèle représentatif de conductance sodique (Figure 1A), ajouté à la ligne et à la colonne 7 de la Figure 1C (en haut, encadrés rouges), ce qui est important pour l’étape suivante.
  13. Dans la figure 1B (en bas à droite), utilisez le panneau Équations de conductance (nS) pour définir l’amplitude de la conductance du modèle qui sera appliquée lors de la fixation dynamique. Sélectionnez les états ouvert/conducteur dans le modèle de Markov et fournissez une valeur de conductance (Figure 1B, encadré inférieur et rouge).
  14. Pour cette expérience, entrez « 400 nS » dans la case « G7 », qui ajoute des valeurs de courant de navigation de crête similaires aux courants de navigation de crête mesurés dans les études de pince de tension sur les neurones de Purkinje de souris.
  15. Une fois les étapes ci-dessus terminées, cliquez sur Charger pour préparer le modèle à l’application de la pince dynamique une fois qu’une routine de pince de courant est lancée.
  16. Utilisez un processus similaire pour organiser les modèles HH ; cependant, ajoutez des équations pour définir des états de déclenchement indépendants (dans les équations de porte) et une conductance sous G maximum.
  17. Pour appliquer la conductance de pince dynamique, créez d’abord une routine de pince de courant à l’aide de l’éditeur de routines (cliquez sur l’onglet SutterPatch > l’éditeur de routines) (Figure 1D). Pour créer une routine de restriction de courant, sélectionnez le canal de sortie parent (qui est StimOut1 dans cet exemple). Cela ouvrira un panneau qui permettra à l’utilisateur de définir la sortie de la commande actuelle pendant la routine. Assurez-vous que le mode d’enregistrement est défini sur CC_Mode dans l’éditeur de routines.
    REMARQUE : Dans les expériences représentatives, étant donné que ce protocole fonctionne avec des cellules à déclenchement spontané, une routine/protocole de pince de courant sans espace qui a une injection de courant nulle est utilisé.
  18. Dans les canaux d’entrée de l’éditeur de routine (Figure 1D, en haut à droite), définissez les signaux d’entrée qui, pendant les expériences, rempliront les fenêtres d’oscilloscope enregistrées. Ces entrées doivent inclure un signal de tension, ainsi que l’injection de courant de commande de la routine, ainsi que l’injection de courant de pince dynamique, appelées respectivement Current1 et AuxIN1 (Figure 1D, en bas à gauche).
  19. Pour les routines de pince de courant qui impliquent des commandes d’injection de courant positive et/ou négative, le signal d’injection de courant de la commande sera automatiquement combiné avec le signal de courant de pince dynamique. Créez une fenêtre d’oscilloscope virtuelle pour soustraire le signal de courant de commande afin qu’il existe un enregistrement de l’injection de courant de pince dynamique isolée. Pour créer la fenêtre d’étendue virtuelle, sélectionnez d’abord un canal d’entrée supplémentaire en cochant la case Virtual1.
  20. Dans l’éditeur de routines, sous Math Type, sélectionnez Équation et sélectionnez (sous Canal source) le signal d’entrée de commande de la routine current-clamp, qui dans cet exemple est Current1. Entrez une équation dans le champ ouvert pour soustraire le signal de commande de pince de courant du signal d’injection de courant de pince dynamique.
    REMARQUE : Pour cet exemple d’expérience, cela se fait avec l’équation t[3]-t[2]. La fenêtre de l’oscilloscope Virtual1 affiche désormais l’injection dynamique du courant de pince (isolée du signal de commande de courant). Les utilisateurs ont la possibilité de personnaliser les étiquettes des canaux d’entrée ou de sortie en double-cliquant sous Étiquette.

3. Acquisition d’enregistrements de pinces de courant à partir de neurones Purkinje de souris dans des tranches cérébelleuses parasagittales

  1. Équipez le banc d’électrophysiologie d’une chambre de coupe de tissu qui est (par gravité) perfusée avec de l’ACSF chauffé à une température proche de la température physiologique (34-36 °C). Placez soigneusement une tranche cérébelleuse parasagittale dans la chambre de la tranche et utilisez une harpe à tranches pour maintenir la tranche cérébelleuse dans une position immergée et fixe. Assurez-vous qu’une électrode de terre chlorée et une sonde de température sont également immergées et stables dans la chambre de coupe cérébelleuse.
  2. Localisez la couche de neurones de Purkinje à l’aide d’un objectif d’immersion 40x. Les neurones de Purkinje sont grands et en forme de larme. La membrane plasmique des cellules saines de Purkinje apparaît généralement lisse et le noyau n’est pas visible.
  3. Une fois qu’un neurone de Purkinje sain est identifié et ciblé pour l’enregistrement par patch-clamp, ajustez la lentille de l’objectif du microscope vers le haut. Positionnez et concentrez-vous sur l’extrémité d’une microélectrode en verre fixée à un porte-électrode et à la tête. Contrôlez la tête/microélectrode par un micromanipulateur robotique à 3 axes.
    REMARQUE : Pour ces expériences, assurez-vous que les microélectrodes ont des valeurs de résistance de 2 à 4 MΩ et sont remplies d’une solution interne appropriée à pince ampèremétrique. La solution interne utilisée dans les expériences représentatives contient : 144 mM de K-gluconate, 0,2 mM d’EGTA, 3 mM de MgCl2, 10 mM d’HEPES, 8 mM de NaCl, 4 mM de Mg-ATP et 0,5 mM de Na-GTP.
  4. Avant de vous approcher du neurone de Purkinje cible, ajoutez 2 à 3 ml de pression d’air positive dans l’orifice de pression du porte-électrode.
  5. Passez en mode VC sur le panneau de commande de l’amplificateur et appliquez les fonctions de compensation d’électrode et de décalage de tension d’électrode. Dans l’exemple ci-dessous, faites-le en cliquant sur Auto à côté des options de compensation d’électrode et de décalage de tension.
  6. Lancez un protocole de test d’étanchéité à membrane en continu (cliquez sur Test de membrane). Réglez les paramètres de test de membrane à des balayages de 5 ms (ou presque) avec un pas de 5 mV ou 10 mV. Réglez le potentiel de maintien (maintien en V) sur 0 mV.
  7. Déplacez la microélectrode vers la cellule cible, en ajustant le plan focal pour maintenir la mise au point au niveau ou légèrement en dessous de l’extrémité de l’électrode. Placez l’électrode légèrement au-dessus de la membrane plasmique de la cellule ciblée. Utilisez le micromanipulateur et la pression positive de la pointe de l’électrode pour repousser les débris extracellulaires du soma cellulaire cible, « nettoyant » ainsi la membrane de surface.
  8. Une fois que la cellule cible est débarrassée des débris extracellulaires, positionnez lentement l’électrode près de la surface de la membrane à l’extrémité large du soma du neurone de Purkinje, à partir duquel l’axone s’étend à partir du corps cellulaire. Lorsque la pointe de l’électrode est abaissée vers la membrane, une fossette deviendra probablement visible à la surface de la membrane (en raison de la pression positive de l’électrode). À ce stade, relâchez la pression positive et utilisez l’aspiration buccale pour appliquer une petite quantité de pression négative.
  9. Dans le panneau de commande de l’amplificateur , réglez le potentiel de maintien en V à -80 mV (au lieu de 0 mV). Surveillance du test d’étanchéité de la membrane, lorsque la résistance de la pipette atteint ≥ 1 GΩ, augmentez la pression négative et cliquez sur la fonction Zap sur le panneau de test d’étanchéité de la membrane pour rompre la membrane et obtenir une configuration patch-clamp à cellules entières.
  10. Utilisez un bref protocole de pince de tension pour mesurer les propriétés passives de la membrane (valeurs de capacité et de résistance d’entrée) avant de passer, via le panneau de commande de l’amplificateur, en mode de pince de courant.
  11. Après être passé en mode pince de courant, appliquez une compensation d’équilibre de pont à ≥ 70 %.
  12. Avant d’appliquer une conductance de pince dynamique avec une électrode patch, corrigez l’erreur de potentiel de jonction (qui est calculée en fonction de la composition de l’interne de l’électrode et des solutions ACSF). Pour les solutions des expériences représentatives, appliquez une correction de potentiel de jonction de 17,5 mV. Dans les études de pince dynamique, une correction précise du potentiel de jonction est essentielle pour qu’un signal de tension précis soit utilisé par le(s) modèle(s) de conductance pour calculer les injections de courant de pince dynamique.

4. Application de la conductance de serrage dynamique

  1. Parce que les neurones de Purkinje déclenchent spontanément des potentiels d’action répétitifs, enregistrent les propriétés de décharge avant d’ajouter (ou de soustraire) une conductance ionique modélisée pour tester la santé cellulaire et mesurer les propriétés de base de l’excitabilité membranaire. Appliquez la conductance modélisée en cliquant sur Charge dans la fenêtre des paramètres de serrage dynamique . Une petite étiquette DynC sera désormais visible sur le contrôleur dPatch, superposant CC (voir Figure 1D, encadrés rouges).
  2. Une fois que la pince dynamique est activée/chargée, la conductance de la pince dynamique est automatiquement appliquée lorsqu’une routine/un protocole de pince de courant est actif. Visualisez l’injection dynamique du courant de pince sur la fenêtre de l’oscilloscope correspondant au signal d’entrée sélectionné par l’AuxIN1 .
    REMARQUE : Il est important d’alterner les enregistrements de décharges spontanées avec et sans application de conductances dynamiques médiées par pince pour déterminer comment la conductance du modèle appliqué affecte l’excitabilité et pour déterminer si les niveaux de base d’excitabilité sont stables/cohérents tout au long de l’expérience.

Résultats

Dans les expériences présentées, nous appliquons, à l’aide d’une pince dynamique, une conductance sodium voltage-dépendante (Nav) modélisée à des neurones cérébelleux de Purkinje de souris adultes (âgés de 6 à 7 semaines) qui sont isolés de manière aiguë dans une préparation de coupe cérébelleuse parasagittale. Les études sont réalisées sur des souris de type sauvage (contrôle) et des souris transgéniques, chez lesquelles la recombinaison Cre-loxP est utilisée pour supprimer sélectivement la sclérose tubéreuse 1 (Tsc1) des neurones cérébelleux de Purkinje. La sclérose tubéreuse complexe (TSC) est une maladie multisystémique causée par des mutations de perte de fonction dans TSC1 ou TSC2 32,28,33. Les personnes atteintes de TSC sont souvent diagnostiquées avec des troubles de l’épilepsie, des troubles cognitifs et des troubles du spectre autistique34,35. Les souris présentant une délétion Tsc1 spécifique du neurone de Purkinje, appelées ici Tsc1 mut/mut, présentent plusieurs phénotypes comportementaux liés aux TSA, notamment des altérations de la fonction motrice, du comportement d’interaction sociale et des vocalisations, ainsi que des comportements répétitifs exagérés 9,36. Tsc1mut/mut Il a également été démontré que les neurones de Purkinje ont une décharge de potentiel d’action atténuée (Figure 2A, B), ce qui est lié à une réduction significative des amplitudes du courant Nav (Figure 2C) et de l’expression du canal Nav au niveau des segments initiaux axonaux des neurones de Purkinje Tsc1mut/mut 8. Les courants de navigation dans les neurones de PurkinjeTsc1 mut/mut ont des propriétés cinétiques et dépendantes de la tension similaires à celles des neurones de Purkinje de type sauvage8. Dans ce modèle de souris transgénique Tsc1mut/mut, nous avons utilisé une pince dynamique pour tester si l’ajout de la conductance Nav aux neurones de Purkinje Tsc1 mut/mut peut sauver les décharges répétitives. Nous testons ensuite si la soustraction de la conductance Nav dans les neurones de Purkinje de type sauvage provoque une atténuation similaire dans l’activation des neurones de Purkinje telle que mesurée dans les neurones de Purkinje Tsc1 mut/mut (Figure 2B). Pour soustraire la conductance Nav exprimée nativement, nous avons appliqué la conductance Nav à l’aide d’une pince dynamique ; Cependant, la polarité de la conductance est inversée.

Le modèle d’état cinétique de Markov (Figure 1A) utilisé pour simuler la conductance Nav du neurone de Purkinje contient neuf états cinétiques, dont huit sont non conducteurs, qui sont étiquetés comme fermés (C1, C2 et C3), inactivés-fermés (IC1 et IC2), inactivés rapidement (IF1 et IF2) et inactivés lentement (IS). Il y a un état cinétique ouvert/conducteur (O)30,31. Les constantes de vitesse de transition, indiquées entre les états cinétiques étiquetés (Figure 1A), déterminent la proportion de canaux/conductance simulés occupant chaque état cinétique. La tension de la membrane affecte chacune des constantes de vitesse du modèle. Les courants Nav simulés produits par ce modèle (in silico) dans les expériences simulées de pince de tension sont représentés (en rouge) à droite des courants Nav mesurés à partir de neurones de Purkinje isolés en phase aiguë, qui sont représentés en noir (Figure 1A, en bas). La tension-commande évoquant ces courants Nav simulés (rouge) et neurones de Purkinje (noir) est présentée au-dessus des traces de courant en noir. Notez que dans la commande de tension, une étape de dépolarisation initiale (jusqu’à 0 mV) aboutit à un courant sodium entrant transitoire rapide, qui, dans la trace simulée, réfléchit les canaux transitant des états fermés non conducteurs à l’état cinétique ouvert, permettant un bref courant entrant avant que les canaux ouverts ne s’accumulent dans les états cinétiques inactivés rapides (IF1 et IF2). Ce pas de tension de dépolarisation est bref (5 ms) et le potentiel de la membrane est ensuite échelonné jusqu’à une tension repolarisée intermédiaire de -45 mV, à laquelle le potentiel est maintenu pendant 80 ms (Figure 1A, ci-dessous). Au cours de cette étape de tension de repolarisation, il est à noter qu’il y a une résurgence du courant de sodium vers l’intérieur, une composante du courant appelée courant de sodium résurgent (INaR). Au cours de ce pas de 80 ms à -45 mV, l’INaR présente une lente décroissance (par rapport à l’INaT) en amplitude, atteignant finalement un état d’équilibre du courant entrant, qui est la composante persistante du courant Nav (INaP). L’activation de l’INaR modélisé (Figure 1A, inférieur, rouge) pendant la repolarisation membranaire reflète les canaux simulés qui se remettent des états cinétiques rapidement inactivés (IF1 + IF2) à l’état ouvert/conducteur. Au fil du temps (en se maintenant à -45 mV), une partie des canaux simulés occupant l’état ouvert s’accumule dans un état cinétique absorbant à inactivation lente (IS), qui est réfléchi par la décroissance INaR, et une partie de ces canaux reste dans l’état ouvert/conducteur, reflété par la composante de courant INaP à l’état stationnaire30,31.

Dans les expériences/résultats représentatifs, le modèle de conductance Nav Markov (Figure 1A) a été ajouté aux neurones de Purkinje adultes dans des coupes cérébelleuses fortement isolées. Une représentation caricaturale de ce dispositif expérimental est présentée à la figure 3A. Pour appliquer la conductance Nav modélisée par injection de courant de pince dynamique, nous avons utilisé le système d’amplification dPatch (illustré à la figure 3B), qui dispose d’une conversion analogique-numérique (A/D) et numérique-analogique (N/A) entièrement intégrée. Ce système gère également les transformations de signaux via des processeurs de base ARM intégrés (externes au PC) et dispose d’un circuit FPGA (field-programmable array) intégré qui permet un traitement quasi instantané des signaux d’entrée et de rétroaction (envoi de signaux de sortie) à l’électrode d’injection de courant27. Les expériences ici ont impliqué l’application (en pince dynamique) d’un modèle de conductance de Markov complexe, que nous avons pu appliquer avec des taux de mise à jour d’injection de courant allant jusqu’à 500 kHz.

L’ajout de la conductance Nav simulée (400 nS) aux neurones de Purkinje Tsc1mut/mut pendant les enregistrements de pince de courant sans espace a entraîné une nette augmentation des fréquences de décharge répétitives des cellules (Figure 3C1, D1), indiquant que l’ajout de la conductance Nav dans ces cellules peut être suffisant pour sauver les déficits de l’excitabilité des neurones de Purkinje Tsc1mut/mut, bien que nous n’ayons pas examiné le répertoire complet des déficits rapportés dans Tsc1mut/mut Excitabilité des neurones de Purkinje8. Comme le montrent les traces représentatives montrées dans la figure 3C2 (en haut), les neurones de Purkinje de type sauvage ont une capacité intrinsèque à déclencher des potentiels d’action répétitifs à des fréquences élevées. À l’aide de la pince dynamique, nous avons soustrait la conductance Nav modélisée des neurones de Purkinje de type sauvage en appliquant la conductance Nav modélisée avec une polarité inversée (négative) (-400 nS). La soustraction de la conductance Nav modélisée a entraîné une réduction immédiate et évidente des décharges répétitives (Figure 3C2, ci-dessous), ce qui est également cohérent avec l’hypothèse selon laquelle la réduction des courants Nav mesurée dans les neurones de Purkinje Tsc1 mut/mut contribue aux propriétés de décharge atténuées mesurées dans ces cellules8. Sur plusieurs neurones de Purkinje de type Tsc1mut/mut ou sauvage, ces expériences de clamp dynamique, dans lesquelles la conductance Nav a été ajoutée ou soustraite, respectivement, ont abouti à des effets cohérents sur la fréquence de tir. L’ajout de la conductance Nav de manière significative (P = 0,029) a augmenté la fréquence de décharge des neurones de Purkinje Tsc1 mut/mut (Figure 3D1), et dans les neurones de Purkinje de type sauvage, la soustraction de la conductance Nav a réduit de manière significative (P = 0,031) la fréquence de décharge (Figure 3D2) (test t apparié de Student).

figure-results-1
Figure 1 : Configuration d’un modèle de Markov dans un logiciel de pince dynamique. (A) Un diagramme de transition d’état de Markov est montré pour un modèle qui reproduit les propriétés de conductance Nav mesurées dans les neurones cérébelleux de Purkinjede souris 30. Ce modèle comprend neuf états cinétiques. Parmi ceux-ci, 8 sont des états non conducteurs : trois fermés (C), deux inactivés-fermés (IC), deux inactivés rapidement (IF) et un inactivé lentement (IS). Le modèle comprend un état cinétique ouvert (O), qui est conducteur. Entre les états cinétiques adjacents, la transition des connexions/occupation d’état au fil du temps est définie par des constantes de vitesse de transition, indiquées par S0-S15. Notez que chaque état cinétique se voit également attribuer une valeur numérique (rouge), ce qui permet aux utilisateurs de définir le modèle de Markov et sa topologie d’état cinétique dans une matrice d’état de déclenchement (illustrée dans le panneau C, décrit ci-dessous). (B) Les panneaux/interfaces graphiques avec lesquels les utilisateurs travaillent dans l’éditeur de pinces dynamiques SutterPatch sont présentés. Notez que la disposition de ces panneaux de l’éditeur de pinces dynamiques n’est pas cohérente avec la disposition telle qu’elle apparaît dans le logiciel de pince dynamique. De plus, tous les panneaux associés à l’éditeur de pinces dynamiques ne sont pas affichés. (C) (panneau supérieur) Un exemple de matrice d’état de contrôle est présenté avec des variables saisies qui correspondent à la topologie du diagramme de transition d’état illustré dans le panneau A. Des cases rouges sur la matrice d’état de contrôle mettent en évidence la ligne et la colonne 7, qui correspondent à l’état cinétique ouvert (O) du modèle. Dans la colonne 7, toutes les constantes de vitesse qui définissent les transitions vers l’état cinétique ouvert (O) sont répertoriées, et dans la ligne 7, toutes les constantes de vitesse qui définissent les transitions qui sortent de l’état cinétique ouvert (O) sont répertoriées. Avec cette organisation, la matrice d’états de déclenchement décrit le nombre d’états cinétiques, les variables de constante de vitesse et la topologie (interconnexions entre les états cinétiques) du modèle. La partie (D) présente les panneaux/interfaces utilisateur SutterPatch associés au chargement des modèles de conductance de pince dynamique, ainsi que les interfaces impliquées dans la création de routines de pince de courant. Les interactions de l’utilisateur avec ces modèles sont décrites dans les étapes de protocole 2.17 à 2.20. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Les neurones de Purkinje Tsc1mut/mut ont une excitabilité membranaire atténuée par rapport aux témoins de type sauvage. (A) Les enregistrements de pince de courant de cellules entières des neurones de Purkinje de type sauvage (supérieur, noir) et Tsc1mut/mut (inférieur, bleu) révèlent une décharge atténuée dans la cellule mutante Tsc1. (B) La réduction des fréquences de décharge dans les neurones de Purkinje Tsc1 mut/mut, par rapport aux témoins de type sauvage, est cohérente dans toutes les cellules. La fréquence moyenne (±± SEM) des neurones de PurkinjeTsc1 mut/mutest significativement (P < 0,0001) plus faible que celle des cellules de type sauvage (test t non apparié de Welch ; contrôle N = 13, n = 32 ; Tsc1mut/mut N = 6, n = 21). (C) Des mesures par pince de tension des courants Nav dans les neurones de Purkinje adultes révèlent que le pic moyen (±± SEM) du courant Nav transitoire rapide (INaT) est significativement réduit dans les cellules Tsc1 mut/mut, par rapport aux contrôles de type sauvage. (P = 0,007, RM ANOVA à deux facteurs ; contrôle de type sauvage : N = 6, n = 22, noir ; Tsc1mut/mut : N = 6, n = 16, carrés bleus). Exemple : Les enregistrementsNaT I, évoqués par une étape de dépolarisation de -35 mV, sont représentés sous la forme d’un panneau encart à droite du panneau C. Données publiées précédemment dans Brown et al.8. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : Utilisation de la pince dynamique pour déterminer les effets d’une conductance ionique sur l’excitabilité des neurones de Purkinje. La pince dynamique consiste à échantillonner la tension de la membrane (via une électrode d’enregistrement) et à calculer, sur la base de la tension échantillonnée, la sortie de courant d’une conductance modèle. Le courant calculé est ensuite appliqué à une cellule biologique à l’aide d’une électrode d’injection de courant. Le panneau (A) représente cet arrangement expérimental. Si l’échantillonnage de tension est effectué à une fréquence suffisante et qu’il y a un délai minimal (latence) entre l’échantillonnage de tension et l’application du courant calculé, cette technique peut être utilisée pour évaluer comment l’ajout ou la soustraction d’une conductance modélisée affecte l’activation neuronale et l’excitabilité membranaire. (B) Dans des expériences représentatives, des enregistrements de pinces dynamiques ont été acquis à l’aide du logiciel SutterPatch et du système d’amplification dPatch. dPatch est un amplificateur à pinces de patch doté de processeurs de signaux externes et d’un numériseur entièrement intégré, ce qui le rend bien adapté aux enregistrements de pinces dynamiques (voir Discussion). (C) Enregistrements représentatifs de la pince de courant de l’activation spontanée des neurones de Purkinje, avant et après l’utilisation de la pince dynamique pour ajouter ou soustraire 400 nS de la conductance Nav modélisée (présentée dans la figure 1A). En C1 (à gauche), les enregistrements proviennent d’un neurone de Purkinje Tsc1 mut/mut avec une décharge atténuée. L’ajout d’une conductance Nav de 400 nS entraîne une nette augmentation de la fréquence de décharge de cette cellule. Alternativement, en C2, les enregistrements proviennent d’un neurone de Purkinje de type sauvage. Dans cette expérience, la conductance Nav modélisée est appliquée avec une polarité inversée (-400 nS), ce qui entraîne une soustraction de la conductance Nav et une nette réduction de la fréquence de décharge répétitive. Les enregistrements d’injection de courant de pince dynamique, illustrés en gris, sont présentés sous les enregistrements de potentiel d’action (tension), indiqués en noir. (D) Les résultats de ces expériences de clamp dynamique, présentés comme les changements de fréquence de décharge spontanée après l’ajout de la conductance Nav aux neurones de Purkinje Tsc1mut/mut (D1, n = 3) ou la soustraction de la conductance Nav des neurones de Purkinje de type sauvage (D2, n = 3), révèlent des effets cohérents et significatifs de l’ajout ou de la soustraction de cette conductance sur Tsc1mut/mut (P = 0,029) et le type sauvage (P = 0,031), respectivement (test t de Student apparié). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Les circuits cérébelleux fonctionnent dans la proprioception et le contrôle moteur37,38, mais sont également essentiels pour des comportements complexes tels que les interactions sociales et le traitement émotionnel 39,40,41. La pathologie de la structure et de la fonction cérébelleuses est souvent liée aux TSA 42,43,44,45,46. L’architecture simple des circuits cérébelleux47 et le rôle évident du cervelet dans la pathologie des TSA en font une région du cerveau attrayante pour étudier les facteurs moléculaires et cellulaires des déficits comportementaux des TSA, ainsi que les thérapies potentielles. L’électrophysiologie à pince dynamique offre un outil important pour ces investigations, permettant aux chercheurs de tester directement les relations causales entre les changements liés aux TSA dans les propriétés des canaux ioniques/conductances ioniques et l’activation des neurones cérébelleux. Bien que les méthodes de clamp dynamique soient particulièrement adaptées à l’étude des modifications de l’excitabilité neuronale liées aux TSA, cette technique est pertinente pour l’étude d’une gamme de mécanismes pathologiques qui affectent les cellules avec des membranes excitables. De plus, la pince dynamique reste un excellent outil pour disséquer les processus complexes par lesquels les neurones et les cellules musculaires régulent et maintiennent une action potentielle de décharge appropriée.

L’exécution précise des expériences de pince dynamique nécessite un contrôle minutieux des paramètres techniques. Plus précisément, les expérimentateurs doivent connaître et comprendre les conséquences de la variabilité potentielle du délai entre l’échantillonnage de tension et l’injection de courant, souvent appelé gigue29, ainsi que les propriétés passives des électrodes, les limites de la pince spatiale et la fidélité physiologique de la préparation expérimentale étudiée. Bettencourt et al. (2008)48 et Butera et al. (2001)29 ont précédemment montré qu’il est essentiel d’atteindre des taux d’échantillonnage élevés d’au moins 50 kHz pour capturer avec précision les conductances ioniques rapides, avec des latences de rétroaction idéalement maintenues en dessous de 25 % (≤ 5 μs) de l’intervalle d’échantillonnage. Les taux d’échantillonnage nominaux rapportés par les systèmes commerciaux, en particulier les plates-formes basées sur Windows, peuvent être trompeurs ; par conséquent, une vérification indépendante des performances est souvent nécessaire, ce qui est discuté plus en détail par Milescu et al. (2008)25 et Clausen et al. (2012)49. Les contraintes de pince d’espace doivent également être prises en compte, en particulier lorsque l’on travaille avec des neurones intacts qui ont des morphologies complexes et des propriétés membranaires non isopotentielles. Par exemple, tenter d’appliquer (ou de soustraire) une conductance avec une électrode distale au site d’intégration, comme l’AIS, donnera une représentation inexacte des effets de la conductance appliquée. Une faible résistance (élevée) de l’électrode, une compensation de capacité inadéquate et/ou l’incapacité à corriger l’erreur de potentiel de jonction peuvent également entraîner une fausse représentation des mesures de tension (signal d’entrée) et, par conséquent, une application incorrecte des conductances ioniques modélisées50,51.

Des milliers de modèles de Markov et de HH sont mis gratuitement à la disposition des chercheurs dans des bases de données en ligne telles que ModelDB52 et Channelpedia53, soutenues respectivement par le Human Brain Project et le Laboratory of Neural Microcircuitry. Ces bases de données comprennent des modèles de conductances synaptiques, de conductances de canaux ioniques et de modèles de neurones basés sur la conductance, qui sont principalement écrits en NEURON, MATLAB ou Python. Les fichiers de base de données fournissent généralement les équations du modèle nécessaires ainsi que toute information diverse sur le(s) type(s) de cellule (s) et les expériences qui ont éclairé le modèle.

Les modèles de conductance de Markov et HH contiennent des états/variables de déclenchement conducteurs (simulant les canaux ouverts/activés) et non conducteurs (canaux simulés fermés). Cependant, ces types de modèles diffèrent dans la manière dont la valeur de conductance est calculée à chaque tension échantillonnée, les modèles de Markov nécessitant plus de puissance de calcul mais fournissant plus de détails dans les propriétés de déclenchement des canaux simulés. Par exemple, dans les modèles HH, les états conducteur et non conducteur sont des variables indépendantes, chacune déterminée par la cinétique d’entrée de tension et de déclenchement de l’état respectif54,55. Contrairement aux modèles de Markov, les modèles HH ne simulent pas ou ne contraignent pas les transitions entre les états de déclenchement, tels que le passage de canaux simulés de l’état cinétique activé/ouvert directement à l’état cinétique rapidement inactivé dans un modèle de conductance sodium voltage-dépendante25. Cela rend les modèles HH moins complexes en termes de calcul54,55 et permet aux chercheurs d’ajouter simultanément plusieurs modèles HH à conductance rapide, tout en maintenant des taux d’échantillonnage et de mise à jour élevés.

Les modèles d’états cinétiques de Markov sont composés d’états cinétiques discrets, qui peuvent être conducteurs ou non conducteurs, et ces états sont interconnectés dans une topologie fixe. Dans les simulations de modèles de Markov, la conductance est calculée à chaque tension échantillonnée par la proportion de voies simulées occupant le ou les états cinétiques conducteurs. La proportion de canaux simulés occupant chaque état cinétique (au fil du temps) est déterminée par des constantes de vitesse, qui sont des paramètres qui régissent la vitesse à laquelle l’occupation de l’état passe d’un état cinétique à un autre. Les constantes de vitesse ont des unités de secondes inverses (s-1), représentant une probabilité de transition par unité de temps. Selon le modèle, les valeurs de la constante de vitesse peuvent dépendre de facteurs dynamiques tels que la tension ou la température.

Dans les modèles de Markov, des équations différentielles ordinaires sont utilisées pour décrire l’occupation dépendante du temps de chaque état cinétique. Ces équations régissent l’évolution de la probabilité d’être dans chaque état au fil du temps, en fonction des constantes de vitesse de transition. Ceci est représenté par une matrice de taux Q : figure-discussion-156. Comme nous l’avons vu ci-dessus, les constantes de vitesse de transition (r), qui déterminent le mouvement entre les états, peuvent être influencées par la tension d’entrée (V) et les paramètres α et β, qui reflètent la cinétique de la conductance entre les tensions. Ces équations peuvent être décrites comme suit : figure-discussion-2, et peuvent être représentées visuellement sous la forme de graphiques qui incluent des connexions (constantes de vitesse de transition) dans et hors de chaque état cinétique du modèle 56,57,58. Une discussion utile sur le développement des modèles de Markov et leur topologie peut être trouvée dans Schoening et Silva (2024)56.

Depuis la création de la pince dynamique dans sa forme actuelle, dans laquelle des conductances ioniques non linéaires sont modélisées et appliquées (via une électrode d’injection de courant) à des cellules vivantes en temps réel19,59, les méthodes et les ressources de cette technique ont évolué et sont de plus en plus accessibles et rentables en raison d’innovations telles que les systèmes à faible coût basés sur des microcontrôleurs60 et les logiciels libres et open source23, 25,26. Les systèmes commerciaux, tels que le dPatch de Sutter Instrument ou le Cybercyte de Cytocybernetics, facilitent encore la mise en œuvre rapide d’expériences de pinces dynamiques grâce à des solutions matérielles et logicielles intégrées27,61.

La polyvalence de la pince dynamique permet diverses applications, notamment la création de synapses chimiques et électriques virtuelles, l’intégration de neurones réels dans des réseaux artificiels (ou vice-versa) et l’ajout de canaux ioniques virtuels62. Il est important de noter que la dépendance à la tension, les propriétés cinétiques et les amplitudes d’une conductance appliquée peuvent être rapidement ajustées, ce qui permet aux chercheurs de tester directement comment la mise à l’échelle d’un ou plusieurs paramètres affecte le déclenchement du potentiel d’action et l’excitabilité membranaire31. Les systèmes d’aujourd’hui offrent des taux d’échantillonnage élevés, permettant l’application précise de conductances transitoires rapides et peuvent être facilement intégrés à des équipements électrophysiologiques conventionnels60,63, solidifiant la pince dynamique comme une méthode idéale pour faire progresser notre compréhension de la fonction et du dysfonctionnement neuronaux.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous tenons à remercier Telly Galiatsatos et Josh Stanford de Sutter Instrument pour leur aide dans les enquêtes techniques. Nous remercions également Jan Dolzer pour son aide dans le lancement des études de pince dynamique dPatch.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
CaCl2Fisher ChemicalC79-500  ;Réactif
Tubulure capillaire en verre boroscillant mur standard diamètre 1,5 mm diamètre 0,86 mm longueur 10 cmWarner Instruments64-0793Équipement
CleanBenchTMC63-9090EÉquipement
Compresstome VF-500-Z vibratome  ;Instruments préscissionnaireshttps://precisionary.com/product-category/compresstome-parts/parts-by-model/vf-500-0z/Équipement
Dell OptiPlex 7080Vallonhttps://www.dell.com/en-us/shop/desktop-computers/optiplex-7080-tower-and-small-form-factor/spd/optiplex-7080-desktop/s005o7080sffusÉquipement
DextroseFisher ChemicalD16-500  ;Réactif
Système dAmplifier dPatchSutter InstrumentFG-DPATCHÉquipement
EGTAEMD Millipore324626-25GMRéactif
HEPESFisher Chemical7365-45-9Réactif
Chauffage en ligneWarner Instruments64-0102Équipement
KclFisher ChemicalP330-500  ;Réactif
KétamineProduits vétérinaires Dechra193.40620.3  ;Réactif
K-gluconateTCI ChemicalsG0040Réactif
Logiciel LinLabScientificahttps://www.scientifica.uk.com/products/scientifica-linlab-2Équipement
Bain-Marie LSE 6LCorning6783Équipement
Mg-ATPSigma-Aldrich74804-12-9Réactif
MgCl2Fisher Chemical012288.A9Réactif
Tire-pipette modèle P-1000Sutter InstrumentFG-P1000Équipement
NaClFisher ChemicalS271-500  ;Réactif
Na-GTPMP Biomédicals56001-37-7Réactif
NaH2PO4J.T. Baker02-004-220  ;Réactif
NaHCO3Fisher ChemicalS233-500  ;Réactif
Logiciel oculaireDigital Optics Limitedhttps://www.scientifica.uk.com/products/qimaging-ocular-softwareÉquipement
LamePersonna60-0139-CTNÉquipement
Harpe tranchanteWarner Instruments64-0255Équipement
SliceScope Pro 3000Scientificahttps://www.scientifica.uk.com/products/slicescope-pro-3000Équipement
SuperglueLoctite8040-00-142-9193Équipement
Logiciel SutterPatchSutter Instrumenthttps://www.sutter.com/amplifiers/sutterpatchÉquipement
Régulateur de températureWarner Instruments64-2400Équipement
XylazineMP Biomédicals158307Réactif

Références

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