Article de méthode

Préparation et traitement des artères calcifiées avec morphologie et ARN préservés pour le profilage spatial numérique

DOI :

10.3791/69159

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23 janvier 2026

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1Division of Vascular Surgery, Department of Surgery, University of Washington, 2Department of Laboratory Medicine and Pathology, University of Washington, 3Division of Vascular Surgery, VA Puget Sound Health Care System

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Ce protocole inclut un flux de travail étape par étape pour les échantillons vasculaires calcifiés : manipulation tissulaire, décalcification, validation de l’ARN, détection des niveaux de calcification et stratégies de sélection des régions d’intérêt sur le Nanostring GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP). L’objectif est de présenter une méthode complète pour préserver la morphologie des tissus vasculaires et l’ARN afin d’une analyse transcriptomique spatiale fiable.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La transcriptomique spatiale cartographie directement les profils du transcriptome entier sur les sections tissulaires, corréléant entre les voisinages cellulaires et l’expression génique, et comment ces activités influencent la santé et la maladie. Bien que cette approche ait transformé l’oncologie, les neurosciences, l’immunologie, les sciences du développement et de nombreux domaines, elle a été moins largement utilisée en biologie vasculaire, même si la maladie vasculaire reste une cause majeure de décès dans le monde. Deux obstacles se distinguent : les artères et veines offrent peu de surface plane pour la coupe, et les spécimens malades, souvent athéroscléroses, thrombosés, chargés de plaques ou calcifiés, nécessitent des traitements rigoureux tels que la décalcification qui mettent en péril la morphologie et l’intégrité de l’ARN. Pourtant, ces mêmes vaisseaux, avec leurs íntimes concentriques, leurs milieux et leurs structures en couches adventities, sont idéaux pour l’analyse spatiale car chaque couche héberge des types cellulaires distincts et des programmes géniques qui interagissent à travers la paroi.

Peu de protocoles détaillés abordent la préparation des tissus vasculaires pour la transcriptomique spatiale. Cette pénurie limite la capacité des chercheurs à exploiter tout le potentiel de la technique. Pour combler cette lacune, nous présentons un flux de travail étape par étape optimisé pour les artères tibiales humaines présentant des lésions avancées. Le protocole couvre la manipulation, la fixation et la décalcification appropriée des tissus, qui préservent la structure et la qualité de l’ARN, suivies d’une coloration histologique jusqu’à la sévérité de la calcification. Nous décrivons également la construction de microréseaux tissulaires (TMA) pour limiter les effets de batch et les stratégies de sélection des régions d’intérêt (ROI) sur le NanoString GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP).

En abaissant les barrières techniques, ce protocole permet aux chercheurs vasculaires de générer des données transcriptomiques spatiales fiables et d’étudier les activités transcriptionnelles spécifiques à chaque couche dans des vaisseaux sains et malades. Nous anticipons qu’elle accélérera la découverte des mécanismes sous-jacents à la calcification, à l’inflammation, à l’athérosclérose intime et à d’autres pathologies vasculaires, tout en favorisant une adoption plus large de la transcriptomique spatiale en biologie vasculaire.

Introduction

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Au cours de la dernière décennie, le séquençage de nouvelle génération et l’imagerie haute résolution ont convergé pour faire progresser la transcriptomique spatiale, une méthode de quantification du transcriptome complet tout en préservant la position précise de chaque transcripte dans les sectionstissulaires 1,2. Associées au domaine de séquençage à ARN unicellulaire (scRNA-seq) à maturation rapide, les approches spatiales offrent une voie efficace pour relier les signatures géniques à des types cellulaires spécifiques, états et niches au sein d’un tissu ou d’un organe, enrichissant grandement notre compréhension des mécanismes de lamaladie 3,4,5,6,7 . Plusieurs plateformes commerciales sont en cours de développement, telles que 10X Visium, NanoString GeoMx et CosMx, Slide-seq et DBiT-seq, chacune supportée par des protocoles optimisés pour les tissus mous et très cellulaires tels que les tumeurs et le tissu cérébral. Le domaine connaît une croissance explosive, avec PubMed indexant environ 150 publications en 2023, près de 300 en 2024, et en voie de dépasser les 500 en 2025. Malgré cette montée, la biologie vasculaire reste sous-représentée par rapport au cancer, aux neurosciences et à l’immunologie.

Les tissus durs ou minéralisés, tels que l’os, le cartilage, les dents et les artères ou veines calcifiées et chargées de plaques, se sont révélés bien moins accommodants. Les obstacles techniques sont multiples. Premièrement, les tissus avec des matrices minérales denses nécessitent de la chélation ou un retrait acide, des traitements agressifs qui peuvent fragmenter l’ARN et déformer la morphologie tissulaire. Deuxièmement, les tissus malades, qu’ils soient blessés ou fibrostiques, contiennent souvent peu de cellules vivantes intégrées dans une matrice extracellulaire abondante (ECM), réduisant le rendement des transcrits et compliquant la normalisation des données. De plus, les tissus vasculaires possèdent une fine architecture concentrique (intima, media, adventitia) enroulée autour d’une lumière creuse. L’épaisseur limitée de la paroi, en particulier l’intima unicellulaire, fait que les zones de capture peuvent contenir des tissus rares, et que les sections peuvent se déchirer ou se détacher lors d’étapes de coloration et d’hybridation de plusieurs heures. En conséquence, les études transcriptomiques spatiales sur le tissu vasculaire restent rares, même si les maladies cardiovasculaires figurent systématiquement parmi les principales causes de décès et de morbidité grave dans le monde. Les articles sur les protocoles existants mettent l’accent majoritairement sur le traitement des données, la visualisation ou les plateformes autres que NanoStringGeoMx 8,9,10,11,12,13. Parmi ces articles, peu décrivent des méthodes de laboratoire pour traiter les artères tibiales malades, un vaisseau cliniquement pertinent dans la maladie artérielle périphérique (MAP), en particulier chez les patients diabétiques qui représentent une proportion croissante de la population affectée.

Pour combler cette lacune, nous présentons un flux de travail complet pour les artères tibiales humaines calcifiées obtenues chez des patients atteints de PAD ayant subi une amputation. Le protocole couvre : (1) la coupe et la dissection des tissus immédiatement après la prélèvement en salle d’opération ; (2) fixation tissulaire appropriée et décalcification qui maintiennent l’intégrité de la morphologie tissulaire et de l’ARN ; (3) la construction de microréseaux tissulaires (TMA) économiques afin de minimiser les effets des lots ; (4) hybridation in situ par ARNoscopique et coloration histologique du calcium pour le contrôle qualité ; et (5) Stratégie de sélection des régions d’intérêt (ROI) spécifiquement conçue pour les artères tibiales calcifiées sur la plateforme GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP). Ces étapes incluent toutes les procédures préalables à la collecte d’échantillons sur l’instrument DSP, la préparation de la bibliothèque, le séquençage et l’analyse des données.

Bien que démontrés sur la plateforme DSP référencée, les principes peuvent guider la préparation des tissus pour le 10X Visium ou d’autres plateformes, et la méthodologie est facilement adaptable à des lits vasculaires supplémentaires ou à des modèles animaux. Ce protocole peut être adapté aux tissus de biobanque et post-mortem, mais son succès dépend de manière cruciale des conditions de préservation, de fixation et de stockage des tissus. Les tissus doivent être fixés immédiatement après la récolte afin de minimiser le temps ischémique (idéalement dans la 1h). La formaline standard à 10 % de neutre tamponné (NBF) est recommandée pendant au moins 16 heures à température ambiante (RT). Les tissus doivent être intégrés rapidement après la fixation et ne doivent pas être conservés dans l’éthanol plus de 3 jours. Les blocs de paraffine fixée au formol (FFPE) traités et stockés dans des conditions recommandées restent adaptés au profilage spatial pendant environ 3 ans, bien que la qualité de l’ARN diminue avec l’âge du bloc. En conséquence, une évaluation de la qualité de l’ARN est recommandée pour les échantillons à faible cellulité, les blocs stockés sur 6 mois, les échantillons de biobanque et les tissus post-mortem. La qualité minimale acceptable de l’ARN dépend du test sélectionné, du choix du ROI, de la résolution souhaitée et des recommandations de l’installation principale. En pratique, environ 50 à 100 noyaux par segment sont couramment recommandés pour des résultats robustes. La plateforme DSP prend en charge à la fois le FFPE et les tissus frais congelés. Dans ce protocole, nous nous concentrons sur les tissus FFPE.

Bien que cette étude se concentre sur la transcriptomique spatiale, elle s’intègre facilement avec l’scRNA-seq. À l’aide de jeux de données scRNA-seq publiés et de la déconvolution spatiale computationnelle, les proportions de type cellulaire peuvent être estimées pour chaque tache spatiale, et les états cellulaires définis par scRNA-seq peuvent être projetés sur l’architecture tissulaire. En maintenant à la fois la structure et l’intégrité de l’ARN, notre protocole permet une validation en aval de cellules uniques ou de molécule unique, maximisant ainsi les connaissances biologiques issues de précieux échantillons vasculaires et une adoption plus large de la transcriptomique spatiale dans la recherche en biologie vasculaire.

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Protocole

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Toutes les procédures de collecte des spécimens artériels humains ont été approuvées par le Conseil d’examen institutionnel (IRB) de la Division des sujets humains de l’Université de Washington et par l’IRB du système de soins de santé VA Puget Sound (Seattle, WA). Des consentements écrits éclairés ont été obtenus des patients avant la collecte des tissus. Les matériaux et équipements utilisés pour cette étude sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Coupe et fixation des tissus

  1. Coupe de tissus
    1. Préparez le sac de transport à l’aide d’un emballage multicouches, contenant une chambre à air, un conteneur secondaire, une boîte d’expédition extérieure et un sac à échantillons de bio-danger. Remplissez le tube intérieur de centrifugeuse de 50 mL avec 30 mL de milieux de stockage du milieu modifié Dulbecco’s Eagle’s Medium (DMEM) contenant 1 % d’acide 4-[2-hydroxyéthyle]-1-piperazine-éthanasyllésultonique (HEPES) et 1 % de pénicilline-streptomycine (P/S).
    2. Placez séparément les artères tibiale antérieure (AT), tibiale postérieure (PT) et péronière tibiale (PR) (idéalement > 5 cm de long) dans les tubes centrifuges de 50 mL. Transférez les bonbonnes sur glace de la salle d’opération à la salle de culture tissulaire.
      REMARQUE : Il est recommandé que la longueur de l’échantillon prélevé soit d’au moins 5 cm afin de permettre des réplications et un tissu suffisant pour être cryostocké en vue d’autres évaluations ou validations.
    3. Transférez chaque artère dans une boîte de Petri de 100 mm avec le milieu. Retirez l’excès de tissus conjonctifs périvasculaires à l’aide de ciseaux stériles et de pinces, ne laissant que la paroi artérielle (adventitie vers l’intérieur).
      REMARQUE : Manipuler et couper les tissus dans un cabinet de biosécurité essuyé avec une solution d’inactivation de RNase afin d’éviter la contamination par ARN. Utilisez des scalpels et des pinces stériles ; Entre les échantillons, rincez-les dans de l’eau stérile et sans nucléase pour éliminer les résidus et essuyez soigneusement avec 70 % d’éthanol.
    4. Rincez brièvement l’artère taillée avec du sérum phosphaté tamponné (PBS) de Dulbecco dans une nouvelle boîte de Petri. Placez une planche à découper stérile dans un plat frais et déplacez l’artère dessus.
    5. Coupez l’artère en section transversale en segments de 1 cm à l’aide d’une lame chirurgicale.
  2. Fixation et stockage des tissus
    1. Congeler instantanément deux segments dans des cryotubes pour la cryoconservation dans de l’azote liquide (LN2) et les stocker pour de futurs travaux sur les protéines/ARN.
    2. Placez les segments restants dans des tubes de 15 mL contenant 10 % de NBF et fixez à 4 °C pendant 24 à 48 heures pour les segments artériels de 1 cm.
      REMARQUE : L’utilisation de 10 % de NBF est recommandée. Si vous utilisez du paraformoldéhyde (PFA) à 4 %, préparez-le fraîchement ou vérifiez un pH neutre avant l’utilisation afin de minimiser les dommages à l’ARN.

2. Décalcification, traitement des tissus et coupe

  1. Préparez la solution de décalcification : dissoudez l’acide éthylène et diamine-tétraacétique (EDTA) à 10 % (p/v) dans une solution de stabilisation ARN (RSS). La filtration n’est pas requise. Ajustez le pH à 9,2 avec des granulés d’hydroxyde de sodium (NaOH) pour dissoudre complètement l’EDTA, puis baissez à 5,2 avec 10 M HCl, qui est le pH de travail typique du RSS et aide à préserver l’intégrité de l’ARN.
  2. Rincez brièvement les mouchoirs fixés dans PBS manuellement. Transférez chaque échantillon dans un tube de 15 mL contenant la solution de décalcification et agitez à 4 °C pendant 72 heures.
  3. Lorsque la décalcification est terminée, lavez les échantillons dans du PBS (2 × 5 min). Placez les tissus dans des cassettes et chargez-les dans un processeur de tissus à l’aide d’un programme de traitement de 4 heures.
  4. Insérez plusieurs segments d’artère par bloc tissulaire. Marquez la zone tissulaire restreinte sur le dos des lames et vérifiez que toutes les sections se trouvent dans cette zone.
  5. Taillez l’excès de paraffine. Coupez les blocs à 5 μm avec un microtome et des lames à profil bas, puis montez les sections tissulaires dans la zone de lame marquée.
    REMARQUE : Jetez les premières sections après avoir fait face et collectez les sections de tissu suivantes. Utilisez des brosses sans RNase et nettoyez le bain-marie entre les fournés.
  6. Préparez au moins quatre sections sérielles par bloc pour différentes colorations et l’expérience de profilage spatial numérique (DSP). Conservez les lames à 4 °C jusqu’à l’utilisation (idéalement < 6 mois).

3. ARNscope Hybridation in situ (ISH) et coloration histologique

  1. ARNAscope ISH
    1. Cuire les lames dans un four sec à 60 °C toute la nuit pour améliorer l’adhérence des tissus aux lames.
    2. Déparaffinisation : immergez des lames dans du xylène (3 × 5 min), suivies d’un traitement à 100 % d’éthanol (2 × 3 min). Des lames sèches à 60 °C pendant 7 minutes.
    3. Effectuer le test RNAscope 2,5 HD Red ISH selon le protocole du fabricant. Bloquez la peroxydase endogène avec 3 %d’H2O2 pendant 10 minutes à RT ; Rincez dans de l’eau distillée (DI).
    4. Incubez les lames dans un tampon de récupération préchauffé à 100 °C (dilué 1:10 dans de l’eau DI) pendant 15 minutes (utilisez 200 mL de tampon de récupération pour un rack allant jusqu’à 24 lames dans un défroisseur), plongez dans 100 % d’éthanol 5 fois, puis séchez les lames à 60 °C pendant 7 minutes. Créez une barrière hydrophobe pour les solutions autour du tissu à l’aide d’un stylo PAP hydrophobe.
    5. Placez les lames dans une grille de four hybride, ajoutez 200 μL de supplément enzymatique digestif (prédilué par le vendeur dans des flacons à compte-gouttes) à chaque lame, puis incubez à 40 °C pendant 15 minutes. Rincez les lames deux fois dans de l’eau DI.
    6. Appliquez la sonde témoin positive Human Ppib sur les lames et faites éclore pendant 2 heures à 40 °C. Lavez les lames deux fois dans le tampon de lavage.
    7. Effectuer une amplification séquentielle : AMP1 à 40 °C pendant 30 minutes ; AMP2 à 40 °C pendant 15 minutes ; AMP3 à 40 °C pendant 30 minutes ; AMP4 à 40 °C pendant 15 minutes ; AMP5 à RT pendant 30 minutes ; et AMP6 en RT pendant 15 minutes. Laver pendant 2 x 2 minutes entre les deux.
    8. Ajouter une solution Fast Red active, incuber à RT pendant 10 minutes. Égouttez, plongez les lames dans de l’eau DI, puis trempez 5 fois dans de l’eau DI-fraîche. Confirmez que les points de contrôle positif de Ppib apparaissent comme des points rouges discrets et ponctués.
    9. Contre-coloration avec de l’hématoxyline de Gill’s 1, trempez 5 fois dans 2 changements d’eau DI, bleu dans 0,02 % d’hydroxyde d’ammonium, et trempe 5 fois dans 2 changements d’eau DI. Confirmez que les noyaux colorent en bleu et que la morphologie tissulaire est préservée. Laissez les glissières sécher toute la nuit et laissez glisser avec un médium de montage.
  2. Coloration en S rouge alizarin
    1. Pour des sections en série supplémentaires, répétez la déparaffinisation et la réhydratation aux étapes 3.1.2.
    2. Confirmez que le pH de la solution de travail Alizarin Red S est de 4,1 à 4,3.
    3. Immergez les lames dans l’Alizarin Red S pendant 30 à 60 s, ou jusqu’à ce que les dépôts de calcium prennent une couleur orange-rouge.
    4. Secouez les teintures excessives. Déshydratez avec 20 trempes rapides dans de l’acétone à 100 %, puis 20 trempes dans de l’acétone :xylène (1:1).
    5. Nettoyez les toboggans dans deux bains frais de xylène, 3 min chacun. Couvercle avec support de montage.

4. Préparation des diapositives GeoMx DSP et sélection du ROI

  1. Avant de commencer, nettoyez tout le matériel et les contenants avec une solution inactivante d’ARNase et séchez ou rincez avec de l’eau traitée au DEPC pour éviter toute contamination à l’ARN. Suivez les instructions pour le test de profilage spatial de l’ARN.
  2. Cuire les lames dans un four sec à 60 °C toute la nuit pour améliorer l’adhérence des tissus aux lames.
  3. Déparaffinisation et réhydratation : Immergez des lames dans du xylène (3 × 5 min), suivies d’un éthanol à 100 % (2 × 5 min), et d’un éthanol à 95 % dilué dans de l’eau traitée par DEPC pendant 5 minutes. Transférez les lames à 1× PBS pendant 1 minute.
  4. Incuber les lames dans un tampon de récupération antigénique préchauffé à 100 °C de Tris/EDTA pH 9,0 pendant 20 minutes, puis transférer les lames à 1× PBS pendant 5 minutes à la réflexion en temps réel.
  5. Incubez les lames dans une protéinase K préchauffée de 1,0 μg/ml pendant 15 minutes et rinçez en 1× PBS pendant 5 minutes à la réchauffe.
  6. Postfixez les lames à 10 % de NBF (200 μL par diapositive) pendant 5 minutes à RT, puis lavez en PBS pendant 5 minutes.
  7. Retirez les lames du PBS, tapotez sur un essuie-tout, essuyez l’excès de liquide autour du mouchoir avec un Kimwipe, puis placez-les dans la grille de coloration d’hybridation.
  8. Ajoutez 200 μL de solution d’hybridation (diluée 1:10 dans le tampon W) à chaque lame et appliquez un glissement d’hybridation. Fermez la chambre d’hybridation, insérez-la au four et incubez à 37 °C toute la nuit.
  9. Le trempage glisse dans un tampon saline-citrate de sodium (SSC, 2×), et permet aux particules d’hybridation de glisser d’elles-mêmes en moins de 5 minutes.
  10. Lavez les lames dans un tampon de lavage strict composé de parts égaux de 4× SSC et de formamide déionisé à 37 °C, 25 minutes par lavage. Lavez les lames dans un tampon SSC de 2×, 2 minutes par lavage.
  11. Bloquez les glissades avec le Buffer W à RT pendant 30 minutes.
  12. Couvrir le tissu d’une solution primaire d’anticorps (Rabbit anti-CD45) pendant 1 h dans la boîte à lames de la chambre d’humidité à RT, laver avec un tampon SSC 2× 3 fois.
  13. Appliquer une solution secondaire d’anticorps (anti-lapins de chèvre IgG-AF647) pendant 1 h puis laver dans 2× tampon SSC.
  14. Couvrir le tissu d’un anticorps marqué (anti-SMA-AF488) pendant 1 h dans la boîte à lames de la chambre d’humidité à RT. Laver dans 2× tampon SSC.
  15. Colorez les lames pendant 10 minutes dans un marqueur nucléaire Syto83 de 2 μM dilué dans le tampon W pendant 10 minutes.
  16. Scannez les lames avec un instrument de profilage ARN pour visualiser la coloration morphologique des marqueurs. Sélectionnez les ROI des lésions proximales et distales à calcifiées de chaque tissu artériel, en annotant la localisation spécifique à chaque ROI par couche.
    REMARQUE : Faites attention à éviter la formation de bulles d’air lors de l’application de la glisse d’hybridation sur les sections tissulaires.

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Résultats

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Le protocole décrit ici guide les chercheurs de la réception des artères tibiales à la génération de lames TMA qui conservent à la fois la morphologie et l’intégrité de l’ARN pour l’analyse transcriptomique spatiale. Il détaille également les méthodes histologiques pour visualiser les dépôts de calcium dans les artères, la coloration morphologique des marqueurs et les stratégies de sélection du ROI.

Dans la Figure 1, les artères s...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole détaille les étapes nécessaires pour préparer les artères tibiales humaines calcifiées au profilage transcriptomique spatial sur le NanoString GeoMx DSP. Les artères tibiales, comme tous les vaisseaux, possèdent des couches concentriques d’intime, de milieu et d’adventicite, chacune abritant des populations cellulaires distinctes qui orchestrent la lésion et la réparation. Le maintien de l’architecture de ces couches est essentiel pour les analyses transcriptomiques résolues...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par une subvention de démarrage du VA Puget Sound, le VA Merit Award I01 BX004975-02, ainsi que par des ressources et l’utilisation des installations du VA Puget Sound Health Care Center.  L’œuvre est celle des auteurs et ne reflète pas nécessairement la position ou la politique du Département des Anciens Combattants ou du gouvernement des États-Unis.  Nous tenons à saluer le service d’imagerie fourni par le Histology and Imaging Core (HIC) de l’Université de Washington.  Nous tenons à remercier le Dr Shreeram Akilesh pour ses conseils sur les expériences DSP à l’Université de Washington et son groupe aux laboratoires MANTIS : UW Spatial Biology Core.  Nous souhaitons également remercier Nishi Ivanov du Centre de recherche sur le diabète de l’Université de Washington pour la coloration histologique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Médium d’Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco, glycémie élevée, pyruvate  ;Thermo Fisher Scientific11995065
Solution tampon d’acide tampon 4-(2-hydroxyéthyle)-1-piperazine, éthanassulfonique (HEPES), 1 MThermo Fisher Scientific15630080
Pénicilline-Streptomycine (P/S), 10 000 U/mLThermo Fisher Scientific15140122
Formol tamponné neutre à 10 % (NBF)Millipore Sigma65346-M
Acide éthylène-diamine-tétraacétique (EDTA)Millipore Sigma3620
Solution de stabilisation ARNlaterThermo Fisher ScientificAM7024Solution de stabilisation ARN (RSS)
Peroxyde d’hydrogène (H2O2)Advanced Cell Diagnostics, Inc322335
Solution de récupération de ciblesAdvanced Cell Diagnostics, Inc322001
Protéase PlusAdvanced Cell Diagnostics, Inc322331Supplément d’enzymes digestives
DapB (contrôle négatif)Advanced Cell Diagnostics, Inc310043
Tampon de lavage RNAscope (kit de test RNAscope 2.5 HD Red ISH)Advanced Cell Diagnostics, Inc320058
AMP1Advanced Cell Diagnostics, Inc324511
AMP2Advanced Cell Diagnostics, Inc324512
AMP3Advanced Cell Diagnostics, Inc324513
AMP4Advanced Cell Diagnostics, Inc324514
AMP5 RougeAdvanced Cell Diagnostics, Inc324515
AMP6 RougeAdvanced Cell Diagnostics, Inc324516
Fast Red AAdvanced Cell Diagnostics, Inc324517
Ppib humainAdvanced Cell Diagnostics, Inc313901
Gill' s hématoxylineMillipore SigmaGHS132
Ponction d’antigène, Tris/EDTA pH 9Thermo Fisher Scientific00-4956-58
Protéinase KThermo Fisher ScientificAM2546
Solution d’hybridation - Hs WTANanocorde121401102
HybrislipGlissade d’hybridation
Solution d’hybridation - tampon RNanocorde121300313
Rabbit anti-CD45  ;Signalisation cellulaire1317
Tampon WNanocorde121300313
Anti-Lapin IgG-AF647 pour chèvresJackson Immunoresearch111-605-144
Souris anti-SMA-AF488  ;Thermo Fisher Scientific53-9760
Syto83  ;Thermo Fisher ScientificS11364
Lame chirurgicaleBD Biosciences371110
Superfrost & nbsp ; Lames de microscope plusThermo Fisher Scientific1255015
Stylo ImmEdge
Lames microtomesThermo Fisher Scientific22-500-125
RNase AWAYSolution inactivant la RNase
Équipement
Four d’hybridation HybEZ   ;Advanced Cell Diagnostics, Inc321710
Profileur spatial numérique GeoMxNanostring  ;Modèle : GeoMx DSP
Plateforme d’accès aux données : GeoMx DSP Control Center (Version 3.1.2.12)		Réglage du balayage du canal : pour le FITC, le temps d’explosion est de 300 ms, et le fluorophore est AlexaFluro 488 ; pour le canal Cy3, le temps d’exposition est de 50 ms, et le fluorophore est Syto83 ; et pour le canal Cy5, le temps d’exposition est de 300 ms, et le fluorophore est AlexaFluor 647.

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Transcriptomique spatialepr servation de l ARNd calcification tissulairehybridation RNAscopecoloration histologiquecoloration l alizarine rougematrice de tissur gion d int r t

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