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Article de méthode

Protocole de myokines induites par l’exercice CLCF1 pour l’étude des mécanismes de protection osseuse RANKL/OPG dans l’ostéoporose postménopausique

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DOI :

10.3791/69172

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7 novembre 2025

 ,  , 
1Department of Trauma Center, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University

Dans cet article

Résumé

Cet article présente un protocole complet pour l’étude du facteur 1 de cytokine de type cardiotrophine (CLCF1) en tant que médiateur de la protection osseuse induit par l’exercice par la modulation de l’axe RANKL/OPG dans l’ostéoporose postménopausique.

Résumé

Des études récentes ont identifié le facteur de cytokine de type cardiotrophine 1 (CLCF1) comme une « molécule de jeunesse » induite par l’exercice qui médie les avantages musculo-squelettiques, mais diminue avec l’âge. Ce protocole décrit une approche systématique pour étudier le rôle régulateur de CLCF1 dans la protection osseuse médiée par l’exercice via des mécanismes de diaphonie immunitaire-os. La méthodologie englobe l’analyse d’échantillons cliniques, des techniques de caractérisation moléculaire et des tests fonctionnels pour élucider l’influence de CLCF1 sur l’activateur du récepteur de l’axe de signalisation du ligand du facteur nucléaire-κB (RANKL)/ostéotétratérine (OPG). Grâce à la réaction en chaîne par polymérase quantitative (qPCR), au western blot, à l’édition de gènes CRISPR/Cas9 et aux systèmes de co-culture, ce protocole démontre la double action protectrice osseuse de CLCF1 via l’inhibition des ostéoclastes médiée par STAT1 et la promotion des ostéoblastes médiée par STAT3. Les méthodes décrites permettent l’évaluation complète des profils d’expression de CLCF1, des analyses de corrélation avec les paramètres de densité minérale osseuse et l’évaluation mécaniste des interventions potentielles de traitement par mimétique de l’exercice. Contrairement aux thérapies antirésorptives traditionnelles qui ciblent principalement les ostéoclastes, les interventions basées sur le CLCF1 peuvent offrir l’avantage unique de favoriser simultanément la formation osseuse tout en inhibant la résorption. Ce protocole fournit aux chercheurs des procédures normalisées pour étudier la régulation du métabolisme osseux induite par l’exercice et facilite le développement d’interventions thérapeutiques ciblées pour les troubles osseux liés à l’âge.

Introduction

L’ostéoporose postménopausique (PMOP) représente un exemple paradigmatique de déclin musculo-squelettique lié à l’âge, dans lequel la dérégulation du système immunitaire précipite la perte osseuse pathologique 1,2,3. Bien que l’exercice soit largement reconnu comme l’intervention non pharmacologique la plus efficace pour prévenir la détérioration osseuse liée à l’âge, les mécanismes moléculaires précis sous-jacents à la protection osseuse induite par l’exercice sont restés insaisissables jusqu’àrécemment4. La compréhension contemporaine du métabolisme osseux a évolué au-delà des cadres endocrinologiques traditionnels pour englober les interactions ostéo-immunes complexes et les myokines induites par l’exercice qui régissent l’homéostasie squelettique5.

L’identification récente du facteur de cytokine de type cardiotrophine 1 (CLCF1) comme facteur induit par l’exercice qui lutte contre le déclin musculo-squelettique lié à l’âge représente un changement de paradigme dans la compréhension de la diaphonie os-muscle6. Cette découverte révolutionnaire explique les effets bien établis de l’exercice sur la protection des os grâce à un mécanisme moléculaire jusqu’alors inconnu, positionnant CLCF1 comme le médiateur clé de l’ostéoanabolisme induit par l’exercice7. Les souris transgéniques surexprimant CLCF1 ont démontré une meilleure formation osseuse, une meilleure tolérance au glucose et des performances physiques supérieures par rapport aux témoins de type sauvage6, ce qui suggère que la supplémentation en CLCF1 pourrait potentiellement imiter les avantages de l’exercice dans les populations sédentaires ou à mobilité réduite.

Le traitement mimétique de l’exercice est défini comme des interventions pharmacologiques qui reproduisent la cinétique CLCF1 induite par l’exercice, offrant des avantages thérapeutiques similaires à l’activité physique par des voies moléculaires8. Le facteur de cytokine de type cardiotrophine 1 (CLCF1), alternativement appelé neurotrophine-1 (NNT-1) ou facteur de stimulation des lymphocytes B-3 (BSF-3), appartient à la superfamille des cytokines de l’interleukine-6 (IL-6) et présente des fonctions biologiques pléiotropes8. Caractérisé à l’origine pour ses propriétés neurotrophiques dans la survie et le développement des motoneurones spinaux, le rôle de CLCF1 en tant que myokine induite par l’exercice est devenu un domaine de recherche important. Des études cliniques récentes ont validé CLCF1 en tant que biomarqueur de l’état de santé osseuse, démontrant que les niveaux de protéine CLCF1 dans les cellules mononucléées du sang périphérique sont significativement diminués chez les femmes ménopausées atteintes d’ostéoporose par rapport aux témoins sains9. Ces études ont montré des corrélations positives entre l’expression de CLCF1 et la densité minérale osseuse à plusieurs sites squelettiques, fournissant une validation clinique qui renforce le potentiel translationnel des interventions thérapeutiques ciblées sur CLCF1.

Les cytokines fonctionnent par l’intermédiaire de complexes récepteurs hétéromériques, y compris les récepteurs solubles du facteur neurotrophique ciliaire (sCNTFR) et le facteur 1 analogue au récepteur des cytokines (CRLF-1), pour orchestrer diverses réponses cellulaires10,11. Des études mécanistes récentes ont élucidé le paradigme de la double signalisation selon lequel CLCF1 inhibe simultanément la résorption osseuse etfavorise la formation osseuse2,6,7,9. Cette double action se produit par le biais de l’activation de la voie STAT (transducteur de signal différentiel et activateur de la transcription) : la phosphorylation de STAT1 médie la suppression des ostéoclastes en interférant avec l’activateur du récepteur de la signalisation du facteur nucléaire-κB induit par le ligand RANKL (NF-κB), tandis que l’activation de STAT3 dans les ostéoblastes favorise l’expression des marqueurs de formation osseuse, notamment la phosphatase alcaline et l’ostéocalcine.

Comprendre comment les réponses aiguës à l’exercice se traduisent par des adaptations osseuses chroniques reste essentiel pour le développement thérapeutique13. Alors que l’élévation aiguë de CLCF1 après des séances d’exercice uniques fournit des informations mécanistes, des réponses aiguës répétées pendant des semaines ou des mois peuvent entraîner des effets protecteurs osseux durables grâce à la signalisation cumulative et aux adaptations cellulaires14.

La raison d’être de l’étude de CLCF1 dans la physiopathologie ostéo-immune découle de son rôle établi dans la régulation des lymphocytes B et de la reconnaissance du fait que les lymphocytes B constituent des producteurs importants de RANKL et d’ostéoprotéine (OPG)12,13. L’activateur du récepteur de l’axe facteur nucléaire-ligand κB (RANKL)/ostéoprotégeine (OPG) sert de mécanisme de régulation central pour la différenciation des ostéoclastes et la résorption osseuse14,15. Contrairement à d’autres membres de la famille IL-6 qui ont démontré un contrôle régulateur de l’homéostasie squelettique par la modulation du remodelage osseux, le double mécanisme de protection osseuse unique de CLCF1 offre un potentiel thérapeutique supérieur 16,17,18.

Les avantages de ce protocole par rapport aux méthodologies existantes comprennent son approche globale de l’investigation ostéo-immune de l’exercice, intégrant à la fois l’analyse de corrélation clinique et les études cellulaires mécanistes pour fournir des informations translationnelles sur la régulation du métabolisme osseux médiée par CLCF1. La pertinence clinique de ce protocole est encore renforcée par des preuves émergentes selon lesquelles les niveaux de CLCF1 peuvent être modulés par des interventions sur le mode de vie, ce qui le positionne comme une cible thérapeutique exploitable pour les troubles osseux liés à l’âge.

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Protocole

Ce protocole a été approuvé par le comité d’éthique de la recherche de l’établissement (Protocole #2024-CHSD-0156) et adhère aux principes de la Déclaration d’Helsinki. Toutes les procédures relatives aux animaux étaient conformes aux lignes directrices du comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (Protocole #2024-037). Tous les participants ont fourni un consentement éclairé écrit.

1. Prélèvement d’échantillons cliniques et évaluation de l’intervention en matière d’exercice

  1. Recrutement des participants et évaluation de l’historique des exercices
    1. Recruter des femmes ménopausées âgées de 55 à 75 ans avec une durée postménopausique minimale de 1 an.
    2. Évaluez les antécédents d’exercice détaillés, y compris la fréquence, l’intensité, le type et la durée de l’activité physique au cours des 6 derniers mois à l’aide de questionnaires normalisés sur l’activité physique.
    3. Classer les participants en groupes sédentaires (< 150 min/semaine), modérément actifs (150-300 min/semaine) et très actifs (> 300 min/semaine) en fonction des directives de l’OMS en matière d’exercice.
    4. Effectuer une évaluation complète des antécédents médicaux et un examen physique, y compris l’examen des médicaments et le dépistage des comorbidités.
    5. Obtenez des mesures d’absorptiométrie à rayons X à double énergie (DXA) à l’aide du densitomètre Hologic Discovery A avec le logiciel APEX v4.5. Effectuez un étalonnage quotidien avec le fantôme de la colonne vertébrale. Positionnez le patient en décubitus dorsal avec les jambes surélevées sur un bloc de positionnement conformément aux directives de l’International Society for Clinical Densitometry (ISCD).
    6. Classer les participants selon les critères de l’Organisation mondiale de la santé pour l’ostéoporose (score T ≤ -2,5 ET).
    7. Appliquer des critères d’exclusion : traitement anti-ostéoporotique antérieur dans les 12 mois, traitements immunosuppresseurs, maladies osseuses métaboliques, ostéoporose secondaire ou contre-indications aux tests d’effort.
  2. Évaluation de la réponse CLCF1 induite par l’exercice
    1. Prélevez des échantillons de sang de base entre 8h00 et 10h00 après 12 heures de jeûne nocturne dans des tubes EDTA.
    2. Mettre en œuvre un protocole d’exercice aigu standardisé : 45 minutes de marche d’intensité modérée à une fréquence cardiaque maximale de 65 à 70 %. Calculez la fréquence cardiaque maximale à l’aide de la formule de Karvonen (220 âge)19. Faites de l’exercice sur un tapis roulant motorisé avec surveillance continue de la fréquence cardiaque via un moniteur de ceinture pectorale. Maintenez la vitesse de marche à 3,5-4,5 km/h avec réglage de la pente pour atteindre la fréquence cardiaque cible.
    3. Prélever des échantillons de sang après l’exercice à 1 h, 4 h et 24 h pour évaluer la cinétique du CLCF1, en maintenant des conditions de prélèvement constantes.
    4. Conserver les aliquotes sériques à -80 °C pour la quantification ultérieure de CLCF1. Utilisez le kit ELISA CLCF1 humain avec une plage de détection de 31,2 à 2000 pg/mL. Diluer les échantillons 1:2 dans un diluant de dosage. Préparez une courbe standard à 7 points en utilisant des dilutions en série de 2 fois. Exécutez des échantillons en double. Lire des plaques à 450 nm avec une correction de longueur d’onde de 540 nm. Accepter le coefficient de variation (CV) < 20 % entre les doublons.
  3. Protocole d’intervention d’exercice longitudinal
    1. Concevez un programme d’exercices progressifs de 12 semaines avec trois séances par semaine.
    2. Prélever des échantillons de sang au départ, à 4, 8 et 12 semaines pour l’analyse de la trajectoire CLCF1.
    3. Évaluez les améliorations de la condition physique à l’aide du test de VO2 max au départ et au point final.
    4. Corrélez les changements de CLCF1 avec les améliorations de la DMO mesurées par DXA à 12 semaines.
    5. Documentez les adaptations de l’entraînement, y compris la tolérance à l’effort et les habitudes de récupération.

2. Isolation et traitement améliorés des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC)

  1. Isolation PBMC optimisée pour l’analyse CLCF1
    1. Prélever 20 mL d’échantillons de sang veineux dans des tubes contenant de l’EDTA (5 mL d’EDTA par tube) dans des conditions stériles.
    2. Traitez les échantillons dans les 2 h suivant le prélèvement pour une viabilité cellulaire optimale et une préservation de l’expression de CLCF1.
      1. Diluer les échantillons de sang 1:1 avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à température ambiante. Mélangez 20 ml de sang avec 20 ml de PBS.
      2. Superposez du sang dilué sur un milieu à gradient de densité dans des tubes coniques de 50 ml. Utiliser un milieu à gradient de densité de 15 ml pour 20 ml de sang dilué (rapport 1:1,33).
    3. Centrifugeuse à 400 × g pendant 30 min à température ambiante sans frein.
    4. Aspirer soigneusement la couche PBMC à l’interface plasma-Ficoll à l’aide d’une pipette Pasteur stérile.
    5. Laver les cellules deux fois avec du PBS contenant 2 % de sérum de veau fœtal (FBS) par centrifugation à 300 × g pendant 10 min.
  2. Évaluation de la viabilité cellulaire et mesure de référence du CLCF1
    1. Déterminer la viabilité cellulaire à l’aide de la méthode d’exclusion du bleu de trypan (cible > viabilité à 95 %)20.
    2. Évaluer l’expression intracellulaire de base de CLCF1 immédiatement après l’isolement.
    3. Ajuster la concentration cellulaire à 1 × 106 cellules/mL dans le milieu approprié.
    4. Allouez des cellules pour des applications en aval ou stockez-les dans de l’azote liquide. Congelez les PBMC dans un milieu de congélation contenant 90 % de FBS + 10 % de DMSO. Utilisez un récipient de congélation à débit contrôlé de -1 °C/min à -80 °C. Conserver 1 mL d’aliquotes (5 × 106 cellules /flacon) dans des flacons cryogéniques.

3. Analyse quantitative complète de l’expression des gènes

  1. Extraction et purification de l’ARN avec des considérations spécifiques à CLCF1
    1. Lyse 1 × 106 PBMC dans 1 mL de réactif de lyse de l’ARN dans l’heure suivant l’isolement.
    2. Ajouter 200 μL de chloroforme, agiter vigoureusement et incuber pendant 3 minutes à température ambiante.
    3. Centrifugeuse à 12 000 × g pendant 15 min à 4 °C pour réaliser une séparation de phase.
    4. Transférez la phase aqueuse dans un tube frais, ajoutez un volume égal d’isopropanol.
    5. Précipiter l’ARN par centrifugation à 12 000 × g pendant 10 min à 4 °C.
    6. Lavez les pastilles d’ARN avec de l’éthanol à 75 %, séchez-les à l’air libre et dissolvez-les dans de l’eau sans nucléases.
    7. Évaluer l’intégrité de l’ARN à l’aide d’une électrophorèse sur gel d’agarose ou d’un bioanalyseur (RIN cible >7.0).
  2. Transcription inverse et PCR quantitative avec ensembles d’amorces mis à jour
    1. Quantifier la concentration d’ARN à l’aide d’une analyse spectrophotométrique (rapport cible A260/A280 1,8-2,2).
    2. Effectuez la transcription inverse en utilisant 1 μg d’ARN total avec le kit de réactifs de transcription inverse.
    3. Préparez des réactions qPCR : Préparez des réactions de 20 μL contenant 10 μL de Master Mix, 0,8 μL de chaque amorce (10 μM stock, 400 nM final), 2 μL de matrice d’ADNc (50 ng), 6,4 μL d’eau sans nucléases. Exécuter des triplits. Utilisez un système de PCR en temps réel.
    4. Utilisez des séquences d’amorces validées :
      1. CLCF1 avant : 5'-CCTCCTGCTTCTTGCCTACC-3',
        revers : 5'-TGCCACCATGTTTGTTTCCT-3'
      2. CRLF1 avant : 5'-TGAAGCTCATCCTGCAGTTC-3',
        revers : 5'-CAGCATCTCTCTCCTTGATGC-3'
      3. STAT1 avant : 5'-CAGCTTCAGCAGCTTGACTC-3',
        marche arrière : 5'-AAGGTCAGCGATGTCTTCAG-3'
      4. STAT3 avant : 5'-CAGCAGCTTGACACACGGTA-3',
        marche arrière : 5'-AAACACCAAAGTGGCATGTGA-3'
    5. Exécutez le protocole qPCR : 95 °C pendant 10 min, suivi de 40 cycles de 95 °C pendant 15 s et 60 °C pendant 1 min.
    6. Analysez les résultats à l’aide de la méthode 2(-ΔΔCt) avec normalisation β-actine21.
  3. Analyse de panel de gènes d’exercice-réponse
    1. Inclure les gènes sensibles à l’exercice : IL-6, TNF-α, IL-1β, BDNF, IGF-1 et myostatine.
    2. Utilisez des séquences d’amorces validées :
      1. IL-6 avant : 5'-AGCCACTCACCTCTTCAGAAC-3',
        revers : 5'-GCCTCTTTGCTGCTTTCACAC-3' ;
      2. TNF-α avant : 5'-CCCAGGGACCTCTCTCTCTAATC-3',
        marche arrière : 5'-ATGGGCTACAGGCTTGTCACT-3' ;
      3. IL-1β vers l’avant : 5'-ACAGATGAAGTGCTCCTTCCA-3',
        marche arrière : 5'-GTCGGAGATTCGTAGCTGGAT-3' ;
      4. BDNF vers l’avant : 5'-TAACATGGCTGCGCGTGTGT-3',
        revers : 5'-CGAGTGGGTCAGCGGCAGG-3' ;
      5. IGF-1 avant : 5'-GCTCTTCAGTTCGTGTGTGGA-3',
        revers : 5'-GCCTCCTTAGATCACAGCTCC-3' ;
      6. Myostatine vers l’avant : 5'-AGTGACGGGCTCTTTGGAAGA-3',
        revers : 5'-GTTTCAGAGGCCGGTCAAGT-3'.
    3. Corrélez les changements induits par l’exercice dans CLCF1 avec d’autres modèles d’expression de myokines.
    4. Évaluer les rapports de co-expression CLCF1/CRLF1 en tant qu’indicateurs de la formation de complexes cytokines fonctionnels.

4. Analyse améliorée de l’expression des protéines avec focalisation sur la voie STAT

  1. Extraction et quantification de protéines pour l’analyse STAT
    1. Lyser les PBMC dans un tampon de lyse (150 mM de NaCl, 1 % de NP-40, 0,5 % de désoxycholate de sodium, 0,1 % de SDS, 50 mM de Tris-HCl pH 8,0) complété par des cocktails d’inhibiteurs de protéase et de phosphatase.
    2. Ajouter quelques inhibiteurs spécifiques de la phosphatase : l’orthovanadate de sodium (1 mM) et le fluorure de sodium (50 mM) immédiatement avant l’utilisation.
    3. Incuber les lysats sur glace pendant 30 min avec un tourbillon périodique à vitesse moyenne toutes les 10 min.
    4. Centrifuger à 12 000 × g pendant 15 min à 4 °C pour éliminer les débris cellulaires.
    5. Quantifier la concentration en protéines à l’aide du test de Bradford ou de la méthode BCA22.
    6. Ajustez les concentrations de protéines à 2 μg/μL dans un tampon d’échantillon et stockez-les à -80 °C jusqu’à une analyse plus approfondie pour les applications de western blot.
  2. Analyse complète du western blot avec focalisation sur la signalisation STAT
    1. Préparez 10 mL de gels SDS-PAGE à 10 % en utilisant des solutions standard d’acrylamide/bisacrylamide.
    2. Chargez 20 μg de protéines par voie avec des marqueurs de poids moléculaire pré-colorés et résolvez à 120 V pendant 90 min.
    3. Transférez les protéines sur des membranes PVDF à 100 V pendant 2 h à 4 °C à l’aide d’un tampon de transfert (25 mM de Tris, 192 mM de glycine, 20 % de méthanol).
    4. Bloquer les membranes avec 50 mL de lait écrémé en poudre à 5 % dans une solution saline tamponnée au Tris avec 0,1 % de Tween-20 (TBST).
    5. Incuber avec des anticorps primaires pendant la nuit à 4 °C : Anti-CLCF1 (1:1 000) ; Anti-CRLF1 (1:1 000) ; Anti-OPG (1:1 000) ; Anti-RANKL (1:1 000) ; Anti-JAK2 (1:1 000) ; Antiphospho-JAK2 (Tyr1007/1008, 1:1 000) ; Anti-STAT1 (1:1 000) ; Anti-phospho-STAT1 (Tyr701, 1:1 000) ; Anti-STAT3 (1:1 000) ; Anti-phospho-STAT3 (Tyr705, 1:1 000) ; Anti-β-actine (1:1 000)
    6. Laver les membranes 3 fois pendant 10 minutes chacune avec 15 mL de TBST. Incuber avec les anticorps secondaires appropriés pendant 1 h à température ambiante.
    7. Détectez les bandes de protéines à l’aide d’un substrat de chimiluminescence amélioré. Image à l’aide d’un système d’imagerie par chimiluminescence avec optimisation automatique de l’exposition. Quantifiez à l’aide de l’analyse densitométrique avec l’outil d’analyse de gel ImageJ v1.53.
  3. Analyse à double voie STAT1/STAT3
    1. Calculez les rapports phospho-STAT1/STAT1 total et phospho-STAT3/STAT3 total à l’aide de la version 1.54f du logiciel ImageJ/Fiji.
    2. Évaluer l’équilibre d’activation STAT1/STAT3 en tant qu’indicateur de l’activité fonctionnelle de CLCF1.
    3. Corrélez les modèles d’activation STAT avec les rapports d’expression RANKL/OPG.
    4. Évaluer la phosphorylation de STAT1/STAT3 par Western blot à 0, 15, 30, 60, 120 et 240 min après le traitement de la CLCF1. Normaliser les phosphoprotéines aux niveaux de protéines totales à l’aide de la densitométrie.

5. Inactivation avancée du gène médiée par CRISPR/Cas9 avec validation

  1. Construction améliorée du vecteur lentiviral
    1. Concevoir un ARN monoguide (ARNsg) ciblant la séquence du gène CLCF1 :
      TTGAAGTCTGGCTCGTTGAA-3'.
    2. Inclure des séquences d’ARNsg supplémentaires pour une meilleure efficacité de knock-out :
      GCTTGAACGAGCCAGACTTC-3'.
    3. Clonez des ARNsg dans un vecteur lentiviral à l’aide de techniques de clonage moléculaire standard.
    4. Vérifiez l’intégrité de la construction grâce à l’analyse du séquençage de l’ADN.
    5. Évaluez l’efficacité de coupe de l’ARNsg à l’aide du test de l’endonucléase I T723.
    6. Inclure la validation de la spécificité de la voie à l’aide d’inhibiteurs : AG490 (JAK2, 50 μM), fludarabine (STAT1, 10 μM) et Stattic (STAT3, 5 μM).
    7. Effectuer des expériences de sauvetage en utilisant des constructions STAT constitutivement actives pour valider la nécessité de la voie.
  2. Protocole de transduction lentivirale optimisé
    1. Cultivez des cellules Raji dans un milieu RPMI-1640 (500 ml) complété par 10 % de FBS. Maintenir toutes les cultures cellulaires à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2. Pré-équilibrer le milieu de culture pendant au moins 30 min avant utilisation.
    2. Prétraiter les cellules avec du polybrène (8 μg/mL) pour améliorer l’efficacité de la transduction.
    3. Produire du lentivirus à l’aide de cellules HEK293T avec des plasmides d’emballage et d’enveloppe par transfection de phosphate de calcium. Déterminer le titre par p24 ELISA (> 108 TU/mL requis). Suivre les procédures de confinement BSL-223.
    4. Transduisez des cellules avec du lentivirus à une multiplicité d’infection (MOI) de 100. Changez de support 24 h après la transduction. Sélectionner les cellules transduites à l’aide de puromycine (4 μg/mL) pendant 7 jours, puis amplifier une région de 500 pb couvrant le site cible à l’aide des conditions de PCR suivantes : dénaturation initiale à 95 °C pendant 3 min, suivie de 35 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 30 s, recuit à 60 °C pendant 30 s et extension à 72 °C pendant 30 s, avec une extension finale à 72 °C pendant 5 min. Pour le dosage de l’endonucléase T7, dénaturer et recuire les produits de PCR, digérer avec l’endonucléase T7E1 pendant 30 min à 37 °C, puis analyser les produits sur un gel d’agarose à 2 %.
    5. Valider l’efficacité de l’inactivation génique par western blot et séquençage de Sanger24,25.
    6. Effectuer une analyse hors cible à l’aide de GUIDE-seq ou d’une méthodologie similaire26.
      REMARQUE : Des preuves récentes démontrent que l’efficacité de la sécrétion de CLCF1 nécessite une co-expression avec la protéine chaperonne CRLF1. Envisager des approches à double knock-out pour une ablation fonctionnelle complète27.

6. Système complet de co-culture avec mimétiques d’exercice

REMARQUE : Pour la validation translationnelle, adaptez-vous aux modèles murins ovariectomisés en administrant rhCLCF1 à raison de 10 μg/kg i.p. par jour pendant 4 semaines, en évaluant la DMO par micro-TDM.

  1. Configuration avancée de la co-culture Raji-MG-63
    1. Implantez des cellules de type ostéoblaste MG-63 dans des chambres inférieures à plaques de 24 puits à une densité de 2 × 104 cellules/puits dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO2 et 95 % d’humidité. Pré-équilibrez le milieu dans l’incubateur pendant 30 min avant utilisation. Pour une traduction améliorée, remplacez-les par des ostéoblastes humains primaires (densité 1 ×10 4/puits) provenant de sources commerciales.
    2. Placez des inserts de membrane de 0,4 μm dans les puits contenant des cellules MG-63.
    3. Implantez des cellules Raji (de type sauvage, knock-out CLCF1 ou surexpression de CLCF1) dans des chambres supérieures à une densité de 1 × 105 cellules/puits.
    4. Maintenir les co-cultures dans un milieu RPMI-1640 complet (2 mL dans la chambre inférieure, 1,5 mL dans la chambre supérieure) pendant des périodes expérimentales spécifiées (7, 14, 21 jours) à 37 °C avec 5 % de CO2.
    5. Inclure des groupes de traitement recombinant CLCF1 (5-10 ng/mL) pour évaluer les relations dose-réponse.
  2. Protocole de traitement CLCF1 mimétique par l’exercice
    1. Traiter les systèmes de co-culture avec des concentrations physiologiques de CLCF1 recombinant (5-10 ng/mL) basées sur les niveaux induits par l’exercice.
    2. Appliquer le régime de traitement pulsatile CLCF1 : Appliquer CLCF1 pendant 2 h par impulsions à 0, 8 et 16 h le jour 1, suivi d’une exposition continue pendant 24 h, puis répéter le cycle. Durée totale du traitement : 7 jours avec 9 impulsions au total.
    3. Évaluez les effets dépendants du temps à 1 h, 4 h, 24 h et 7 jours après le traitement.
    4. Surveiller la cinétique de phosphorylation de STAT1/STAT3 dans les deux populations cellulaires par Western blot à 0, 15, 30, 60 min. Les cellules de lyse en tampon (500 μL) avec inhibiteurs, se normalisent en STAT1/3 total et en β-actine.
  3. Évaluation améliorée de la différenciation ostéogénique
    1. Induire la différenciation ostéogénique à l’aide d’un milieu ostéogénique standard contenant de l’acide ascorbique (50 μg/mL), du β-glycérophosphate (10 mM) et de la dexaméthasone (10 nM). Changez de milieu ostéogénique tous les 3 jours (chambre inférieure de 2 ml, chambre supérieure de 1,5 ml). Préparez une solution fraîche d’acide ascorbique pour chaque changement ; β-glycérophosphate et dexaméthasone restent stables.
    2. Évaluer l’activité de la phosphatase alcaline (ALP) à l’aide d’un dosage enzymatique colorimétrique aux jours 7, 14 et 2128. Utilisez 500 μL de volume d’extraction. Lire à 405 nm. Normaliser à la teneur totale en protéines. Gamme de couleurs attendue : jaune clair (faible) à jaune foncé (élevé).
    3. Évaluer les dépôts de calcium par coloration et quantification du rouge d’alizarine au 21e jour. Extrait avec 500 μL de chlorure de cétylpyridinium, lu à 540 nm, gamme de couleur attendue : rose clair (faible minéralisation) à rouge foncé (forte minéralisation).
    4. Quantifier la minéralisation en mesurant l’absorbance à 540 nm après extraction au chlorure de cétylpyridinium.
    5. Analysez l’expression des gènes ostéogéniques : RUNX2, ALP, COL1A1, OCN et OPG à l’aide des protocoles qPCR décrits à l’étape 3.2.
    6. Évaluer les marqueurs liés aux ostéoclastes : TRAP, cathepsine K et RANKL dans les cellules MG-63.

7. Analyse statistique avancée et interprétation des données

  1. Méthodologie statistique complète
    1. Effectuer des tests de normalité à l’aide du test de Shapiro-Wilk pour toutes les variables continues29. Utiliser des tests non paramétriques lorsque les hypothèses de normalité ne sont pas respectées (p < 0,05).
    2. Appliquer le test U de Mann-Whitney pour les comparaisons non paramétriques entre les groupes30.
    3. Effectuer une analyse de corrélation de Spearman pour les études d’association entre les niveaux de CLCF1 et les paramètres cliniques31.
    4. Effectuez une analyse de régression multiple pour évaluer les prédicteurs indépendants de la DMO.
    5. Utiliser des mesures répétées ANOVA pour l’analyse de l’évolution temporelle de l’interventiond’exercice 32.
    6. Appliquer la correction de Bonferroni pour les comparaisons multiples33.
    7. Fixer le seuil de signification statistique à p < 0,05 pour toutes les analyses.
  2. Présentation et analyse améliorées des données
    1. Présenter les données continues sous forme de moyenne ±écart-type ou de médiane avec écart interquartile.
    2. Créez des graphiques de corrélation pour l’expression de CLCF1 par rapport à la DMO, le nombre de lymphocytes et les paramètres d’exercice à l’aide de GraphPad Prism v9 pour les statistiques, ImageJ v1.53 pour la densitométrie. Aucun script personnalisé n’est nécessaire. Générer du ROC via l’outil intégré de Prism ; corrélations via Spearman dans Prism.
    3. Générez des tracés temporels pour la cinétique de réponse CLCF1 induite par l’exercice.
    4. Développer des courbes ROC (Receiver Operating Characteristic) pour CLCF1 en tant que biomarqueur de l’ostéoporose.
      REMARQUE : Des images représentatives du transfert de Western ont été créées à l’aide d’une analyse densitométrique quantitative.

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Résultats

La mise en œuvre de ce protocole démontre avec succès le rôle régulateur de CLCF1 dans le métabolisme osseux à médiation immunitaire en utilisant plusieurs approches expérimentales. Les études de validation clinique montrent une régulation négative significative de l’expression de CLCF1 chez les patientes PMOP par rapport aux témoins sains, comme le montre la figure 1A, l’analyse quantitative par PCR des cellules mononucléées...

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Discussion

Le protocole décrit dans le présent document fournit un cadre méthodologique complet pour étudier le rôle de CLCF1 en tant que médiateur de la protection osseuse induit par l’exercice grâce à une analyse systématique de l’axe RANKL/OPG. Des recherches récentes ont identifié le CLCF1 comme un facteur induit par l’exercice qui lutte contre le déclin musculo-squelettique lié à l’âge, le positionnant comme un médiateur central de la protection osseuse induite par l’ex...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Les auteurs remercient les participants qui se sont portés volontaires pour cette étude et le personnel clinique de l’hôpital central affilié à la Shandong First Medical University pour leur aide dans le recrutement des patients et la collecte d’échantillons. Nous remercions les techniciens de laboratoire pour leur soutien dans les expériences de culture cellulaire et de biologie moléculaire. H.Z. a conçu et conçu l’étude, réalisé les expériences, analysé les données et rédigé le manuscrit. H.L. a contribué à la conception expérimentale, à la collecte de données et à la révision du manuscrit. Y.S. a supervisé le projet, fourni des commentaires critiques et édité le manuscrit. Tous les auteurs ont examiné et approuvé le manuscrit final pour soumission.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
< Solide>Médias de culture cellulaire & Supports Réactifs
Diméthyl Sulfoxyde (DMSO)Sigma-AldrichD2650Purpose_Application :   ; Composant du milieu de cryopréservation
Specifications_Comments : Qualité biologie moléculaire, filtré stérile
Médium DMEMThermo Fisher Scientific11965092Purpose_Application :   ; Milieu de culture d’ostéoblastes MG-63
Specifications_Comments : formulation à haute glycémie avec L-glutamine.
Sérum fœtal bovin (FBS)Thermo Fisher Scientific16000044Purpose_Application :   ; Supplément de culture cellulaire (inactivé par la chaleur)
Specifications_Comments : Inactivé par la chaleur à 56&Circ ; ° ; C pendant 30 min
Pénicilline-StreptomycineThermo Fisher Scientific15140122Purpose_Application :   ; Supplément antibiotique pour culture stérile
Specifications_Comments : 100X stock, concentration finale 1 %
Polybrene (bromure d’hexadiméthrine)Santa Cruz BiotechnologieSC-134220Purpose_Application :   ; Amplificateur de transduction lentivirale
Specifications_Comments : 8 & Icir ; ¼ ; Concentration de travail g/mL
Dihydrochlorure de puromycineInvivoGenANT-PR-1Purpose_Application :   ; Antibiotique de sélection pour les cellules transduites
Specifications_Comments : 4 & Icirc ; ¼ ; concentration de sélection g/mL pendant 7 jours
RPMI-1640 moyenThermo Fisher Scientific11875093Purpose_Application :   ; Milieu de culture de lymphocytes B Raji
Specifications_Comments : Avec de la L-glutamine, sans rouge de phénol préféré
Solution bleue de TrypanThermo Fisher Scientific15250061Purpose_Application :   ; Évaluation de la viabilité cellulaire
Specifications_Comments : solution à 0,4 % pour le test d’exclusion
Conteneur de gel à débit contrôléThermo Fisher Scientific5100-0001Purpose_Application :   ; Gel des cellules à taux contrôlé (-1 ; ° ; C/min)
Specifications_Comments : Mr. Frosty ou équivalent pour -1&Circ ; ° ; Refroidissement C/min
Tubes de collecte de sang EDTABD Biosciences366643Purpose_Application :   ; Prélèvement veineux avec anticoagulant
Specifications_Comments : capacité de 10-20 mL, tubes supérieurs violets
Gradient de densité PLUS de Ficoll-PaqueCytiva (GE Healthcare)17144003Purpose_Application :   ; Isolation PBMC par centrifugation de densité
Specifications_Comments : Stérile, testée par endotoxine pour la séparation cellulaire
Solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS)Thermo Fisher Scientific14190144Purpose_Application :   ; Tampon de lavage cellulaire et dilution
Specifications_Comments : stérile, de qualité culture cellulaire
< Extraction >ARN fort et qPCR
Chloroforme (Grade ACS)Sigma-AldrichC2432Purpose_Application :   ; Séparation de phase dans l’extraction d’ARN
Specifications_Comments : grade réactif ACS, â ; &permil ; & yens ; Pureté à 99 %
Éthanol (75 %, qualité moléculaire)Sigma-AldrichE7023Purpose_Application :   ; Lavage des granulés d’ARN
Specifications_Comments : Qualité biologie moléculaire, préparer frais
Isopropanol (Grade moléculaire)Sigma-AldrichI9516Purpose_Application :   ; Précipitation ARN
Specifications_Comments : Grade de biologie moléculaire, â ; &permil ; & yens ; Pureté à 99,5 %
Eau sans nucléaseThermo Fisher ScientificAM9930Purpose_Application :   ; Préparation de la réaction PCR
Specifications_Comments : sans DNase/RNase, testée pour des applications PCR
Film adhésif optiqueThermo Fisher Scientific4311971Purpose_Application :   ; Scellement optique pour plaques qPCR
Specifications_Comments : Qualité optique pour les applications qPCR
Plaques PCR (96 puits)Thermo Fisher ScientificN8010560Purpose_Application :   ; Format 96 puits pour qPCR
Specifications_Comments à haut débit : fond blanc et transparent pour la détection optique
Bandes de tubes PCRThermo Fisher ScientificAB0451Purpose_Application :   ; Réactions PCR à petit volume
Specifications_Comments : bandes à 8 tubes avec condensateurs individuels
Kit de réactifs PrimeScript RTBiographie de TakaraRR037APurpose_Application :   ; Transcription inversée de l’ARN en cDNA
Specifications_Comments : avec gomme gDNA pour l’extraction d’ADN génomique
SYBR Green Master MixBiosystèmes appliqués4309155Purpose_Application :   ; Amplification et détection PCR en temps réel
Specifications_Comments : avec colorant de référence ROX pour la normalisation
Réactif TRIzol (lyse ARN)Thermo Fisher Scientific15596026Purpose_Application :   ; Lyse cellulaire et extraction d’ARN
Specifications_Comments : Stockage à 4&Circ ; ° ; C, à utiliser dans les 6 mois
protéines fortes - Western Blot
Acrylamide/Bis-acrylamide (29:1)Bio-Rad1610146Purpose_Application :   ; Polymérisation en gel SDS-PAGE
Specifications_Comments : solution d’acrylamide à 30 %
Kit de test protéique BCAThermo Fisher Scientific23225Purpose_Application :   ; Quantification de la concentration des protéines
Specifications_Comments : Compatible avec la réduction pour une quantification précise
Substrat à chimiluminescence améliorée (ECL)Thermo Fisher Scientific32106Purpose_Application :   ; Détection des protéines chimiluminescentes
Specifications_Comments : détection de sensibilité par femtogrammes
Lait sec écréméLaboratoire scientifique170-6404Purpose_Application :   ; Agent bloqueant Western Blot
Specifications_Comments : Grade de blocage, faible fond
Cocktail inhibiteur de phosphataseRoche Sciences Appliquées4906845001Purpose_Application :   ; Prévenir la déphosphorylation des protéines
Specifications_Comments : Inclut l’acide okadaïque et la calyculine A
Échelle des protéines prêtéesBio-Rad1610394Purpose_Application :   ; Normes de référence du poids moléculaire
Specifications_Comments : plage de 10 à 250 kDa avec 11 bandes
Cocktail inhibiteur de protéaseRoche Sciences Appliquées11697498001Purpose_Application :   ; Prévenir la dégradation des protéines pendant la lyse
Specifications_Comments : Sans EDTA pour les phosphatases dépendantes des métaux
Membranes PVDF (0,45 & Icirc ; ¼ ; m)Millipore SigmaIPVH00010Purpose_Application :   ; Membrane de transfert protéique (0,45 & Icirc ; ¼ ; pore m)
Specifications_Comments : fond de faible fluorescence
Tampon de lyse RIPATechnologie de signalisation cellulaire9806SPurpose_Application :   ; Extraction de protéines à cellules entières
Specifications_Comments : tampon de lyse prêt à l’emploi avec des détergents
Tampon de chargement d’échantillons (4X)Bio-Rad1610747Purpose_Application :   ; Préparation d’échantillon protéique pour SDS-PAGE
Specifications_Comments : Chargement du colorant avec Î ; ² ;-mercaptoéthanol
TAMPON D’EXÉCUTION SDS-PAGEBio-Rad1610732Purpose_Application :   ; Électrophorèse protéique
Specifications_Comments : système tampon trisglycine-SDS
Fluorure de sodiumSigma-Aldrich201154Purpose_Application :   ; Inhibition supplémentaire de la phosphatase
Specifications_Comments : concentration de travail de 50 mM
Sodium OrthovanadateSigma-AldrichS6508Purpose_Application :   ; JAK2/STAT phosphorylation préservation
Specifications_Comments : 1 mM concentration de travail, préparer frais
Concentré de tampon de transfertBio-Rad1704156Purpose_Application :   ; Transfert de protéines semi-sèches
Specifications_Comments : 10 fois concentré, dilué avant utilisation
Solution physiologique tampon avec Tween-20 (à déterminer)Technologie de signalisation cellulaire9997SPurpose_Application :   ; Lavage de membranes et dilution des anticorps
Specifications_Comments : 0,1 % Tween-20, pH 7,6
CRISPR/Édition génétique
Calcium Phosphate Transfection KitPromegaE1200Purpose_Application :   ; Transfection d’ADN dans des cellules d’emballage
Specifications_Comments : Haute efficacité de transfection pour la production de lentivirus
Kit d’extraction de gel d’ADNQiagen28706Purpose_Application :   ; Purification des produits PCR pour le séquençage
Specifications_Comments : système de purification à colonnes
GV371 Vecteur lentiviralGeneChem Co., LtdGV371Purpose_Application :   ; Expression de CRISPR/Cas9 pour le knockout génique
Specifications_Comments : système lentiviral CRISPR/Cas9 prêt à l’emploi
HEK293T Ligne cellulaireATCCCRL-3216Purpose_Application :   ; Gamme cellulaire d’emballage lentiviral
Specifications_Comments : Gamme cellulaire d’emballage hautement transfectable
Service de séquençage SangerMacrogen Inc.CoutumePurpose_Application :   ; Validation de knockout et analyse hors cible
Specifications_Comments : Séquençage standard avec amorces personnalisées
Endonucléase T7 INew England BiolabsM0302SPurpose_Application :   ; Validation de l’efficacité de la coupe CRISPR
Specifications_Comments : endonucléase spécifique à la mismatch pour la validation CRISPR
< fort>ELISA & Immunoanalyses
Plaques ELISA (96 puits, fond plat)Corning3590Purpose_Application :   ; Réaction du substrat ELISA
Specifications_Comments : Haute liaison, fond plat pour ELISA
CLCF1 DuoSet ELISA humainR& Systèmes DDY1234Purpose_Application :   ; Quantification des protéines CLCF1 (31,2-2000 pg/mL)
Specifications_Comments : plage de détection : 31,2-2000 pg/mL, CV & 10%
Kit ELISA p24 (titre lentiviral)ZeptoMetrix Corporation801111Purpose_Application :   ; Détermination du titre lentiviral
Specifications_Comments : Pour la détermination du titre lentiviral (>10â ; &cédil ; TU/mL)
Fonctionnels
Kit de coloration Alizarin Red SSigma-AldrichA5533Purpose_Application :   ; Visualisation des dépôts calciques
Specifications_Comments : solution à 2 % dans de l’eau distillée, pH 4,1-4,3
Kit d’activité phosphatase alcalineAbcamab83369Purpose_Application :   ; Mesure de l’activité enzymatique ALP
Specifications_Comments : test colorimétrique, lecture à 405 nm
Acide ascorbique (acide L-ascorbique)Sigma-AldrichA4544Purpose_Application :   ; Composant du milieu ostéogène
Specifications_Comments : 50 & icirc ; ¼ ; Concentration finale g/mL
Chlorure de cétylypyridiniumSigma-AldrichC9002Purpose_Application :   ; Extraction Alizarin Red S pour la quantification
Specifications_Comments : solution à 10 % pour l’extraction de colorant
DexaméthasoneSigma-AldrichD4902Purpose_Application :   ; Composant du milieu ostéogène
Specifications_Comments : concentration finale de 10 nM
Π; ² ;-GlycérphosphateSigma-AldrichG9422Purpose_Application :   ; Composant du milieu ostéogénique
Specifications_Comments : concentration finale de 10 mM
Milieu de différenciation ostéogéniquePromoCellC-28010Purpose_Application :   ; Induction par différenciation des ostéoblastes
Specifications_Comments : Milieu ostéogénique complet prêt à l’emploi
Inserts de culture cellulaire Transwell (0,4 & icirc ; ¼ ; m)Corning3470Purpose_Application :   ; Système de co-culture avec 0,4 & Icirc ; ¼ ; Séparation m
Specifications_Comments : Membrane térephtalate de polyéthylène stérile, stérile
Équipement - Instruments majeurs
Centrifugeuse (Haute vitesse, réfrigérée)Eppendorf5430RPurpose_Application :   ; Traitement des échantillons et séparation des cellules
Specifications_Comments : réfrigéré, max 30 000 x g
Système d’imagerie chimiluminescenceLaboratoires Bio-Rad12003154Purpose_Application :   ; Imagerie et quantification Western blot
Specifications_Comments : documentation sur gel et imagerie Western blot
Incubateur CO2 (Humidifié)Thermo Fisher Scientific51030287Purpose_Application :   ; Maintien en culture cellulaire (37 ; ° ; C, 5 % CO2)
Specifications_Comments : Triple gaz (CO2/O2/N2), contrôle de l’humidité
Moniteur de fréquence cardiaque (Sangle pectorale)Polar ElectroH10Purpose_Application :   ; Surveillance continue de la fréquence cardiaque
Specifications_Comments : connectivité Bluetooth et Acirc ; ± ; Précision de 1 bpm
Découverte Hologic : un scanner DXAHologic Inc.Découverte APurpose_Application :   ; Mesure de la densité minérale osseuse
Specifications_Comments : avec le logiciel APEX v4.5, un contrôle qualité quotidien requis
Lecteur de microplaques (Multi-mode)BioTek InstrumentsSynergie H1Purpose_Application :   ; Lecture des plaques ELISA et mesure d’absorption
Specifications_Comments : UV-Vis, fluorescence, détection de luminescence
Tapis de course motoriséCondition physique de vie95TiPurpose_Application :   ; Intervention d’exercice standardisée
Specifications_Comments : vitesse variable 0-16 km/h, pente 0-15 %
Système de PCR en temps réel (CFX96 ou équivalent)Laboratoires Bio-Rad1855195Purpose_Application :   ; Amplification et détection PCR en temps réel
Specifications_Comments : bloc à 96 puits, capable de gradient
< Solide>Logiciel & Logiciels Outils d’analyse
Logiciel APEX v4.5 (Analyse DXA)Hologic Inc.v4.5Purpose_Application :   ; Analyse du scan DXA et calcul de la DMO
Specifications_Comments : analyse de la DMO avec base de données de référence
Bio-Rad CFX MaestroLaboratoires Bio-RadCFX MaestroPurpose_Application :   ; Analyse des données qPCR et détermination de la CT
Specifications_Comments : analyse PCR en temps réel et exportation de données
GraphPad Prism v9.0Logiciel GraphPadv9.0Purpose_Application :   ; Analyse statistique et génération de graphes
Specifications_Comments : logiciel statistique avec génération de graphes
ImageJ/Fiji v1.53Instituts nationaux de la santév1.53Purpose_Application :   ; Densitométrie Western blot et analyse d’image
Specifications_Comments : Analyse d’image avec outils de mesure
Microsoft Excel 365Microsoft Corporation365Purpose_Application :   ; Organisation des données et calculs de base
Specifications_Comments : Organisation des données et fonctions statistiques de base
< fort>Consommables & consommables Plastique
Tubes microcentrifuges de 1,5 mLEppendorf22363204Purpose_Application :   ; Stockage et traitement d’échantillons en petit volume
Specifications_Comments : sans DNase/RNase, faible liaison
Tubes coniques de 15 mLCorning430766Purpose_Application :   ; Traitement d’échantillons de volume moyen
Specifications_Comments : Polypropylène, gradué, avec des condensateurs
Plaques de culture cellulaire à 24 puitsCorning3524Purpose_Application :   ; Co-culture et installation du test fonctionnel
Specifications_Comments : Culture tissulaire traitée, fond plat
Tubes coniques de 50 mLCorning430829Purpose_Application :   ; Collecte et traitement d’échantillons en grand volume
Specifications_Comments : Polypropylène, gradué, avec capsules
Cryovials (1 mL)Thermo Fisher Scientific375418Purpose_Application :   ; Stockage à long terme de cellules et d’échantillons à -80&Circ ; ° ; C
Specifications_Comments : Filetage externe, joint torique, -196&Circ ; ° ; Classé C
Pipettes Pasteur (stériles)Fisher Scientific13-678-20APurpose_Application :   ; Collecte et transfert stériles d’échantillons
Specifications_Comments : enveloppés individuellement, stériles

Références

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