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Article de méthode

Inhibition de l’ostéoclastogenèse par LY90009 par modulation de signalisation Notch dans des modèles de maladies ostéolytiques

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DOI :

10.3791/69178

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7 octobre 2025

 ,  , 
1Department of Rheumatology, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University, 2Department of Geriatrics, Feicheng People's Hospital, 3Department of Trauma Center, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour évaluer les effets inhibiteurs de l’inhibiteur de la γ-sécrétase LY900009 sur l’ostéoclastogenèse induite par RANKL dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse. Le protocole comprend l’évaluation de la cytotoxicité, des tests fonctionnels, des analyses moléculaires et une validation in vivo dans un modèle ostéolytique murin, avec des applications dans le développement thérapeutique des maladies ostéolytiques.

Résumé

L’activité déréglée des ostéoclastes contribue profondément à la progression de la maladie ostéolytique, mais l’étendue des modalités d’intervention thérapeutique est limitée par les effets indésirables. Cette étude a porté sur LY900009, un inhibiteur de la γ-sécrétase, et sur sa capacité à supprimer l’ostéoclastogenèse induite par RANKL par modulation de la signalisation Notch. À l’aide de macrophages dérivés de la moelle osseuse, nous avons effectué des évaluations in vitro complètes de la cytotoxicité, de la différenciation et des tests fonctionnels. Des analyses de l’expression des gènes et des protéines à l’aide de la qPCR et du western blot ont été utilisées pour élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents. L’efficacité in vivo a été corroborée à l’aide d’un modèle de résorption osseuse induite par des lipopolysaccharides murins. LY900009 inhibé la formation et la fonction résorptive des ostéoclastes induits par RANKL de manière dose-dépendante sans cytotoxicité à des concentrations thérapeutiques. Ce traitement a considérablement réduit le nombre d’ostéoclastes positifs à TRAP, altéré la formation de la ceinture d’actine et supprimé la dégradation de la matrice osseuse. L’expression des marqueurs ostéoclastes, notamment NFATc1, c-Fos, cathepsine K et TRAP, a été nettement régulée à la baisse. Mécaniquement, LY900009 perturbé la signalisation Notch et les voies MAPK/Akt en aval. L’administration in vivo a considérablement réduit la destruction osseuse induite par le LPS, améliorant les paramètres osseux et réduisant la présence d’ostéoclastes. Ces résultats démontrent que LY900009 inhibe efficacement l’ostéoclastogenèse et la résorption osseuse en modulant l’axe de signalisation Notch/MAPK/Akt, ce qui en fait un candidat thérapeutique prometteur pour les troubles ostéolytiques.

Introduction

L’homéostasie osseuse constitue un paradigme physiologique superbement orchestré chez les vertébrés, harmonisé par l’équilibre délicat entre la formation osseuse médiée par les ostéoblastes et la résorption osseuse induite par les ostéoclastes1. Cet équilibre complexe maintient l’intégrité squelettique, la résilience biomécanique et la fidélité métabolique tout au long de la vie, répondant de manière dynamique aux exigences mécaniques, aux perturbations endocriniennes et aux défis pathologiques2. Le cycle de remodelage osseux implique des phases séquentielles d’activation, de résorption, de transition, de formation et de termination, chacune régie par des cascades moléculaires complexes qui assurent la synchronisation spatio-temporelle des activités cellulaires3.

La perturbation de ce mécanisme homéostatique, en particulier par une activité excessive des ostéoclastes ou une fonction ostéoblastique inadéquate, précipite une perte osseuse pathologique, caractéristique de nombreux troubles ostéolytiques 4,5. Ces affections englobent un large éventail de maladies, notamment l’ostéoporose postménopausique et sénescente, la polyarthrite rhumatoïde, l’arthrite inflammatoire, l’atteinte osseuse néoplasique, la maladie de Paget et les troubles parodontaux6. Les manifestations cliniques d’une résorption osseuse excessive comprennent un risque accru de fracture, une déformation squelettique, une douleur chronique, une incapacité fonctionnelle et un fardeau important pour les soins de santé 6,7. Les mesures épidémiologiques contemporaines indiquent que l’ostéoporose touche à elle seule plus de 200 millions de personnes dans le monde, les fractures associées entraînant une morbidité, une mortalité et des coûts économiques importants dépassant des milliards de dollars par an 7,8.

Les ostéoclastes se manifestent par des cellules géantes multinucléées hautement spécialisées dérivées de précurseurs hématopoïétiques de la lignée phagocytaire mononucléaire, en particulier des macrophages dérivés de la moelle osseuse9. Leur formation représente un processus complexe en plusieurs étapes qui nécessite la coordination précise des signaux extracellulaires, des cascades de signalisation intracellulaires et des programmes transcriptionnels10. Les cytokines essentielles régissant l’ostéoclastogenèse comprennent l’activateur de récepteur du ligand du facteur nucléaire κB (RANKL) et le facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF), qui se lient à leurs récepteurs respectifs RANK et c-Fms pour initier des programmes de différenciation11. L’interaction RANKL-RANK déclenche l’activation de plusieurs voies de signalisation en aval, y compris les protéines kinases activées par les mitogènes (MAPK), le facteur nucléaire κB (NF-κB), la phosphoinositide 3-kinase/protéine kinase B (PI3K/Akt) et les voies calcium/calcineurine, qui convergent vers le facteur nucléaire des cellules T activées cytoplasmique 1 (NFATc1), le régulateur transcriptionnel principal de l’ostéoclastogenèse 10,11,12.

Parmi les différents mécanismes de régulation qui contrôlent la biologie des ostéoclastes, la signalisation Notch est apparue comme un modulateur critique avec des fonctions complexes et dépendantes du contexte13. La voie Notch est un système de communication cellule-cellule conservé au cours de l’évolution qui régit la détermination, la différenciation, la prolifération et l’apoptose des cellules à travers divers tissus et stades de développement14. Chez les mammifères, quatre récepteurs Notch (Notch1-4) interagissent avec cinq ligands canoniques (Delta-like 1, 3 et 4, et Jagged 1 et 2) pour médier la signalisation intercellulaire. L’activation de la voie implique la liaison de ligands, des changements conformationnels et un clivage protéolytique séquentiel par les métalloprotéases ADAM et le complexe γ-sécrétase, qui libère finalement le domaine intracellulaire Notch (NICD) pour la translocation nucléaire et la régulation transcriptionnelle des gènes cibles, y compris les familles Hes et Hey14,15. Le rôle de la signalisation Notch dans l’ostéoclastogenèse reste controversé et semble dépendre fortement du contexte, les études rapportant à la fois des effets stimulants et inhibiteurs en fonction des sous-types de récepteurs spécifiques, de la disponibilité des ligands, du microenvironnement cellulaire et des conditions expérimentales 16,17,18.

Les approches thérapeutiques dominantes pour les maladies ostéolytiques se concentrent principalement sur les stratégies anti-résorptives, notamment les bisphosphonates, le dénosumab (inhibiteur de RANKL), les modulateurs sélectifs des récepteurs des œstrogènes et la calcitonine 7,8,19. Bien que ces traitements réduisent efficacement le risque de résorption osseuse et de fracture, ils sont associés à des limites importantes, notamment la toxicité gastro-intestinale, l’ostéonécrose de la mâchoire, les fractures atypiques, le risque accru d’infection et les préoccupations concernant l’innocuité à long terme. De plus, ces agents peuvent supprimer excessivement le renouvellement osseux, compromettant potentiellement la qualité des os et les mécanismes de réparation. Par conséquent, il existe un besoin clinique urgent de nouveaux agents thérapeutiques capables d’inhiber sélectivement l’activité pathologique des ostéoclastes tout en minimisant les effets indésirables et en préservant la capacité physiologique de remodelage osseux 8,14.

Les inhibiteurs de la γ-sécrétase représentent une classe prometteuse de composés ayant des applications potentielles dans les maladies ostéolytiques grâce à la modulation de la signalisation Notch14,20. Ces agents ont été largement étudiés en oncologie et dans la recherche sur les maladies neurodégénératives, et plusieurs composés ont fait l’objet d’essais cliniques pour la maladie d’Alzheimer et divers cancers. LY900009, un inhibiteur puissant et sélectif de la γ-sécrétase, a démontré des propriétés pharmacologiques favorables, notamment une spécificité élevée, une biodisponibilité et un profil d’innocuité gérable dans des études préliminaires21,22. Cependant, ses effets spécifiques sur l’ostéoclastogenèse induite par RANKL et son utilité thérapeutique potentielle dans les maladies ostéolytiques restent incomplètement caractérisés. Cette étude a été conçue pour évaluer si LY900009 pourrait inhiber l’ostéoclastogenèse en perturbant la signalisation Notch, offrant potentiellement une nouvelle approche thérapeutique pour les maladies ostéolytiques. Nous avons développé des protocoles complets pour évaluer leurs effets sur la formation des ostéoclastes, l’activité de résorption osseuse, les voies de signalisation et l’efficacité in vivo dans des modèles de perte osseuse inflammatoire.

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Protocole

Toutes les procédures sur les animaux ont été menées conformément aux directives de l’établissement et ont été approuvées par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’hôpital central affilié à la Shandong First Medical University (numéro d’approbation IACUC-2024-015). L’étude a respecté les principes éthiques établis pour la recherche sur les animaux et les directives ARRIVE, y compris l’hébergement des animaux dans des cages standard (5 souris/cage, cycle lumière/obscurité de 12 heures, nourriture/eau ad libitum ) et la randomisation en groupes

1. Isolement et culture de macrophages dérivés de la moelle osseuse

  1. Euthanasier des souris C57BL/6 mâles âgées de 5 semaines (n = 5 par isolement) en les plaçant dans une chambre de CO2 avec un débit de 30 % du volume de la chambre par minute pendant 5 minutes. Confirmer la mort par luxation cervicale.
  2. Vaporisez la souris avec de l’éthanol à 70 %. Faites une incision médiane du pubis au sternum à l’aide de ciseaux stériles. Retirer les fémurs et les tibias de manière aseptique. Placez les os dans du PBS stérile sur de la glace.
  3. Nettoyez les os des tissus mous à l’aide de gaze stérile. Coupez les deux extrémités des os avec des ciseaux stériles. Rincer la moelle à l’aide d’une aiguille de 25 G avec 10 ml de α-MEM froid par souris. Passez la suspension cellulaire dans une crépine de 70 μm.
  4. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Mettre en suspension les pastilles dans du α-MEM contenant 10 % de FBS et 33,3 ng/mL DE M-CSF. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre à l’exclusion du bleu trypan. Plaque à 2 x 106 cellules/mL dans des flacons T75.
  5. Maintenir les cultures à 37 °C dans une atmosphère à 5 % de CO2 avec des changements de milieu toutes les 48 h.
  6. Récoltez 1x 106 cellules. Laver avec du PBS contenant 2 % de FBS. Incuber avec l’anti-CD11b-FITC (1:100) et l’anti-F4/80-PE (1:100) pendant 30 min à 4 °C dans l’obscurité. Analysez par cytométrie en flux à l’aide de la stratégie de déclenchement suivante : Tout d’abord, les cellules de porte basées sur la diffusion directe (FSC) et la diffusion latérale (SSC) pour exclure les débris et sélectionner les cellules viables. Deuxièmement, il faut éliminer les cellules CD11b positives de la population cellulaire viable. Troisièmement, à partir de cellules CD11b positives, les cellules F4/80 positives identifient les macrophages doublement positifs CD11b+/F4/80+ . Définissez des portes basées sur des commandes non tachées et des commandes unicolores. Ne poursuivez que si >95 % des cellules sont CD11b+/F4/80+.

2. Évaluation de la cytotoxicité

  1. Grainez des macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMM) à 1 x 104 cellules par puits dans des plaques de 96 puits en utilisant 100 μL de milieu par puits. Laisser les cellules adhérer pendant 4 h à 37 °C.
  2. Préparez LY900009 dilutions dans un milieu complet : 0, 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 3,2, 6,4, 12,8, 25,6 μM. Retirez l’ancien milieu. Ajouter 100 μL de milieu de traitement par puits. Préparez des triplets pour chaque concentration.
  3. Incuber pendant 24 h, 48 h ou 96 h. Retirez complètement le milieu de culture. Ajouter 100 μL de milieu frais contenant 10 % de réactif CCK-8 (10 μL de CCK-8 dans 90 μL de milieu). Incuber pendant exactement 2 h à 37 °C. Utilisez un lecteur de microplaques pour mesurer l’absorbance à 450 nm avec une référence à 650 nm.
  4. Calculez IC50 à l’aide de GraphPad Prism. Logiciel ouvert, concentration d’entrée (axe X) et pourcentage de viabilité (axe Y). Sélectionnez Analyser > Régression non linéaire > Dose-réponse > Inhibition > log(inhibiteur) en fonction de la réponse avec pente variable. Définissez les contraintes : Bas = 0, Haut = 100. Enregistrez la CI50 avec un intervalle de confiance de 95 %.

3. Différenciation des ostéoclastes et coloration TRAP

  1. Grainez des macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMM) à 1 x 104 cellules par puits dans des plaques de 96 puits. Culture pendant la nuit dans du α-MEM avec 10 % de FBS et 33,3 ng/mL DE M-CSF.
  2. Remplacer le milieu par 100 μL de milieu de différenciation : α-MEM contenant 10 % de FBS, 33,3 ng/mL DE M-CSF, 100 ng/mL de RANKL et LY900009 (0, 100, 200, 400 nM). Préparez des quadruples pour chaque condition.
  3. Remplacer le milieu toutes les 48 h par un milieu de différenciation frais. Continuer pendant 6 jours. Surveiller quotidiennement à l’aide d’un microscope inversé à 100x la formation d’ostéoclastes.
  4. Retirer tout le milieu par aspiration. Laver une fois avec 200 μL de PBS. Ajouter 100 μL de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS. Incuber pendant exactement 15 minutes à température ambiante. Retirer le fixateur. Laver 3 fois avec 200 μL de PBS.
  5. Préparez la solution de coloration TRAP : Mélangez 50 mL de tampon d’acétate de sodium 0,1 M (pH 5,0), 10 mL de tartrate de sodium 50 mM, 1 mL de phosphate de naphtol AS-MX de 5 mg/mL dans du diméthylformamide et 0,5 mL de sel Fast Red Violet LB de 11 mg/mL. Filtrez à travers un filtre de 0,22 μm. Appliquer 200 μL par puits. Incuber à 37 °C pendant 30 min dans l’obscurité. Arrêtez la réaction en lavant 3 fois avec de l’eau distillée.
  6. Identifiez les ostéoclastes comme des cellules positives à TRAP (violet/rouge) contenant trois noyaux ou plus. Comptez à l’aide d’un microscope inversé à un grossissement de 100x. Photographiez cinq champs aléatoires par puits.
  7. Quantifiez à l’aide d’ImageJ. Cliquez sur l’image > Convertir en 8 bits (Type de > d’image > 8 bits) > Définir le seuil (Image > Ajuster > Seuil) > Sélectionner les zones positives TRAP > Analyser les particules (Analyser > Analyser les particules : taille 100-Infinity μm2, circularité 0-1.0) > Exporter les résultats vers Excel 23.

4. Essai de résorption osseuse fonctionnelle

  1. Cultures BMM en plaques à six puits (2 x 105 cellules/puits) avec du M-CSF pendant 24 h. Ajouter RANKL (100 ng/mL) pour induire la formation de pré-ostéoclastes pendant 3 jours.
  2. Prélever des cellules à l’aide de 0,25 % de trypsine-EDTA pendant 5 min à 37 °C. Neutraliser avec un support complet. Comptez les cellules viables à l’aide du bleu trypan.
  3. Ensemencer 1 x 104 pré-ostéoclastes par puits sur des plaques de 96 puits recouvertes d’hydroxyapatite. Laisser la fixation pendant 4 h.
  4. Traiter avec du M-CSF (33,3 ng/mL), du RANKL (100 ng/mL) et du LY900009 (0, 100, 200, 400 nM) pendant 4 jours. Changez de support tous les 2 jours.
  5. Retirer les cellules à l’aide d’un agent de Javel à 10 % pendant 10 min. Laver 5 fois à l’eau distillée. Sécher complètement à l’air.
  6. Visualisez les fosses de résorption à l’aide d’un lecteur d’imagerie automatisé à un grossissement de 4x. Capturez toute la zone du puits. Quantifiez la surface résorbée en pourcentage de la surface totale à l’aide d’ImageJ.

5. Microscopie par immunofluorescence

  1. Cultiver des ostéoclastes sur des lamelles de verre en plaques de 24 puits pendant 5 à 7 jours, comme décrit à l’étape 3.
  2. Fixer avec 4 % de paraformaldéhyde pendant 15 min. Perméabiliser avec 0,1 % de Triton X-100 dans du PBS pendant 10 min. Bloc avec 1 % de BSA dans du PBS pendant 1 h à température ambiante.
  3. Incuber avec de la rhodamine-phalloïdine (1:200) dans un tampon bloquant pendant 45 min à température ambiante dans l’obscurité. Contre-coloration des noyaux avec du DAPI (1 μg/mL) pendant 10 min.
  4. Montez les lamelles sur les glissières à l’aide d’un support de montage anti-décoloration. Examinez à l’aide d’un microscope à fluorescence à un grossissement de 200x. Mesurez la surface du cycle d’actine à l’aide d’ImageJ.

6. Analyse PCR quantitative en temps réel

  1. Extraire l’ARN total de 2 x 106 cellules à l’aide d’un réactif d’extraction d’ARN. Homogénéiser par pipetage. Incuber 5 min à température ambiante.
  2. Ajouter 200 μL de chloroforme. Agiter vigoureusement pendant 15 s. Incuber 3 min. Centrifugeuse à 12 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
  3. Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube. Ajouter 500 μL d’isopropanol. Mélangez délicatement. Incuber 10 min à température ambiante. Centrifugeuse à 12 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
  4. Laver les granulés avec 1 mL d’éthanol à 75 %. Sécher à l’air libre pendant 10 min. Dissoudre dans 30 μL d’eau exempte de RNase. Mesurer la concentration à l’aide d’un spectrophotomètre (exiger un rapport A260/A280 >1,8).
  5. Synthétisez l’ADNc à l’aide de 1 μg d’ARN avec le kit de transcription inverse selon le protocole du fabricant.
  6. Préparez des réactions qPCR : 10 μL de Master Mix, 1 μL d’ADNc, 0,5 μL de chaque amorce (10 μM), 8 μL d’eau. Fonctionnement sur système de PCR en temps réel : 95 °C pendant 10 min, puis 40 cycles de 95 °C pendant 15 s et 60 °C pendant 60 s. Calculer l’expression relative à l’aide de la méthode 2-ΔΔCt avec GAPDH comme gène de référence.

7. Analyse par transfert Western

  1. Lyser les cellules dans un tampon RIPA contenant des inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase sur de la glace pendant 30 min. Centrifugeuse à 14 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
  2. Déterminer la concentration en protéines à l’aide du dosage de l’ACB selon les instructions du fabricant. Préparez des échantillons de protéines de 30 μg dans le tampon de chargement. Faire bouillir pendant 5 min.
  3. Chargez les échantillons sur des gels SDS-PAGE à 10 %. Fonctionnement à 80 V pendant 30 min, puis à 120 V pendant 90 min. Transfert sur des membranes PVDF à 100 V pendant 90 min dans un tampon de transfert à froid.
  4. Bloquez les membranes avec 5 % de lait écrémé dans une solution saline tamponnée Tris avec 0,1 % de Tween-20 (TBST) pendant 1 h à température ambiante avec un léger basculement.
  5. Incuber avec les anticorps primaires détaillés dans le tableau des matériaux (1:1000) pendant la nuit à 4 °C avec un léger balancement. Laver 3 fois avec du TBST pendant 10 minutes chacune.
  6. Incuber avec des anticorps secondaires conjugués à la HRP (1:5000) pendant 1 h à température ambiante. Laver 3 fois avec TBST.
  7. Détecter à l’aide du réactif ECL conformément aux instructions du fabricant. Capturez des images à l’aide d’un système d’imagerie infrarouge. Quantifiez l’intensité de la bande à l’aide d’ImageJ.

8. Modèle de résorption osseuse induite par le LPS in vivo

  1. Calculez la taille de l’échantillon à l’aide de G*Power 3.1 (taille de l’effet = 0,8, α = 0,05, puissance = 0,80, ce qui donne n = 5/groupe). Répartissez au hasard des souris C57BL/6 mâles de 7 à 8 semaines à des groupes à l’aide d’un générateur de nombres aléatoires. Abritez 5 souris par cage avec un cycle lumière/obscurité de 12 h, température 22 ± 2 °C, humidité 55 % ± 10 %, accès ad libitum à la nourriture standard et à l’eau.
  2. Anesthésier les souris à l’aide d’une injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique (50 mg/kg). Confirmez l’anesthésie par réflexe de pincement de l’orteil.
  3. Préparer le contrôle du véhicule : PBS contenant 1 % de DMSO. Préparer LY900009 : Faible dose (2,5 mg/kg) et dose élevée (5 mg/kg) dans le véhicule. Injecter 100 μL par voie sous-cutanée sur le calvaire à l’aide d’une aiguille de 27 G par jour pendant 14 jours. Injecter du LPS (10 mg/kg) les jours 1 et 8.
  4. Surveillez les souris 2 fois par jour pour détecter des signes de détresse. Définir des critères d’évaluation sans cruauté : perte de poids >20 %, incapacité à se déplacer, posture voûtée, toilettage réduit. Euthanasier immédiatement si les objectifs sont atteints.
  5. Euthanasier le 15e jour par surdosage de pentobarbital (100 mg/kg par voie intrapéritonéale). Récoltez les calvariae. Fixer dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 48 h à 4 °C.

9. Micro-CT et analyse histologique

  1. Scannez des calvaires fixes à l’aide d’un scanner micro-CT avec les paramètres suivants : 70 kV, 114 μA, filtre en aluminium de 0,5 mm, résolution de 9 μm, rotation de 180° avec pas de 0,4°.
  2. Reconstruisez des images à l’aide du logiciel NRecon. Analysez à l’aide du logiciel CTAn. Définissez la région d’intérêt comme une zone de 3 x 3 mm centrée sur la suture sagittale. Calculer BMD, BV/TV, Tb.N, Tb.Th.
  3. Détartrer les échantillons à 10 % d’EDTA (pH 7,4) pendant 14 jours avec des changements quotidiens. Achèvement du test de décalcification à l’aide du test à l’oxalatede calcium 24.
  4. Procédé d’enrobage de paraffine : déshydrater à travers de l’alcool gradué, clair dans du xylène, infiltrer avec de la paraffine. Coupe à 4 μm d’épaisseur à l’aide d’un microtome.
  5. Assurer l’insu : coder tous les échantillons à l’aide de numéros aléatoires à trois chiffres. Demandez à un collègue de gérer la clé de code. Effectuer toutes les analyses sans connaître les groupes de traitement. Décodez uniquement une fois la collecte des données terminée.
  6. Effectuer la coloration H&E : déparaffiniser, réhydrater, colorer à l’hématoxyline pendant 5 min, différencier dans l’alcool acide, colorer à l’éosine pendant 2 min, déshydrater et monter.
  7. Effectuez la coloration TRAP comme à l’étape 3.5. Comptez les cellules multinucléées positives à TRAP le long de la surface de l’os. Exprimer en nombre par mm de périmètre osseux.

10. Analyse statistique

  1. Calculez la taille d’échantillon requise à l’aide de G*Power 3.1 : taille de l’effet d’entrée f=0,8, α=0,05, puissance=0,80, nombre de groupes. Notez le n minimum par groupe.
  2. Testez la normalité à l’aide du test de Shapiro-Wilk dans SPSS 28.0. Considérons p > 0,05 comme normalement distribué. Testez l’homogénéité de la variance à l’aide du test de Levene. Considérons p > 0,05 comme des variances égales.
  3. Appliquez des tests appropriés basés sur la distribution : pour des données normales avec des variances égales, utilisez des tests paramétriques. Pour les deux groupes, appliquez le test t de Student non apparié. Pour plusieurs groupes, utilisez l’ANOVA à un facteur.
  4. Effectuer une analyse a posteriori : pour une ANOVA significative (p<0,05), appliquez le test de différence honnêtement significative de Tukey pour toutes les comparaisons par paires.
  5. Utilisez des alternatives non paramétriques pour les données non normales : appliquez le test U de Mann-Whitney pour deux groupes et le test de Kruskal-Wallis avec le post hoc de Dunn pour plusieurs groupes.
  6. Calculer les tailles d’effet : d de Cohen pour les t-tests, eta partiel au carré pour l’ANOVA.
  7. Indiquez les valeurs p exactes à trois décimales et à des intervalles de confiance de 95 %. Présenter les données normales sous forme de moyenne ± d’écart-type, non normales comme médiane (écart interquartile).
  8. Considérons p < 0,05 statistiquement significatif. Appliquez la correction de Bonferroni lorsque plusieurs comparaisons sont effectuées.

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Résultats

La mise en œuvre réussie de ce protocole a révélé que LY900009 exerçaient de puissants effets inhibiteurs sur la formation et la fonction des ostéoclastes par le biais de multiples mécanismes interconnectés. L’évaluation initiale de la cytotoxicité dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse a montré des augmentations de la toxicité en fonction du temps, avec des valeurs de CI50 calculées de 4,44 μM, 3,66 μM et 2,93 μM à 24 h, 48 h et 96 h, respectivement (figures 1A

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Discussion

La présente étude fournit des preuves convaincantes que LY900009 représente un agent thérapeutique prometteur pour les maladies ostéolytiques grâce à son inhibition puissante et sélective de l’ostéoclastogenèse, conformément à l’intérêt croissant pour les inhibiteurs de la γ-sécrétase pour les troubles osseux 14,20,21. Les résultats démontrent que cet inhibiteur de la γ-sécrétase supprime effica...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent ou conflit d’intérêts. Aucun auteur n’a de relation financière avec les entités commerciales mentionnées dans cet ouvrage. Tous les auteurs ont rempli les formulaires de divulgation de l’ICMJE.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier le personnel de l’hôpital central affilié à la première université médicale du Shandong et à l’hôpital populaire de Feicheng pour leur soutien technique et leur assistance au cours de cette étude. Nous apprécions également les contributions de nos collègues du laboratoire pour leurs précieuses discussions et leur aide dans le cadre de l’expérimentation animale.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaques de culture cellulaire à 24 puitsCorning3524Microscopie par immunofluorescence
Plaques de culture cellulaire à 6 puitsCorning3516Culture cellulaire et western blot
70 % d’éthanolSigma-AldrichE7023Stérilisation et désinfection
75 % d’éthanolSigma-AldrichE7148Tampon de lavage d’ARN
Plaques de culture cellulaire à 96 puitsCorning3596Culture cellulaire et dosages
Filtre en aluminium (0,5 mm)BrukerN/AFiltre à balayage Micro-CT
Anticorps anti-CD11b-FITCBioLégende101206Cytométrie en flux - marqueur de macrophage
Anticorps anti-Notch1 clivé (monoclonal de lapin)Technologie de signalisation cellulaireN° 4147SWestern blot - Signalisation à encoche
Anticorps anti-F4/80-PEBioLégende123108Cytométrie en flux - marqueur de macrophage
Support de montage anti-décolorationLaboratoires VecteursH-1000Montage en microscopie à fluorescence
Anticorps anti-Hes1 (monoclonal de lapin)Technologie de signalisation cellulaireLES 11988Western blot - Encoche cible en aval
Anticorps anti-NFATc1 (monoclonal de souris)Biotechnologie de Santa CruzSC-7294Western blot - ostéoclaste maître régulateur
Anticorps anti-phospho-Akt (Ser473)Technologie de signalisation cellulaireANNÉES 4060Western blot - Signalisation PI3K/Akt
Anticorps anti-phospho-ERK1/2 (Thr202/Tyr204)Technologie de signalisation cellulaireANNÉES 4370Western blot - signalisation MAPK
Anti-phospho-NF-&kappa ; Anticorps B p65 (Ser536)Technologie de signalisation cellulaire3033SWestern blot - NF-&kappa ; Signalisation B
Anticorps anti-phospho-p38 MAPK (Thr180/Tyr182)Technologie de signalisation cellulaire4511SWestern blot - p38 Signalisation MAPK
Anticorps anti-&bêta-actine (monoclonal de souris)Technologie de signalisation cellulaireANNÉES 4970Contrôle de la charge par transfert Western
Lecteur d’imagerie automatiséDispositifs moléculairesImageXpress MicroQuantification de la fosse de résorption
Kit de dosage des protéines BCAPierce/Thermo Fisher23225Détermination de la concentration en protéines
Eau de Javel (10 % d’hypochlorite de sodium)Sigma-Aldrich425044Retrait de cellules des plaques de résorption
BSA (albumine sérique bovine)Sigma-AldrichA7906Tampon bloquant pour l’immunofluorescence
C57BL/6 souris (mâle, 5-8 semaines)Laboratoires Charles River27Isolement in vitro du BMM et études in vivo
Réactif de test à l’oxalate de calciumSigma-AldrichC0350Essai d’achèvement de la décalcification
Réactif CCK-8 (Cell Counting Kit-8)Dojindo Technologies moléculairesCK04Évaluation de la viabilité cellulaire
Crépine cellulaire (70 &mu ; m)BD Faucon352350Filtration cellulaire de la moelle osseuse
Centrifugeuse (réfrigérée)Eppendorf5424RPréparation des cellules et des échantillons
ChloroformeSigma-AldrichRéf. C2432Séparation de phase d’extraction de l’ARN
Chambre CO2Euthanex CorpEX-075Euthanasie animale
Logiciel CTAnBrukerVersion 1.20Analyse d’images par micro-tomodensitométrie
DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole)Sigma-AldrichD9542Contre-coloration nucléaire
Diméthylformamide (DMF)Sigma-AldrichD4551Solvant de coloration TRAP
DMSO (Diméthylsulfoxyde)Sigma-AldrichD2650Préparation du contrôle du véhicule
Substrat de transfert Western ECLPierce/Thermo Fisher32106Détection de protéines dans le western blot
EDTA (10 %, pH 7,4)Sigma-AldrichE6758Solution de détartrage
Eosine YSigma-AldrichE4009H& E coloration histologique
Sel Fast Red Violet LBSigma-AldrichRéf. F3381TRAP coloration chromogène
Sérum fœtal bovin (FBS)Gibco/Thermo Fisher16140-071Supplément de culture cellulaire
Cytomètre en fluxBD BiosciencesFACSCaliburCaractérisation BMM
Microscope à fluorescenceOlympeIX73Imagerie par immunofluorescence
Logiciel G*PowerUniversité Heinrich HeineVersion 3.1Analyse statistique de la puissance
Lamelles en verre (22 × ; 22 mm)Fisher Scientific12-541-BMicroscopie par immunofluorescence
Prisme GraphPadLogiciel GraphPadVersion 9.0Calcul et graphique IC50
HématoxylineSigma-AldrichN° H3136H& E coloration histologique
HémocytomètreHausser Scientific3200Comptage cellulaire
Kit de transcription inverse d’ADNc haute capacitéBiosystèmes appliqués4368814Synthèse de l’ADNc à partir de l’ARN
IgG anti-souris conjuguées HRPTechnologie de signalisation cellulaireLES 7076SAnticorps secondaire par transfert Western
IgG anti-lapin conjuguées à la HRPTechnologie de signalisation cellulaireLE 7074SAnticorps secondaire par transfert Western
Plaques à 96 puits recouvertes d’hydroxyapatiteCorning BioCoat354651Essai fonctionnel de résorption osseuse
ImageJNIHVersion 1.53eAnalyse et quantification d’images
Incubateur (CO2)Thermo Fisher51033058Maintenance de la culture cellulaire
Système d’imagerie infrarougeBio-RadChemiDoc MPDétection par transfert Western
Microscope inverséOlympeCKX41Suivi de cultures cellulaires, comptage TRAP
IsopropanolSigma-AldrichI9516Précipitation de l’ARN
LPS (lipopolysaccharide d’E. coli)Sigma-AldrichN° L4391Résorption osseuse inflammatoire in vivo
LY900009 (inhibiteur de la &gamma ;-sécrétase)Produits chimiques SelleckS7999Composé d’essai - inhibiteur de l’ostéoclaste
M-CSF (facteur de stimulation des colonies de macrophages)R& D Systèmes416-ML-010Survie des macrophages et différenciation des ostéoclastes
Scanner Micro-CTBrukerSkyScan 1272Analyse de la microarchitecture osseuse
Lecteur de microplaquesBioTekSynergie H1Mesures d’absorbance (CCK-8)
MicrotomeLeicaRM2255Sectionnement histologique
Naphtol AS-MX phosphateSigma-AldrichN5000Substrat de coloration TRAP
Aiguilles (25G, 27G)BD305122, 305109Rinçage de la moelle osseuse, injections
Logiciel NReconBrukerVersion 1.7Reconstruction d’images par micro-tomodensitométrie
ParaffineSigma-AldrichRéf. P3683Enrobage tissulaire
Paraformaldéhyde (4 %)Sigma-AldrichRéf. P6148Fixation cellulaire et tissulaire
PBS (solution saline tamponnée au phosphate)Gibco/Thermo Fisher14190-144Lavage cellulaire et préparation de tampons
Pentobarbital sodiqueSigma-AldrichRéf. P3761Anesthésie animale et euthanasie
Cocktail d’inhibiteurs de la phosphataseRoche4906837001Préservation de la phosphorylation
PowerUp SYBR Green Master MixBiosystèmes appliquésN° A25742PCR quantitative en temps réel
Cocktail d’inhibiteurs de protéaseRoche11697498001Prévention de la dégradation des protéines
membrane PVDF (0,45 &mu ; m)Bio-Rad1620177Transfert de protéines Western blot
RANKL (activateur du récepteur de NF-&kappa ; B Ligand)R& D Systèmes462-TEC-010Induction de la différenciation des ostéoclastes
Système PCR en temps réelBiosystèmes appliqués7500 RapideAnalyse quantitative de l’expression génique
Rhodamine-phalloïdineInvitrogen/Thermo FisherR415Visualisation de l’actine F
Tampon RIPATechnologie de signalisation cellulaire9806SExtraction des protéines
Eau sans RNaseAmbion/Thermo FisherRéférence AM9937Dissolution de l’ARN et PCR
Gels SDS-PAGE (10 %)Bio-Rad4561036Séparation des protéines par transfert Western
Lait écrémé en poudreBio-Rad1706404Blocage par transfert Western
Tampon d’acétate de sodium (0,1 M, pH 5,0)Sigma-AldrichS2889Tampon de coloration TRAP
Tartrate de sodium (50 mM)Sigma-AldrichS4297Spécificité de coloration TRAP
SpectrophotomètreThermo FisherNanoDrop 2000Mesure de la concentration en ARN/protéines
SPSSSociété IBMVersion 28.0Analyse statistique
Seringues (1 mL, 10 mL)BD309659, 309604Rinçage de la moelle osseuse, injections
Fioles de culture cellulaire T75Corning430641Culture primaire du BMM
TBST (solution saline tamponnée au tris avec 0,1 % de Tween-20)Bio-Rad1706531Tampon de lavage Western blot
Tampon de transfertBio-Rad1704270Transfert de protéines Western blot
Triton X-100Sigma-AldrichRéf. T8787Perméabilisation cellulaire
Réactif TRIzolInvitrogen/Thermo Fisher15596026Extraction totale de l’ARN
Bleu trypan (0,4 %)Sigma-AldrichRéf. T8154Évaluation de la viabilité cellulaire
Trypsine-EDTA (0,25 %)Gibco/Thermo Fisher25200-056Prélèvement et détachement de cellules
Système de transfert par transfert WesternBio-RadTrans-Blot TurboTransfert de protéines vers la membrane
XylèneSigma-AldrichX3750Traitement et nettoyage des tissus
&alpha ;-MEM (Alpha Minimum Essential Medium)Gibco/Thermo Fisher12561-056Milieu de culture cellulaire

Références

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