Shrinky-gouttes pendantes Dink: une façon simple de formulaire et de la Culture corps embryoïdes

Résumé

Nous montrons une méthode simple et rapide à charger pré-défini le nombre de cellules dans des puits microfabriqué et de les maintenir pour le développement du corps embryoïdes.

Résumé

Corps embryoïdes (EB) sont des agrégats de cellules souches embryonnaires. La façon la plus commune de créer ces agrégats est la méthode la goutte suspendue, une approche laborieuse de pipetage un nombre arbitraire de cellules dans des plaques bien. Les interactions entre les cellules souches contraints à proximité les uns des autres favorise la génération de l'EBS. Parce que les médias dans chacun des puits doit être manuellement échangés chaque jour, cette approche est manuellement intensives.

Par ailleurs, parce que les paramètres environnementaux, y compris cellule-cellule, les interactions de facteurs cellulaires solubles, le pH, l'oxygène et la disponibilité peuvent être des fonctions de la taille de EB, les populations cellulaires obtenues à partir traditionnelle gouttes suspendues peut varier considérablement, même quand elles sont cultivées dans des conditions identiques. Des études récentes ont en effet montré que le nombre initial de cellules formant l'agrégat peut avoir des effets significatifs sur la différenciation des cellules souches. Nous avons développé une méthode de culture simple, rapide et évolutive pour charger pré-défini le nombre de cellules dans des puits microfabriqué et de les maintenir pour le développement du corps embryoïdes. Enfin, ces cellules sont facilement accessibles pour une analyse plus approfondie et d'expérimentation. Cette méthode se prête à n'importe quel laboratoire et ne nécessite aucun équipement dédié. Nous démontrons cette méthode en créant des corps embryoïdes en utilisant une ligne rouge fluorescente de cellules de souris (129S6B6-F1).

Protocole

1. Faire Shrinky-Mold Dink

1. Imprimez le motif désiré sur Shrinky-dink feuille en utilisant une imprimante de bonne définition.
2. Cuire Shrinky-dink feuille à 163 ° C pendant environ 10 minutes, ou jusqu'à ce que tout rétréci et ayant acquis une forme régulière.
3. Après Shrinky-dink moule a refroidi, le plonger dans un bain d'isopropanol jusqu'à ce que la surface totale est à peine couverts.
4. Soigneusement, vaporiser un peu d'acétone sur le moule et secouer le récipient à quelques reprises. Ajouter plus d'isopropanol pour laver l'excès d'acétone et de répéter cette étape plusieurs fois jusqu'à Shrinky-m....

Discussion

Nous avons développé une méthode de culture simple, rapide et évolutive pour charger pré-défini le nombre de cellules dans des puits microfabriqué (moulés à partir de Shrinky-Dinks) et de les maintenir pour le développement du corps embryoïdes. Enfin, ces cellules sont facilement accessibles pour une analyse plus approfondie et d'expérimentation. Cette méthode se prête à n'importe quel laboratoire et ne nécessite aucun équipement dédié, parce que nous parer à la nécessité pour la photolithographie. Nous pouvons varier la taille des .......

Matériaux

Pour les médias MESC (McCloskey laboratoire de protocole): (pour les médias totale préparée: 50ml; 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml KSR 15%: 7,5 ml; 15ml 1x Penn-Strep: 0,5 ml; 1ml 2mM de L-glutamine: 0,5 ml; 1ml NEAA: 0,5 ml; 1ml FRV: 100 ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100ul dilué BME:. 50ul; 100ul (Ajouter 35ul de BME filtrée stérile pour 5ml de PBS et de seringues stériliser par filtration Jeter après 2 semaines. concentration finale dans la solution est 0,1 mM)