Article de méthode

Un modèle murin néonatal d’entérocolite nécrosante et d’isolement de la lamina propria pour le profilage des cellules immunitaires

DOI :

10.3791/69233

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19 septembre 2025

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1Division of Neonatal-Perinatal Medicine, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Division of Pediatric Gastroenterology, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit un modèle murin néonatal d’entérocolite nécrosante (ECN) et l’isolement ultérieur des cellules immunitaires de la lamina propria de l’intestin grêle murin néonatal.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’entérocolite nécrosante (ECN) est une maladie inflammatoire grave de l’intestin néonatal, affectant principalement les prématurés. L’ECN se caractérise par une lésion épithéliale, une dysbiose microbienne et une réponse immunitaire dérégulée, entraînant souvent une nécrose intestinale et une inflammation systémique. Des modèles murins expérimentaux qui récapitulent les aspects clés de la maladie humaine ont été essentiels pour faire progresser notre compréhension des mécanismes qui régissent la maladie et éclairent le développement thérapeutique. Ce protocole décrit un modèle murin néonatal bien établi d’entérocolite nécrosante (ECN) utilisant l’alimentation au lait maternisé, l’hypoxie intermittente, l’administration orale de lipopolysaccharide (LPS) et des bactéries entériques cultivées à partir d’un nourrisson atteint d’ECN. Cette combinaison induit de manière fiable des caractéristiques histologiques, transcriptionnelles et immunologiques compatibles avec l’ECN chez les nourrissons humains et a été fondamentale dans de nombreuses découvertes clés dans le domaine. De plus, ce protocole décrit l’isolement des cellules immunitaires de la lamina propria de l’intestin grêle de souris néonatales. L’isolement cellulaire de la lamina propria permet un profilage détaillé des cellules immunitaires par cytométrie en flux, facilitant ainsi l’analyse des populations de cellules innées et adaptatives dans l’intestin.

Introduction

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L’entérocolite nécrosante (ECN) est une maladie inflammatoire grave de l’intestin qui affecte presque exclusivement les nouveau-nés prématurés. Environ 7 à 8 % des nourrissons de très faible poids à la naissance (<1500 g) seront touchés par l’ECN, et les taux de mortalité associés à la maladie peuvent approcher les 50 % chez les nouveau-nés nécessitant une intervention chirurgicale1. La pathogenèse de l’ECN reste incomplètement comprise ; cependant, les preuves actuelles suggèrent que l’ECN résulte de la confluence de plusieurs facteurs, notamment une barrière intestinale immature, une signalisation immunitaire dérégulée et un microbiome dysbiotique 2,3,4. La convergence de ces facteurs peut initier et exacerber les réponses inflammatoires dans l’intestin, notamment par l’activation du récepteur 4 de type Toll (TLR4), entraînant des lésions épithéliales et divers types de mort cellulaire, y compris l’apoptose et la nécrose 5,6. L’objectif de ce protocole est de présenter un modèle murin reproductible et physiologiquement pertinent de NEC qui récapitule l’inflammation intestinale et la pneumatose intestinale (gaz dans la paroi intestinale) observées chez les nouveau-nés humains, permettant une investigation mécaniste de la pathogenèse de la maladie. De plus, ce protocole décrit l’isolement des cellules immunitaires de la lamina propria de l’intestin grêle de souris néonatales, ce qui permet aux chercheurs d’effectuer le profilage des cellules immunitaires par cytométrie en flux.

Par rapport aux modèles animaux plus grands, tels que les rats ou les porcelets nouveau-nés 7,8, les modèles de souris néonatales offrent plusieurs avantages distincts, notamment un coût inférieur, un meilleur accès aux animaux transgéniques et la possibilité d’effectuer des expériences sur des cohortes plus grandes. Les modèles murins d’ECN utilisent principalement une combinaison d’alimentation au lait maternisé, de stress dû au froid et d’hypoxie pour simuler la physiopathologie complexe de l’ECN observée chez les patients humains 7,8,9. Cependant, de nombreux modèles murins d’ECN sont limités par leur dépendance à l’égard de facteurs de stress microbiens larges ou d’altérations artificielles du microbiote, ce qui peut compromettre leur pertinence clinique. En revanche, le modèle décrit dans ce protocole surmonte ces limites en intégrant plusieurs facteurs clés impliqués dans la pathogenèse des ECN chez les nourrissons humains10,11. Plus précisément, ce modèle combine le stress hypoxique, qui a été impliqué dans la perturbation de l’intégrité de la barrière intestinale 3,12, avec l’administration orale de préparations pour nourrissons complétées par du lipopolysaccharide (LPS), un ligand TLR4 bien caractérisé qui induit une inflammation intestinale, ainsi qu’un microbiome dysbiotique cliniquement pertinent avec des bactéries entériques cultivées chez un patient atteint de NEC totalis, la forme la plus grave de la maladie, caractérisée par une pan-nécrose de l’intestin10,13. En intégrant ces facteurs de stress cliniquement pertinents et spécifiques à la maladie, notre modèle reflète avec précision les caractéristiques cliniques et moléculaires de l’ECN. De plus, afin de fournir aux chercheurs un cadre pour interroger les mécanismes immunitaires sous-jacents à la pathogenèse de l’ECN, ce protocole décrit l’isolement des cellules de la lamina propria de l’intestin grêle murin néonatal pour l’analyse par cytométrie en flux. En tant que principal site de l’activité immunitaire de la muqueuse intestinale, la lamina propria contient un répertoire dynamique de cellules immunitaires résidentes et infiltrantes qui jouent un rôle central dans l’inflammation associée aux ECN14. La cytométrie en flux fournit une plate-forme robuste et évolutive pour caractériser ces populations de cellules immunitaires à haute résolution, permettant une analyse détaillée des phénotypes cellulaires, la quantification des réponses immunitaires et l’identification des signatures immunologiques impliquées dans la pathogenèse des NEC15.

Le modèle d’ECN murin décrit dans ce protocole complète les modèles in vitro en permettant l’étude des interactions hôte-microbiome, des réponses immunitaires et de la signalisation inflammatoire dans l’environnement complexe de l’intestin néonatal. Il reproduit des aspects clés de la pathogenèse des ECN qui ne peuvent pas être modélisés in vitro, ce qui en fait un outil précieux pour élucider les mécanismes de la maladie et évaluer les stratégies thérapeutiques. Bien que les différences entre les espèces restent une limite, ce modèle offre une plate-forme robuste et accessible pour faire progresser notre compréhension de la NEC et accélérer le développement d’interventions ciblées.

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Protocole

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Toutes les méthodes ont été réalisées conformément aux directives éthiques fournies par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Caroline du Nord à la Chapel Hill School of Medicine. Les souris ont été élevées, entretenues et logées conformément aux procédures décrites dans le Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire dans le cadre d’une proposition d’étude approuvée par l’IACUC (protocole n° 24-114) de l’Université de Caroline du Nord à la Chapel Hill School of Medicine. Les souris C57BL/6J ont été utilisées pour toutes les expériences décrites dans cette étude. Les petits ont été commencés dans le modèle au 4e jour postnatal, pesant entre 1,8 et 2,3 g ; Les animaux en dehors de cette fourchette de poids ont été exclus. Les cohortes expérimentales avaient une répartition équilibrée par sexe, les mâles et les femelles représentant chacun environ 50 % des animaux traités. Les réactifs et l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Modèle NEC murin

REMARQUE : Le stock bactérien entérique est produit par l’obtention du contenu entérique d’un nourrisson qui a eu la forme la plus grave d’ECN, NEC totalis 13,16. Le contenu entérique est cultivé pendant la nuit à 1 x g pendant 16 h à 37 °C, centrifugé à 3000 x g pendant 10 min à 4 °C et remis en suspension dans du glycérol à 50 %. Des aliquotes de 20 μL sont pipetées dans des cryoflacons et stockées à -80 °C pour un stockage à long terme. Les temps de culture sélectionnés dans ce protocole ont été choisis pour l’efficacité du flux de travail. Ces points peuvent être ajustés au besoin pour s’adapter aux calendriers de chaque laboratoire sans affecter le modèle global. De plus, ce protocole a été optimisé pour une capacité maximale de 40 souris, mais peut être mis à l’échelle selon les besoins.

  1. Préparation de la culture bactérienne
    1. Le jour expérimental 0 à 15h00, ajouter une aliquote de 20 μL de bactéries entériques cultivée sur un nourrisson atteint d’ECN totalis à un tube de culture de 15 mL contenant 2 mL de bouillon Luria-Bertani (LB). Incuber la culture bactérienne avec le couvercle du tube en position ventilée dans un agitateur orbital à 37 °C, 1 x g, pendant une nuit pendant 16 h, et incuber simultanément un tube de culture contenant seulement 2 mL de bouillon LB comme témoin pour évaluer toute contamination par LB.
      1. Confirmer visuellement la culture de nuit en comparant la turbidité entre la culture bactérienne et le témoin clair, avec LB seulement ; Ne procéder que si la culture bactérienne semble trouble et que le témoin reste clair.
    2. Le jour expérimental 1, à 7 h 00, aliquote 125 μL de la culture de nuit inoculée dans une fiole de culture cellulaire T75 avec un couvercle ventilé contenant 25 mL de bouillon LB. Préparez quatre fioles T75 au total et incubez-les en position verticale dans un agitateur orbital à 37°C, 1 x g, pendant 2 h pour élargir la culture bactérienne.
      REMARQUE : Les cultures de nuit sont préparées aux jours expérimentaux 0, 1 et 2 du modèle NEC.
  2. Répartir les chiots dans des groupes expérimentaux
    1. Le jour expérimental 1 à 07h00, peser les chiots du jour 4 postnatal.
      REMARQUE : La plage de poids optimale se situe entre 1,8 et 2,3 g, et les valeurs aberrantes doivent être éliminées de l’expérience.
    2. Regroupez les souris expérimentales en cohortes nourries au lait maternisé et nourries au lait maternisé et calculez le poids moyen des souris nourries au lait maternisé. Séparez les souris désignées nourries au lait maternisé du barrage et placez-les dans une nouvelle cage logée dans un incubateur pour nourrissons préchauffé à 37 °C. Gardez les chiots nourris par la mère dans la cage d’origine avec la mère.
      REMARQUE : Les souris néonatales sont particulièrement sensibles aux changements de température ambiante. Pour maintenir une régulation constante de la température après la séparation de la mère, les petits nourris au lait maternisé sont gardés dans un incubateur pour nourrissons à température contrôlée réglé à 37 °C. Cette approche est conforme aux protocoles NEC établis qui préservent la température physiologique sans avoir recours à des interventions thermiques supplémentaires 11,17,18,19.
    3. Répétez l’opération les jours expérimentaux 2 et 3, en pesant les souris nourries au lait maternisé et en calculant le poids moyen avant l’heure du repas quotidien de 07h00.
  3. Mesure de la densité optique (DO) de la culture bactérienne
    1. Après 2 h d’incubation à 37 °C et 1 x g, retirer les quatre flacons T75 avec culture expansée de l’agitateur orbital les jours expérimentaux 1, 2 et 3. Mélanger le contenu des quatre flacons T75, bien mélanger et pipeter 1 mL de la culture bactérienne dans une cuvette.
      1. Préparez une solution à blanc en ajoutant 1 mL de bouillon stérile LB dans une cuvette. Mesurer la densité optique de la culture bactérienne à 600 nm (OD600nm) avec un spectrophotomètre.
        REMARQUE : Le DO ciblede 600 nm est de 0,6 ± 0,02. Si la DOde 600 nm de la culture bactérienne est inférieure à la valeur cible, poursuivre l’incubation comme décrit à l’étape 1.3.1. jusqu’à ce que la DO ciblede 600 nm de 0,6 ± 0,02 soit atteinte. Si la DO600 nm est supérieure à 0,6, diluez la culture bactérienne avec un bouillon LB stérile.
    2. Transvaser 80 mL de la culture bactérienne dans deux tubes à centrifuger de 50 mL et centrifuger à 3000 x g pendant 10 min à 4 °C. Confirmez la réussite de la culture en vérifiant qu’il n’y a pas de pastille visible au fond de chaque tube.
  4. Préparation de la formule
    1. Commencez la préparation de la formule à 09h00 les jours expérimentaux 1, 2 et 3. Mélanger 16 ml de préparation pour nourrissons et 8 ml de lait pour chiots dans un rapport de 2:1 dans un tube à centrifuger stérile de 50 ml.
    2. Retirer le surnageant des deux tubes à centrifuger de 50 mL contenant la culture bactérienne en granulés (étape 1.3.2).
    3. Remettez complètement en suspension chacune des deux pastilles dans 2 ml du mélange de préparation et transférez la remise en suspension dans le mélange de préparation pour obtenir 24 ml de la formule NEC.
      REMARQUE : La concentration bactérienne finale dans la formule NEC doit être comprise entre 4 et 5 x 109 UFC/mL.
    4. Étiquetez six tubes à centrifuger de 50 ml pour chacun des six points d’alimentation (10h00, 13h00, 16h00, 19h00, 22h00, 07h00).
    5. Pipeter 4 ml de la formule NEC dans chaque tube étiqueté.
    6. Préparez six aliquotes à usage unique de LPS (5 mg/mL) et conservez-les dans des microtubes à faible liaison à -20 °C. Ajoutez du LPS (voir REMARQUE pour la concentration) à la formule NEC immédiatement avant l’alimentation à chaque point temporel.
      REMARQUE : La quantité de LPS ajoutée à la formule NEC est basée sur le poids corporel moyen des petits nourris au lait maternisé calculé à 07h00 chaque jour, en utilisant une dose de 5 μg de LPS par gramme de poids corporel des petits. La concentration finale de LPS varie avec le poids corporel. Par exemple, avec un volume d’alimentation de 80 μL et un poids moyen de cohorte de petits de 2 grammes, la concentration de LPS dans la formule serait de 0,125 mg/mL.
  5. Alimentation
    REMARQUE : Le jour expérimental 1, les souris à placer dans le modèle NEC sont à jeun pendant 3 heures après la séparation de leur mère. La première préparation NEC est à 10h00 et se poursuit toutes les 3 h jusqu’à 22h00. Les jours expérimentaux 2 et 3, les souris sont nourries à 07h00, 10h00, 13h00, 16h00, 19h00 et 22h00. Les souris ne sont pas nourries le jour expérimental 4.
    1. Immédiatement avant de nourrir les souris, décongeler et vortex une aliquote de LPS pendant 15 s. Ajouter la quantité appropriée de LPS en fonction du poids moyen des souris dans le tube de 4 mL préparé de la formule NEC (voir l’étape 1.4.6 pour le calcul) et bien mélanger par pipetage.
    2. Remplissez une seringue de 1 mL avec la formule ECN et fixez-y un cathéter central néonatal inséré par voie périphérique (CCIP). Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles ou d’air dans la seringue ou le CCIP.
    3. Administrer la formule NEC aux petits par gavage oral avec la ligne PICC.
      1. Retenez doucement chaque chiot par la peau lâche à la base de son cou et tenez la souris en position verticale. À l’aide d’une pince, guidez l’extrémité distale du CCIP dans l’oropharynx et l’œsophage, en positionnant l’extrémité du CCIP dans l’estomac.
        REMARQUE : La distance d’insertion de la ligne PICC est égale à la distance entre le coin de la bouche et le haut de la tache de lait dans l’estomac. Le point d’insertion optimal doit ensuite être clairement marqué sur la ligne PICC à l’aide d’un marqueur permanent.
      2. Si une résistance importante est ressentie lors de l’insertion de la ligne PICC, retirez la ligne PICC, repositionnez-la et retentez soigneusement l’insertion.
      3. Versez lentement 8 μL de préparation NEC dans l’estomac, en surveillant de près le petit tout au long de l’alimentation pour détecter des signes d’aspiration. Observez l’apparition d’une tache blanche de lait pour confirmer la réussite de l’accouchement gastrique.
      4. Retirez la ligne PICC. Observez le chiot pour toute respiration laborieuse ou vomissement. Si le chiot régurgite de la formule, épongez la bouche et le nez avec une lingette de laboratoire peu pelucheuse.
    4. Répétez ce processus à chaque moment de repas.
    5. Deux fois par jour, soumettez les chiots à l’hypoxie pendant 10 minutes immédiatement après les heures de repas de 13h00 et 19h00.
      1. Après deux repas par jour, placez les chiots dans une chambre d’hypoxie reliée à un réservoir de gaz contenant 95 % d’azote et 5 % d’oxygène. Ouvrez le robinet du réservoir et surveillez les niveaux d’oxygène à l’intérieur de la chambre d’hypoxie scellée à l’aide d’un moniteur portable. Une fois que la chambre d’hypoxie atteint 5 ± 0,5 % d’oxygène, maintenez les chiots à ce niveau d’oxygène pendant 10 min.
        REMARQUE : Le débit doit être optimisé pour diminuer de 20 % à 5 % d’oxygène à un taux constant et contrôlé sur une période de 2 minutes.
    6. Surveillez les bébés souris entre les repas pour détecter tout signe de détresse respiratoire, de décoloration pâle ou d’apnée. Si ces signes sont présents, retirez le chiot affecté de la chambre d’hypoxie, surveillez attentivement le rétablissement et, si nécessaire, euthanasiez les chiots conformément à la politique de l’IACUC.
    7. Poursuivre l’alimentation par gavage oral et l’exposition à l’hypoxie aux moments prévus pendant toute la durée de 72 h du modèle NEC.
      REMARQUE : Si le jour 1 expérimental commence le lundi à 10h00, le point final de 72 h se produira à 10h00 le jeudi. C’est le jour 4 du modèle. Les souris ne sont pas nourries à 07h00 le jour 4 du modèle, et sont euthanasiées à ce dernier point horaire de 10h00 pour le prélèvement de tissus.
  6. Euthanasie d’animaux et prélèvement de tissus
    1. Le matin du jour 4 du modèle, pesez et notez le sexe de chaque chiot, puis euthanasiez conformément aux directives de l’IACUC.
    2. Après l’euthanasie, prélevez le sang de chaque chiot dans un tube séparateur de sérum contenant un activateur de caillot et un gel.
    3. Centrifuger à 16 000 x g pendant 20 min à 4 °C pour séparer le sérum. Pipetez le sérum dans des tubes de 1,7 ml étiquetés et conservez-le à -80 °C.
    4. Faites une incision médiane de 1 à 2 cm à travers la paroi abdominale et le péritoine pour exposer le tractus gastro-intestinal. Inspectez l’intestin exposé pour détecter les caractéristiques caractéristiques de l’ECN, notamment la distension, l’érythème, l’accumulation de gaz dans la paroi intestinale (pneumatose intestinale) et les bulles d’air visibles.
    5. Identifiez et réséquez le duodénum par le rectum distal. Placez le mouchoir dans une boîte de Pétri sur de la glace. Utilisez une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) glacée pour rincer l’intestin.
    6. Identifiez le caecum et coupez-le en proximal pour séparer le caecum et le côlon de l’intestin grêle. Séparez les morceaux en commençant par l’iléon distal et en allant vers le jéjunum. Placez un morceau de 1 cm dans un tube contenant un tampon de lyse de l’ARN et des billes d’oxyde de zirconium de 1,5 mm sur de la glace pour l’analyse transcriptionnelle.
      1. Rincer un morceau de 1,5 cm à l’aide d’une seringue contenant du PBS attachée à une aiguille à bout émoussé de 24 g, puis le placer dans un tube de microcentrifugation contenant 1 ml de paraformaldéhyde à 4 % (PFA). Congelez un morceau d’intestin de 1 cm et conservez-le à -80 °C pour l’analyse des protéines. Congelez un morceau d’intestin de 1 cm et conservez-le à -80 °C pour tout dosage supplémentaire.
    7. Traiter les tissus collectés dans un tampon de lyse de l’ARN dans un batteur à billes (5,50 m/s, 1,0 min, cycle = 1,0, pause : 10 s, 4 °C) pour homogénéiser les tissus, puis les stocker à -80 °C.
  7. Fixation tissulaire
    1. Placer les morceaux de tissu collectés dans 4 % de PFA sur une bascule à 4 °C pour les fixer pendant 24 h. Après 24 h, retirez 4 % de PFA de chaque tube et remplacez-le par 1 mL de PBS pour laver le mouchoir. Remettez les tubes dans la bascule à 4 °C pendant 15 min. Répétez le lavage PBS une fois.
      1. Retirez le PBS et ajoutez 1 ml d’éthanol à 50 % dans chaque tube et remettez les tubes dans la bascule à 4 °C pendant 15 min. Retirez l’éthanol à 50 % et ajoutez 1 ml d’éthanol à 70 %, puis conservez-le à 4 °C jusqu’à ce que les tissus puissent être transformés en blocs d’histologie de paraffine.
        REMARQUE : Des segments intestinaux ou des échantillons de selles supplémentaires peuvent être prélevés au besoin pour une analyse plus approfondie.

2. Isolement des cellules immunitaires de la lamina propria

REMARQUE : Ce protocole est optimisé pour l’isolement des cellules de la lamina propria de souris néonatales à l’âge d’environ une semaine. Si des échantillons de référence sont nécessaires pour la cytométrie en flux spectral, des sevrages (semaines 3-4 postnatales) peuvent être utilisés. Pour les échantillons de sevrage, doubler tous les volumes de réactifs spécifiés dans le protocole.

  1. Préparation des réactifs
    1. Préparez 1 solution saline équilibrée de Hank sans Ca2+ et Mg2+ (HBSS W/O) contenant 10 mM d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinethanesulfonique (HEPES) et conservez-la à température ambiante.
    2. Préparez un tampon de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) en dissolvant 5 % d’albumine sérique bovine (BSA) dans du PBS + 5 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et conservez-le à 4 °C.
    3. La veille de l’isolement des cellules de la lamina propria, préparez la solution de prédigestion en ajoutant 5 mM d’EDTA, 5 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 1 mM de dithiothréitol (DTT) au HBSS W/O.
    4. Préparez la solution de digestion immédiatement avant d’effectuer l’isolement des cellules de la lamina propria en complétant le milieu Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI) avec 10 % de FBS et mg/mL de collagénase IV.
      REMARQUE : Les hbss sans OG peuvent être préparés à l’avance et conservés à température ambiante. Le tampon FACS doit être préparé à l’avance et stocké à 4 °C. Les solutions de prédigestion et de digestion doivent être préparées fraîches immédiatement avant d’effectuer l’isolement de la lamina propria et conservées sur de la glace.
  2. Collecte et préparation du tissu intestinal pour la digestion
    1. Localisez le cæcum et le transect proximal pour retirer le cæcum et le côlon. Excisez 2-3 cm de l’intestin grêle distal (iléon) et placez-le sur du HBSS sans fil glacé dans une boîte de Pétri (en reprenant l’étape 1.6.5).
    2. À l’aide d’une aiguille à bout émoussé de 24 G attachée à une seringue, rincer complètement la lumière intestinale avec du HBSS glacé W/O tout en stabilisant le tissu avec une pince. Confirmez visuellement que la lumière intestinale est exempte de selles après le rinçage.
    3. Retirez avec précaution tout tissu conjonctif restant du segment intestinal à l’aide d’une pince fine ou de ciseaux.
    4. Coupez l’intestin longitudinalement pour l’ouvrir, puis sectionnez-le transversalement en segments de 1 à 1 cm.
  3. Dissociation de la lamina propria
    1. Transférez les segments intestinaux dans un tube à centrifuger de 1 mL contenant 1 mL de solution de prédigestion refroidie sur de la glace.
    2. Incuber l’échantillon à 37 °C pendant 20 min avec une rotation continue pour faciliter la dissociation des tissus.
    3. Faites tourner doucement le tube, puis versez le contenu à travers une crépine de 10 μm placée sur un tube de centrifugation de 5 mL.
      REMARQUE : Le filtrat collecté à travers la crépine de 10 μm contient des lymphocytes intra-épithéliales (IEL) et peut être utilisé pour l’analyse en aval si vous le souhaitez.
    4. Transférez les fragments de tissu dans un nouveau tube à centrifuger de 15 mL contenant 10 mL de solution de digestion préchauffée à 37 °C. Ensuite, incubez l’échantillon pendant 40 min à 37 °C avec une rotation continue.
    5. Transférez l’ensemble de l’échantillon dans un tube de dissociation tissulaire automatisé et exécutez le programme de dissociation composé de quatre cycles de rotation de 15 s chacun, en alternant dans le sens des aiguilles d’une montre et dans le sens inverse des aiguilles d’une montre.
      REMARQUE : Une alternative à un dissociateur tissulaire automatisé consiste à broyer manuellement le tissu intestinal à l’aide des pointes givrées de deux lames de microscope. Si vous utilisez cette méthode, appliquez une pression douce et uniforme pour éviter un stress mécanique excessif, car cela peut réduire considérablement la viabilité cellulaire.
    6. Agiter doucement la suspension cellulaire, puis centrifuger les échantillons dans le tube de dissociation tissulaire à 300 × g pendant 5 min à 4 °C.
    7. Aspirez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille, puis remettez les cellules en suspension dans mL de tampon FACS glacé.
    8. Placez une crépine à cellules de 10 μm sur un tube à centrifuger de 5 mL. Transférez la suspension de cellule en suspension à travers le filtre, puis lavez le filtre avec un mL supplémentaire de tampon FACS glacé.
    9. Comptez les cellules et évaluez la viabilité à l’aide de bleu trypan ou d’un colorant de viabilité. Centrifuger le volume nécessaire à la cytométrie en flux à 30 × g pendant 5 min à 4 °C. Utilisez immédiatement les cellules pour les applications en aval afin de préserver la viabilité et l’expression des marqueurs.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le modèle murin néonatal d’ECN décrit dans ce protocole reproduit les principales caractéristiques de la maladie. L’analyse de survie de Kaplan-Meier (figure 1A) a révélé une réduction significative de la survie dans le groupe traité par ECN par rapport aux témoins nourris par des mères (9/21 contre 8/8 ; p = 0,0063). L’inspection grossière des intestins des souris soumises au modèle (Figure 1B) a mis en évidence des ca...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole intègre un modèle murin néonatal physiologiquement pertinent de NEC avec isolement des cellules immunitaires de la lamina propria, fournissant une plate-forme complète pour étudier les réponses immunitaires de la muqueuse pendant l’inflammation intestinale. En combinant des expositions cliniquement pertinentes, telles que le microbiome entérique des cas humains d’ECN, le stress hypoxique et l’alimentation au lait maternisé, ce modèle récapitule la pathogenèse complexe et mul...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts lié à ce manuscrit.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce manuscrit a été soutenu par R01DK124614, R01HD105301 DP1DK140012, la subvention de l’initiative Chan Zuckerberg numéro 2022-316749, le Yang Biomedical Scholar Award et le département de pédiatrie de l’Université de Caroline du Nord à Chapel Hill.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1 mL Syringe-Tuberculin Slip TipBecton Dickinson309659Seringue pour alimentation par formule
1.5 mL semi-micro Disposable CuvettesBRAND GMBH + CO KG759085D
1.7 ml Microtubes ClearAxygen - Corning Inc.MCT-175-CNonpryogenic & Rnase-/Dnase-free
5% Oxygen, Balance Nitrogen Certified Reference Material, Size 200 High Pressure Steel Cylinger, CGA 580AirgasX02NI95C2003186
Anti-Mo CD16/CD32 Purified Clone: 93eBioscience Inc. 14-0161-85
Anti-Mouse CD16/CD32 Purified Clone: 93eBioscience Inc. 14-0161-86
APC anti-mouse Ly-6C Clone: HK1.4 Isotype: Rat IgGcBioLegend128015
autoMACS Rinsing SolutionMiltenyi Biotec130-091-222
BB515 Rat Anti-CD11b Clone: M1/70BD Biosciences564455
BB700 Rat Anti-Mouse CD4 Clone: RM4-5BD Biosciences566408
BD Microtainer SSTBecton Dickinson365867Tube de sérum
BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p1200Fisher Scientific12-111-365
BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p20Fisher Scientific12-111-366
BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p200Fisher Scientific12-111-362
Brilliant Stain BufferBD Biosciences563795
BUV615 Rat Anti-Mouse Ly-6G Clone: 1A8BD Biosciences751263
BV650 Rat Anti-Mouse I-A/I-E Clone: M5/114.15.2BD Biosciences563415
C57BL/6J Neonatal MiceThe Jackson Laboratory000664
CD45-VioGreen mouseMiltenyi Biotec 130-102-412
CD64 Antibody, anti-mouse, PE-Vio 770, REAfinity Clone REA286Miltenyi Biotec 130-119-659
CFX Opus Real-Time PC Systems Bio-Rad12011319
Collagenase Type 4Worthington Biochemical Corporation LS004188
DL-dithiothreitol SigmaD9779-5g
eBioscience FOXP3/Transcription Factor Staining Buffer SetLife Technologies Corp. 00-5523-00
EDTA (0.5M), pH 8.0Quality Biological Inc351-027-721
Esbilac Puppy Milk ReplacerPet-Ag, Inc.99502-1Lait pour chiot
Fisherbrand Disposable CuvettesFisher Scientific14-955-127
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 10mLFisher Scientific13-678-11E
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 25mLFisher Scientific13-678-11
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 50mLFisher Scientific13-678-11F
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 5mLFisher Scientific13-678-11D
Genie Temp-Shaker 300USA Scientific, Inc.SI-G1600
gentleMACS Dissociator (protocol; m_intestine-01)Miltenyi Biotec 130-093-235
gentleMACS  C TubesMiltenyi Biotec 130096334
Ghost Dye Red 780 Viability DyeTonbo Biosciences13-0865-T100
Glycerol ReagentPlusSigma-AldrichG7757-500ML
GraphPad Prims Software, Version 10.0GraphPadN/A
Greiner Bio-One Round Bottom Polypropylene Culture Tube with Two-Position Vent StopperFisher Scientific07-000-212
Handi+ Oxygen analyzerMaxtecN/A
Hanks' Balanced Salt SolutionGibco141650-095
HEPES BufferMediatech, Inc. 25-060-CI
Hypoxia ChamberBillups-Rothenburg, Inc.N/A
ImageJSchneider et al., 2012N/A
Integra Miltex MeisterHand Iris Scissors, 10.2cmFisher Scientific12-460-655
Integra Miltex MeisterHand Iris Scissors, 9cmFisher Scientific12-460-598
Integra Miltex™ Swiss Jeweler-Style ForcepsFisher Scientific12-460-110
Isolette Infant IncubatorAir-Shields VickersC100-200-2 Series 02Incubateur pour souris
Kimtech Science Kimwipes Delicate Task WipesKimberly-Clark34120
LPSSigma-AldrichL3129-10mg
Luria Broth Broth, Miller Molecular Genetics PowderFisher ScientificBP1426-500
MACS BSA Stock SolutionMiltenyi Biotec 130-091-376
MACSmix Tube RotatorMiltenyi Biotec 130-090-753
Microcentrifuge TubesThermo Scientific34511.5 ml, clear, graduated, sterile
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermoFisher ScientificND-ONEC-W
Ohaus scout portable balanceFisher Scientific30253024
Paraformaldehyde

Références

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Inflammation intestinalecytom trie en fluxisolation de cellules immunitairesl sion pith lialedysbiose microbiennecellules immunitaires adaptatives

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